1.Opisz mechanizm odpowiedzialny za możliwość łatwej identyfikacji kolonii bakteryjnych zawierających plazmidy rekombinowane w przypadku klonowania fragmentów DNA do wektorów z serii pUC.

Identyfikacja kolonii bakteryjnych zawierających plazmidy rekombinowane w przypadku klonowania fragmentów DNA do wektorów z serii pUC opiera się ona na porównaniu barwy otrzymanych kolonii. Kolonie rekombinowane są koloru białego. Kolonie nierekombinowane są niebieskie. Plazmidy z serii pUC posiadają N-końcową resztę genu B-galaktozydazy (LacZ). Miejsce rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych znajduje się w obrębie tego genu. Wklonowanie inseratu powoduje przerwanie ciągłości genu, przez go zawarty w podłożu substrat (X-gal) nie jest hydrolizowany - zmiana ramki odczytu. Dodatkowo plazmidy z serii pUC posiadają gen oporności na ampicylinę (amp), który jest dodatkowym markerem selekcyjnym. Wyrosną tylko te kolonie, które posiadają plazmid, ponieważ wyjściowe szczepy, przed transformacją, nie posiadały oporności na ten antybiotyk. Wyrosną tylko kolonie zawierające plazmid pUC. W przeciwieństwie do identyfikacji kolonii bakteryjnych zawierających wektory z serii pBR 322, ta identyfikacja jest jednoetapowa.

2.Wyjaśnij rolę plazmidu pLysS w systemie ekspresji Tabora-Studiera. Czy obecność tego plazmidu wywiera istotny wpływ na poziom ekspresji klonowanego genu? Odpowiedź uzasadnij.

Plazmid pLysS jest elementem uszczelniającym represję genu T7. (Represja - wyłączanie ekspresji genu lub grupy genów w odpowiedzi na bodziec chemiczny lub o innym pochodzeniu.). Na tym plazmidzie kodowany jest lizozym faga T7, który wiąże się do polimerazy RNA faga T7 i inaktywuje ją (uszczelnia układ - nie dochodzi do produkcji docelowego białka na plazmidzie pET).

Jest to potrzebne, ponieważ pojedyncze cząsteczki polimerazy RNA faga T7 mogą powstawać przed indukcją komórek E.coli IPTG, ale dzięki lizozymowi te cząsteczki polimerazy są inaktywowane.

Ekspresja genu lizozymu zachodzi w komórce na stałym, niskim poziomie, więc nie ma wpływu na poziom ekspresji genu docelowego po indukcji systemu przez IPTG, bo wtedy powstaje bardzo dużo polimerazy fagowej.

3. Wymień zalety i wady klonowania „na lepko” fragmentów DNA trawionych jednym enzymem restrykcyjnym do wektorów plazmidowych.

Zalety:

• Umożliwia to klonowanie niekierunkowe (nieokreślona orientacja insertu). Znajduje to zastosowanie w wektorach służących do namnażania insertu (pUC, pBR 322). Zwiększa się pula wklonowanych insertów.

• Obniżenie kosztów - stosowany jest tylko jeden enzym restrykcyjny.

Wady:

• Nie kierunkowe klonowanie w wektorach ekspresyjnych. Nie nastąpi ekspresja z insertu wklejonego w odwrotnej orientacji.

4. Opisz kolejne etapy cyklu reakcji PCR.

Reakcja PCR składa się z następujących etapów:

• Denaturacji wstępnej matrycy DNA

• Denaturacji matrycy DNA

• Przyłączania starterów do miejsca komplementarnego na matrycy

• Wydłużanie primera od końca 3'OH

• Wydłużanie końcowe.

Jeden cykl reakcji PCR obejmuje etapy: denaturacji, przyłączania starterów oraz ich wydłużania przez polimerazę DNA.

Pierwszy etap obejmuje denaturację termiczną dwuniciowej matrycy DNA do jednoniciowych łańcuchów. Zarówno czas i długość trwania tego etapu zależne są od zawartości par GC w matrycy wyjściowej. Im większy %GC tym wyższa temperatura i dłuższy czas jednakże średnio stosuje się 92-96^OC 3-5minut.

