Łódź, 20.10.2009r.

LABORATORIUM Z TECHNOLOGII REMEDIACJI

Ćwiczenie nr.1

Skrining drobnoustrojów o różnorodnych uzdolnieniach enzymatycznych

Kierunek: Ochrona środowiska

Rok: IV

Grupa: I

Wtorek 10¹⁵-14

Małgorzata Pawluczuk

Justyna Arndt

1. Wstęp teoretyczny

Mikroorganizmy cechujące się zdolnością do wytwarzania określonych metabolitów (np. enzymów) poszukujemy stosując szereg kompleksowych zabiegów określanych jako skrining (z ang. screening). Źródłem poszukiwanych szczepów może być każde naturalne środowisko drobnoustrojów: gleba, woda, powietrze, owoce, ścieki przemysłowe.

Tradycyjną metodą izolacji bakterii jest wysiew odpowiedniego materiału na płytki agarowe, a następnie selekcja na podstawie kryteriów odpowiednio dobranych do kierunku poszukiwań. Wprowadzenie do pożywki odpowiednich składników (źródło węgla, azotu, energii, pH, itp.) stwarza określone warunki umożliwiające stymulację wzrostu żądanych mikroorganizmów przy jednoczesnym zahamowaniu wzrostu innych.

W celu dokonania oceny przydatności biotechnologicznej drobnoustrojów należy je, po wyizolowaniu i namnożeniu testować w postaci czystych kultur.

Zabiegi skriningowe mogą być usprawnione dzięki użyciu odpowiednich wskaźników lub substratów w podłożach powodujących powstawanie wokół kolonii barwnych stref, świadczących o aktywności metabolicznej badanych szczepów. Przykładowo szczepy wytwarzające enzymy amylolityczne można różnicować na podłożu z dodatkiem skrobi. Po zalaniu płytki roztworem jodu pojawiają się wokół kolonii jasne strefy na granatowym tle.

2. Wykonanie ćwiczenia

1. Izolowanie drobnoustrojów bytujących w glebie

• Materiał do szczepienia: próbki gleby

• Podłoża: podłoże bulionowe, podłoże Sabourand

• Odczynniki: jałowy roztwór soli fizjologicznej

Odważyliśmy 25 g próbki gleby i przenieśliśmy do 250 ml jałowej soli fizjologicznej (rozcieńczenie 10x). Następnie wytrząsaliśmy zawiesinę przez ok. 15 minut i pozostawiliśmy do opadnięcia większych cząstek.

Wykonaliśmy rozcieńczenia: 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 ml zawiesiny gleby przenieśliśmy do kolejnych probówek i uzupełniliśmy wodą destylowaną w ilości 9 ml.

Z rozcieńczenia 10^-6 pobraliśmy po 1 ml próbki na jedną płytkę z podłożem Sabourand (pleśnie, drożdże) oraz na dwie płytki z podłożem z bulionem (bakterie).

Płytki były inkubowane w temperaturze 28-30°C przez 7 dni. Po inkubacji policzyliśmy wyrosłe kolonie.

Podłoże	Ilość kolonii	Opis kolonii
Sabourand	4	Trzy kolonie o średnicy 3mm i jedna kolonia o średnicy 4mm, wszystkie barwy jasno-kremowej.
Bulion	3	Dwie kolonie białe i jedna barwy żółtej.
Bulion	2	Jedna kolonia barwy białej i jedna kolonia barwy żółtej, obie o średnicy 3mm.

Obliczenia:

Pleśnie o drożdże:

Bakterie:

1. Obserwacje makroskopowe posiewów na podłożach ze specyficznymi wskaźnikami

1. Proteolityczna aktywność bakterii Bacillus subtilis

• Materiał: Do hodowli tych bakterii zastosowaliśmy podłoże agarowe z mlekiem.

Obserwacje: Wokół kolonii wyrosłych na płytkach widoczne są rozjaśnienia. Wywołane są one proteolizą oraz świadczą o aktywności proteolitycznej badanych bakterii.

Z płytki przesialiśmy na skos agarowy z bulionem jedną z kolonii wykazującą aktywność proteolityczną.

Obserwacje: Na skosie wyrosła błyszcząca kolonia o kremowym zabarwieniu.

1. Amylolityczna aktywność bakterii Bacillus licheniformis

• Materiał: Do hodowli tych bakterii zastosowaliśmy podłoże z agarem skrobiowym.

Obserwacje: Zalaliśmy płytki płynem Lugola w celu określenia aktywności amylolitycznej badanych bakterii. Po upływie kilku minut zaobserwowaliśmy wokół kolonii strefy rozjaśnień na granatowym tle. Świadczą one o aktywności amylolitycznej bakterii Bacillus licheniformis.

Z płytki przesialiśmy na skos agarowy z bulionem jedną z kolonii wykazującą aktywność amylolityczną.

Obserwacje: Na skosie wyrosła matowa kolonia o zabarwieniu biało-kremowym.

1. Lipolityczna aktywność pleśni Mucor circinelloides

• Materiał: Do hodowli tych pleśni zastosowaliśmy podłoże agarowe z trimaślanem.

Obserwacje: Wokół kolonii wyrosłych na płytkach widoczne są rozjaśnienia czyli jasne strefy wokół kolonii, świadczące o rozkładzie substratu. Jednocześnie świadczy to o aktywności lipolitycznej badanej pleśni.

Z płytki przesialiśmy na skos agarowy z podłożem Sabourand jedną z kolonii (największą) wykazującą aktywność lipolityczną.

Obserwacje: Cały skos był porośnięty białą murawką.

5

---