Przyłączanie starterów (anneling) to kluczowy etap reakcji PCR, gdyż tylko prawidłowe podłączenie starterów dobrze zaprojektowanych gwarantuje nam uzyskanie prawidłowego produktu. Wśród wielu czynników wpływających na ten proces najważniejszymi są temperatura, czas oraz stężenie matrycy i primera. W optymalnych warunkach, w początkowych cyklach stężenia matrycy podwaja się z każdym cyklem i w ten względne stężenie primerów zmniejsza się znacząco. Tak więc prawdopodobieństwo efektywnego przyłączania primerów w pierwszych cyklach jest determinowane głównie ilością kopii matrycy oraz czasem potrzebnym na efektywne przeszukiwanie genomu przez primer w celu odnalezienia sekwencji komplementarnej.w zbyt wysokiej temperaturze niemożliwe jest przyłączenie starterów, zaś w zbyt niskiej przyłączać się one mogą niekomplementarnie. Anneling zachodzić może w temperaturach 37-72^OC 20-40s.

Wydłużanie primerów poprzez efektywne dosyntetyzowywanie do końca 3'OH dNTP w temperaturze 72^OC (dla polimerazy Taq) przez 20s dla fragmentów krótszych niż 500bp i 40s dla fragmentów o długości 1,2kb. Reakcję tę przeprowadza termostabilna polimeraza DNA. Gdy spodziewane jest występowanie drugorzędowej struktury amplifikowanych produktów , wymagany jest dłuższy czas elongacji.

W analitycznej reakcji PCR liczba cykli nie większa niż 40 (optymalnie 25-30).

Zwykle po ostatnim cyklu przeprowadza się przez 5-15 min inkubacje w 72OC w celu dokończenia niekompletnych syntez i pełnej hybrydyzacji jednoniciowych komplementarnych produktów.

5.Wymień parametry od których zależy szybkość migracji DNA w żelu agarozowym.

Szybkość migracji DNA w żelu agarozowym zależy od:

• Masy cząsteczkowej DNA - cząsteczki linowe migrują w żelu z szybkością odwrotnie proporcjonalną do log₁₀ z ich masy cząsteczkowej.

• Stężenia agarozy - dany fragment DNA o określonej wielkości migruje z różną szybkością w żelu zawierającym różne stężenia agarozy. Im większe stężenie agarozy tym mniejsze powstają pory w żelu; taki żel nadaje się do rozdziału małych fragmentów DNA.

Im gęstszy żel tym wolniejsza migracja,ale należy pamiętać, że większe  cząsteczki lepiej jest rozdzielać w rzadszym żelu, mniejsze w gęstszym; standardowo stosuje się żele 1%.

• Konformacji DNA - plazmidowe DNA może występować w kilku formach: superzwiniętej (CCC); naciętej kolistej (OC); i liniowej (L). Kolejność migracji tych form w żelu:

• Natężenie pola elektrycznego - przy niskim natężeniu pola migracja fragmentów liniowych jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia. (Maksymalny rozdział fragmentów DNA uzyskuje się przy natężeniu pola 5V/cm.)

• Składu i siły jonowej buforu do elektroforezy - w roztworach o niskiej sile jonowej DNA migruje wolno. W roztworach o wysokiej sile jonowej może dojść do wydzielenia ciepła, upłynniania żelu i denaturacji DNA.

Ponad to szybkość migracji zależy od wielkości, kształtu i ładunku rozdzielanych cząsteczek.

6. Jakie warunki muszą być spełnione, aby komórki bakterii uległy transformacji??

TRANSFORMACJA - pobranie przez komórki bakteryjne DNA (nagiego, dwuniciowego, jednoniciowy lub zdenaturowany jest mało aktywny; plazmidowego ) z podłoża/pożywki.

Za transformację odpowiedzialne są :

1. sygnałowe sekwencje pobierania (ang. uptake-signal sequences) na chromosomie w wielu kopiach np.: u Haemophilus influenzae i Nesseria gonorrhoeae

2. obecność receptorów na powierzchni komórki np.: Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae;

Zdolność do transformacji nazywa się kompetencją.

Kompetencja może być:

1. konstytutywna (np. Nesseria gonorrhoeae)

2. indukowana:

- przez warunki wpływające hamująco na wzrost np. kompetencje wzmaga wysoki poziom cAMP

- warunki żywieniowe (np. Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae )

- gęstość populacji bakteryjnej tzw. Quorum sensing, czyli regulacja przez „wyczuwanie liczebności”

- u Streptococcus pneumoniae kompetencja jest także związana z procesem transbłonowego transportu wapnia

Wysoka wydajność naturalnej transformacji występuje tylko u kilku bakterii: Acinetobacter, Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Nesseria, Thermus

Wiele bakterii jest słabo transformowana dlatego można je wprowadzić w stan kompetencji poprzez:

- indukcje laboratoryjną (zastosowanie CaCl₂)

- elektroporację w polu elektrycznym - ok. 16kV/cm przez ułamek sekundy

- protoplastyzację komórek.

Wpływ na wydajność transformacji mają:

- podatności szczepów na transformację

- faza wzrostu drobnoustroju

- wielkość DNA (np.: plazmidu) (ok. 3 x 10⁵ - 10⁷ Da)

- stężenia DNA (zależność liniowa - zwiększenie stężenia powyżej dawki nasycającej nie powoduje wzrostu liczby transformantów)

- konformacja plazmidu (CCC)

- metoda nadająca kompetentność

- czas inkubacji DNA z komórkami kompetentnymi.

Proces transformacji:

Żeby przeprowadzić transformacie musimy dysponować komórkami kompetentnymi, które uzyskujemy poprzez umieszczenie osadu bakteryjnego (otrzymanego po zwirowaniu nocnej hodowli drobnoustrojow) w roztworze CaCl₂, który zwiększa przepuszczalność ściany komórkowej, co pozwala na wniknięcie DNA do komórki.

Po uzyskaniu komórek kompetentnych transformujemy je w mieszaninie ligacyjnej i przeprowadzamy szok cieplny. Polega on na inkubacji komórek w łaźni lodowej przez 45 minut, po czym następuje nagłe przeniesienie komórek do temperatury 42 ^oC na 90 sekund i ponowne umieszczenie w łaźni lodowej na 90 sekund. Stworzenie tak zmiennych warunków temperaturowych wpływa na przepuszczalność ściany komórkowej i ułatwia wprowadzenie DNA.

7.Wymień zalety i wady klonowania „na tępo” fragmentów DNA do wektorów plazmidowych?

Tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu.

Enzym SmaI rozpoznaje sekwencję: 5'CCCGGG3' i pozostawia tępe końce:

Zalety	Wady
W reakcji stosuje się tylko jeden enzym restrykcyjny	Wymagane duże stężenie DNA i ligazy
Możliwość wstawienia obcego DNA w dowolnej orientacji	Wysokie tło klonów nierekombinantowych
Występuje mniejsze ryzyko degradowania końców przez nukleazy	Występuje eliminowanie miejsc restrykcyjnych przy połączeniach plazmidu i obcego DNA
Używa się ich przy powielaniu wektorów	Reakcje ligacji przebiegają ze znacznie niższą wydajnością
Plazmidy rekombinantów mogą zawierać tandemowe kopie obcego DNA

8.Wymienić i krótko opisać właściwości wektorów plazmidowych stosowanych w systemie ekspresji Tabora-Studiera.

Wektory z serii pET (ang. plasmid for Expression by T7 RNA polymerase). Mają wklonowany promotor faga T7. Gen docelowy wklonowany pod kontrolą tego promotora jest eksprymowany w momencie pojawienia się w komórce polimerazy fagaT7 , której gen znajduje się na chromosomie gospodarza i jest pod kontrolą promotora lac ( ekspresja pod kontrolą tego promotora zachodzi po dodaniu IPTG); oznacza to, że ekspresja wklonowanego do tego wektora genu w ściśle określonym czasie

Wektor pLysS lub pLysE wprowadza się w celu usunięcia pojedynczych cząsteczek polimerazy RNA T7, pojawiających się przed indukcją ekspresji. Wektory te posiadają wklonowany gen, kodujący lizozym fagaT7, którego produkt bierze udział w degradacji cząsteczek polimerazy. Ekspresja lizozymu, która odbywa się na stałym poziomie, nie wpływa jednak na ekspresję genu docelowego, po indukcji systemu IPTG, ponieważ jego ekspresja ( lizozymu) zachodzi na niskim poziomie, a polimeraza fagowa jest po indukcji produkowana w dużych ilościach.

Lizozym T7 posiada ponadto zdolność hydrolizowania wiązań β-1,4-glikozydowych w peptydoglikanie ściany komórkowej bakterii, co ułatwia późniejszą lizę komórek i uwolnienie z nich żądanego produktu białkowego. Ponieważ cząsteczki lizozymu znajdują się wewnątrz komórek gospodarza i nie mogą przedostać się przez błonę komórkową do warstwy peptydoglikanu, liza komórek bakteryjnych zachodzi dopiero po naruszeniu struktury błony w początkowych etapach zabiegów prowadzących do izolacji białek

9.Jaki jest skład i funkcja poszczególnych elementów mieszaniny reakcyjnej stosowanej w reakcji PCR?

• Woda - środowisko reakcji

• Bufor - jego składniki zapewniają odpowiednie warunki do przebiegu reakcji PR

Tris-HCl (pH 8,8):stabilizuje środowisko na poziomie alkalicznym, gdyż w czasie trwania reakcji pH obniży się (uwalnia się jony H⁺)

KCl : zapewnia odpowiednią siłę jonową warunkującą aktywność enzymu polimerazy

Triton X-100 : zapobiega agregacji cząsteczek białka(enzymu), jest słabym detergentem niejonowym

• Jony Mg2⁺ - kofaktory polimerazy; stężenie magnezu wpływa na jej aktywność. Jony Mg2⁺ tworzą rozpuszczalne kompleksy z nukleotydami, zwiększają Tm dsDNA.

• Trójfosforany deoksynukleotydów - dNTP są elementami budulcowymi do syntezy nowego DNA; substratami dla reakcji PCR; dołączane w trakcie każdego cyklu, tworzą nowe kopie pożądanego fragmentu wyjściowej cząsteczki.

• Startery - krótkie oligonukleotydy specjalnie zaprojektowane, komplementarne do odpowiednich miejsc na matrycy DNA. Startery takie przyłączają się do matrycy w odpowiedniej temperaturze; końce 5` starterów ograniczają wielkość powstałych produktów.

• Termostabilna polimeraza DNA - wydłuża końce 3`OH starterów przyłączonych do matrycy, dodając komplementare dNTP.

• Matryca DNA lub RNA - w odpowiedniej temperaturze ulega denaturacji; wtedy mogą przyłączyć się startery i następuje dołączanie odpowiednich nukleotydów.

10. Jaki jest skład i funkcja roztworów stosowanych do nanoszenia DNA w studzienki żelu agarozowego przed elektroforezą.

SKŁAD

Do nanoszenia próbek DNA do studzienek żelu służą odpowiednie bufory zawierające 0,25 % błękit bromofenolowy oraz 40% sacharozę.

FUNKCJA

sacharoza - zwiększa gęstość próbek, zapewniając dobre umiejscowienie DNA w studzience bez dyfuzji; ma zatem na celu obciążenie nanoszonej próbki

błękit bromofenolowy - zabarwia próbkę powodując migrację barwnika w żelu w czasie elektroforezy, ułatwiając w ten sposób łatwe śledzenie prawidłowości rozdziału

11 patrz 8, 18

12.Wyjaśnij rolę IPTG dodawanego do pożywki hodowlanej w przypadku produkcji białek rekombinantowych w systemie ekspresji Tabora-Studiera

Ekspresja genów w systemie Tabora-Studiera

Obecnie jednym z najwydajniejszych systemów ekspresji w bakteriach jest układ Tabora-Studiera. Geny docelowe klonowane są do wektorów serii pET (ang. plasmid for Expression by T7 RNA polymerase) pod kontrolę silnego promotora ø10 faga T7, nie rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA. Transkrypcja, a następnie translacja genu rozpoczyna się w momencie pojawienia się w komórce polimerazy RNA faga T7, która selektywnie inicjuje transkrypcję z promotora ø10 faga T7. Gospodarz bakteryjny posiada wprowadzony do chromosomu gen kodujący polimerazę RNA faga T7 pod kontrolą promotora lacUV5, rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA. Transkrypcja z promotora lacUV5 jest indukowana przez IPTG. Pomiędzy promotorem, a genem kodującym polimerazę RNA T7 znajduje się sekwencja operatorowa, wiążąca białko represorowe blokujące inicjację transkrypcji. Dopiero po związaniu represora z IPTG, co prowadzi do utraty powinowactwa białka do miejsca operatorowego, może rozpocząć się transkrypcja genu polimerazy fagowej. Pojedyncze cząsteczki polimerazy RNA T7, które mogą powstać przed indukcją, są inaktywowane przez lizozym faga T7, którego gen jest wprowadzony do komórek bakteryjnego gospodarza wraz z plazmidem pLysS lub pLysE. Ekspresja genu lizozymu zachodzi w komórce na stałym, niskim poziomie, więc nie ma wpływu na poziom ekspresji genu docelowego po indukcji systemu przez IPTG, bo wtedy powstaje bardzo dużo polimerazy fagowej. Lizozym T7 posiada ponadto zdolność hydrolizowania wiązań β-1,4-glikozydowych w peptydoglikanie ściany komórkowej bakterii, co ułatwia późniejszą lizę komórek i uwolnienie z nich żądanego produktu białkowego. Ponieważ cząsteczki lizozymu znajdują się wewnątrz komórek gospodarza i nie mogą przedostać się przez błonę komórkową do warstwy peptydoglikanu, liza komórek bakteryjnych zachodzi dopiero po naruszeniu struktury błony w początkowych etapach zabiegów prowadzących do izolacji białek. Komórki gospodarza bakteryjnego posiadają ponadto zmutowane geny lon i ompT kodujące proteazy. Zabezpiecza to powstające białko przed degradacją w trakcie procesu oczyszczania. System Tabora-Studiera został skonstruowany głównie do wydajnej produkcji białek toksycznych dla komórek gospodarza E. coli BL21(DE3) pLysS. Dzięki temu ekspresja klonowanych genów zachodzi w ściśle określonym przez eksperymentatora czasie, po indukcji systemu przez IPTG. W początkowej fazie następuje namnożenie komórek w hodowli do odpowiedniej gęstości, a dopiero w następnym etapie indukuje się produkcję białek, które mogą spowodować śmierć komórek gospodarza. W przypadku, gdy produkt klonowanego genu nie jest toksyczny dla komórek bakterii, zwykle jego biosynteza spowalnia wzrost komórek i w efekcie końcowa wydajność produkcji jest niższa. Używając systemu ekspresji Tabora-Studiera eliminuje się ten problem. Dodatkowo, po namnożeniu hodowli można blokować ekspresję genów gospodarza przez dodanie do pożywki rifampicyny, antybiotyku, który selektywnie inaktywuje bakteryjną polimerazę RNA, a nie działa na fagową, co dodatkowo zwiększa poziom ekspresji klonowanego genu.

Schemat działania systemu Tabora-Studiera w komórkach E. coli BL21(DE3) pLys.

◊ Represja kataboliczna polega na dodaniu do pożywki hodowlanej 0,5-1% glukozy, która jest wykorzystywana preferencyjnie przez bakterie zamiast innych źródeł węgla tj. glicerol. Nie powstaje cAMP, którego wysokie stężenia indukuje promotor lac, zatem ogranicza to przedindukcyjną ekspresję białka.

13.Zalety i wady klonowania na lepko fragmentów DNA, trawionych dwoma różnymi enzymami restrykcyjnymi, do wektorów plazmidowych.

Zalety:

- możliwość wklonowania jednokierunkowego (DNA klonowane tylko w jednej orientacji w plazmidzie rekombinanta)

- niskie tło klonów nierekombinantów

- miejsca restrykcyjne są zwykle zachowane

- wydajność klonowania na lepko jest większa niż na tępo

Wady:

- konieczność prowadzenia trawienia sekwencyjnego (dwuetapowego) w przypadku stosowania enzymów wymagających różnych buforów reakcyjnych, trzeba przeprowadzić oczyszczanie po pierwszym etapie trawienia

- nie można klonować w ten sposób (na lepko) produktów PCR

14. Jaki jest skład i rola roztworów L2 i L3 stosowanych w procesie izolacji plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych?

L1- bufor do zawieszania komórek ; zawiera następujące składniki: TRIS (buforowanie środowiska reakcji), EDTA chelatuje jony dwuwartościowe np.Mg²+, co powoduje inaktywację nukleaz obecnych w komórce), Rnaza (usunięcie RNA).

L2- roztwór lizujący zawierający NaOH oraz SDS, denaturacja plazmidowego i chromosomowego DNA

L3-octan potasu, neutralizacja pH i reanturacja plazmidowego DNA, wytrącanie białek i DNA chromosomowego.

G- chlorowodrek guanidyny ułatwia wiązanie DNA do złoża krzemionkowego

15.Opisać metodę uzyskiwania komórek kompetentnych E.coli i wyjaśnić w jakim procesie są wykorzystywane

Komórki kompetentne Escherichia coli są wykorzystywane w procesie transformacji. Jest to proces polegający na wprowadzeniu do komórki bakteryjnej obcego DNA. Najczęściej wykorzystujemy niewielkie cząsteczki DNA zwane plazmidami, które pełnią rolę nośników (wektorów) służących do wprowadzenia do bakterii danego odcinka DNA.

1. zaszczepić hodowlę nocną z pojedynczej kolonii, hodować w temp. 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem

2. odmłodzić 1:50 w świeżej LB (2ml/100ml+100l antybiotyku), hodować z wytrząsaniem

3. odwirować przy 4000 rpm,4^oC/10 minut

4. zlać roztwór znad osadu. Osad podsuszyć

5. zawiesić osad w schłodzonym w lodzie 0,1M CaCl₂ (ok. 40-50 ml)

6. wstawić do lodu na 30 minut (może zostać na noc)

7. odwirować przy 400 rpm, 4^oC/10 minut

8. zlać roztwór znad osadu, podsuszyć osad, zawiesić w 1 ml schłodzonego w 1M CaCl₂

9. wstawić do lodu na 30 minut

10. 100 l kom. kompetentnych + 2l plazmidu (200l kom. + mieszanina ligacyjna)

11. wstawić do lodu na 30 minut

12. szok termiczny (42^oC przez 90 sekund, lód przez 2 minuty)

13. dodać 1ml LB

14. wytrząsać 45 minut - 1h /37^oC

15. wysiać na płytki z A/X i inkubować 37^oC/24h

16 patrz 12

17.Wyjaśnić zasady selekcji rekombinantowych plazmidów pochodnych plazmidu pUC19

Plazmid pUC19 posiada dwa markery selekcyjne, którymi odpowiednio są gen kodujący oporność na ampicylinę, oraz gen kodujący N - terminalną część enzymu -galaktozydazy. Pożądany gen wklonowany został w obrębie drugiego markera selekcyjnego, gdyż tam znajduje się multi cloning site (MCS), czyli miejsce wielokrotnego klonowania. Taki zabieg spowodował, że nie otrzymamy N - terminalnej części enzymu -galaktozydazy i w konsekwencji nie dojdzie do złożenia enzymu z jego C - terminalną częścią kodowaną na chromosomie komórek E. coli. Aby sprawdzić, czy komórki uległy transformacji należy je wysiać na podłożu LA zawierającym X-gal, IPTG oraz antybiotyk ampicylinę. Na podłożu przeżyją tylko komórki, które przyjęły plazmid zawierający gen oporności na ampicylinę. Komórki, które będą miały funkcjonalny gen kodujący  - galaktozydazę będą niebieskie na podłożu, ponieważ będą rozkładały X-gal. Natomiast te komórki, które będą posiadały plazmid pUC19 z wklonowanym do niego genem będą rosły na danym podłożu jako białe kolonie, ponieważ nie będą rozkładały X-galu.

18.Wyjaśnić zasady selekcji rekombinantowych plazmidów pochodnych plazmidu pBR322

Plazmid pBR322 posiada, podobnie jak plazmid pUC19, dwa markery selekcyjne. W tym przypadku są to dwa geny oporności na antybiotyki. Pierwszy to gen oporności na ampicylinę, drugi to gen oporności na tetracyklinę. Komórki E. coli transformowane plazmidem rekombinatowym pBR322X (X pożądany gen) na początku wysiewa się na podłoże LA z tetracykliną lub ampicyliną (zależy to w obrębie jakiego genu markerowego klonujemy). Te kolonie, które wyrosły na takim podłożu (np. z tetracykliną) na pewno mają gen oporności na tetracyklinę, ale nie wiemy czy posiadają wklonowany gen w obrębie genu kodującego oporność na ampicylinę. Można to sprawdzić przesiewając każdą z kolonii, które wyrosły na podłożu LA z tetracykliną na podłoża LA z tetracykliną i LA z ampicyliną na tak zwaną kreskę. Te kolonie, które wyrosną na podłożu LA z tetracykliną, ale nie wyrosną na podłożu LA z ampicyliną są koloniami komórek E. coli , o które nam chodzi (doszło do wklonowania genu w obrębie genu oporności na ampicylinę).

19. Proszę wyjaśnić definicję transformacji i w jaki sposób proces ten jest prowadzony dla komórek E. coli.

Transformaja jest procesem, w którym informacja genetyczna jest przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z komórek dawcy jest aktywnie pobierany przez komórki biorcy. Wysoką aktywność transformującą wykazuje DNA natywny, dwuniciowy. Jedno niciowy lub denaturowany DNA jest mało aktywny w transformacji. Wymiana odcinków DNA i replikacja prowadzi do powstania komórek transformantów o nowych właściwościach. Wydajność transformacji zależy od stężenia DNA i od kompetencji komórek biorcy. Stan kompetencji polega najprawdopodobniej na wytwarzaniu białkowego czynnika kompetencji. Ilość tego białka zmienia się w czasie wzrostu hodowli bakteryjnej. Dla uzyskania komórek kompetentnych E. coli stosuje się CaCl₂, zwiększający przepuszczalność ściany komórkowej dla egzogennego DNA. Wykorzystując tę metodę uzyskiwania komórek kompetentnych opracowano warunki dla transformacji komórek E. coli.

20. Proszę opisać metodę uzyskiwania komórek kompetentnych E.coli i wyjaśnić w jakim procesie są one używane.

W przypadku szczepów Escherichia coli stan kompetencji bakterii uzyskuje się na drodze indukcji chemicznej. Metoda wykorzystująca 0,1 M roztwór chlorku wapnia jest powszechnie stosowanym sposobem otrzymywania komórek kompetentnych. Bakterie traktowane są najpierw zimnym roztworem CaCl₂ zwiększającym przepuszczalność ściany komórkowej dla egzogennego DNA, po czym zostają szybko ogrzane (pobierają wówczas DNA plazmidowy z otoczenia).

Indukcja kompetencji metodą chemiczną

 Przygotowanie komórek  kompetentnych.

• Hodowlę nocną  szczepu E.coli odmładza się  w pożywce LB (1:50) przez wytrząsanie przez 2,5 - 3,0 godziny w 37˚C do uzyskania OD₆₀₀= 0,3 - 0,4.

• hodowlę odwirowuje się przez 10 minut przy 3000obr./min w temperaturze 4˚C.

• osad  zawiesza się w 20- 25 ml 100 mM CaCl₂ i inkubuje w łaźni wodnej 2-3 godzin.
  Zawiesinę bakterii osadza się przez wirowanie (3000obr./min, 4˚C).

• Uzyskany osad bakteryjny zawiesza się w 1 ml 100 mM CaCl_2.

Bezpośrednio po przygotowaniu, komórki kompetentne E coli są wykorzystywane do procesu TRANSFORMACJI.

Transformacja jest procesem, w którym informacja genetyczna w postaci DNA jest przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z komórek dawcy jest aktywnie pobierany przez komórki biorcy. Wymiana odcinków DNA i replikacja prowadzi do powstania komórek transformantów o nowych właściwościach.

Wydajność procesu transformacji zależy od:
- szczepu bakterii
- fazy wzrostu komórki
- metody nadającej kompetentność bakteriom
- ilości i wielkości DNA użytego do transformacji
- czasu inkubacji DNA z komórkami kompetentnymi

21. Opisać i zdefiniować rolę ligacji w uzyskiwaniu rekombinantów

Ligacja to proces łączenia fragmentów Dan in vitro. We wszystkich technikach łączenia bierze udział enzym - ligaza DNA. Katalizuje ona tworzenie wiązań fosfodwuestrowych pomiędzy nukleotydami w łańcuchu DNA. W technice rekombinowanie i klonowania DNA stosuje się ligazę uzyskiwaną z komórek E.coli zakażonych fagiem T4. Jest ona zależna od ATP i nie jest w stanie połączyć fragmentów DNA nie mających wolnych, jednoniciowych zakończeń.

Wyróżniamy następujące typy ligacji, gdzie:

• końce fragmentów obcego DNA są tępe

• końce fragmentów obcego DNA są lepkie różne, uzyskiwane przy pomocy różnych enzymów restrykcyjnych

• końce fragmentów obcego DNA są lepkie identyczne, uzyskiwane przy pomocy tych samych enzymów restrykcyjnych

Najpowszechniej stosowaną techniką łączenia obcego DNA z DNA wektora polega na przecięciu wektora tym samym enzymem restrykcyjnym, jaki użyty był pofragmentowania obcego DNA, a następnie potraktowaniu ligazą mieszaniny fragmentów DNA i liniowych cząsteczek wektora. Zachodzi wówczas nie tylko łączenie fragmentów obcego DNA z DNA wektora, ale również łączenie się ze sobą fragmentów DNA i łączenie lepkich końców wektora, co prowadzi do zamknięcia wektora bez integracji fragmentu obcego DNA. Można jednak temu zapobiec stosując alkaliczną fosfatazę. Fosfataza usuwa grupę fosforanową z końca 5' łańcucha DNA, uniemożliwiając zamknięcie się wektora.

22.Proszę opisać, jakie formy plazmidowego DNA obserwujemy po jego rozdziale w żelu agarozowym z dodatkiem EtBr.

- OC

L

CCC

+

23 patrz 14

24. Rola CaCl2 w transformacji komórek kompetentnych oraz bromku etydyny w elektroforezie DNA plazmidowego w żelu agarozowym

Bromek etydyny - jego cząsteczki wnikają - interkalują - do wnętrza DNA, pomiędzy pary zasad, dzięki temu cząsteczki DNA są widoczne w UV; nie związane z DNA cząsteczki bromku fluoryzują bardzo nieznacznie

CaCl₂ - zwiększa przepuszczalnośc błony komórkowej dla egzogennego DNA

genom E.coli

Komórka gospodarza

pET

gen kodujący lizozym

lizozym T7

pLysS

Inaktywacja

polimeraza RNA T7

DE3

gen T7

lac O

promotor lac

represor lacI

gen kodujący represor lacI

polimeraza RNA E.coli

Indukcja IPTG

represor lacI

gen kodujący represor lacI

lac O

promotor T7

polimeraza RNA T7

Indukcja IPTG

gen docelowy

---