Genom człowieka (na podstawie Genetyki medycznej pod redakcją G. Drewy i T. Ferenca)

Pod pojęciem genomu rozumiemy sumę wszystkich (zarówno kodujących jak i niekodujących)sekwencji DNA zawartych w 1n liczbie chromosomów.

W komórkach człowieka występuje również poza jądrowy materiał genetyczny w postaci mtDNA stanowiący odrębny genom tzw. genom mitochondrialny.

DNA genomu jądrowego człowieka liczy ok. 3 miliardy par zasad (3000 Mb), ma około 1m długości. Nasz najmniejszy chromosom - pary 21 zawiera 47 Mb, a największy - pary 1 zawiera 247 Mb. Stopień rozwoju ewolucyjnego danego organizmu nie koreluje jednak z ilością DNA w jego komórkach. Wielkość genomu ssaków odpowiada w przybliżeniu wielkości genomu Protozoa.

Ok. 30% genomu jądrowego Homo sapiens stanowią sekwencje ulegające transkrypcji i sekwencje związane z genami (eksony, introny, pseudogeny, ,sekwencje początkowe i końcowe genów, sekwencje regulatorowe)zaś pozostałą część stanowi pozagenowy DNA obejmujący sekwencje repetytywne (powtórzone) oraz unikatowe.

Transpozony, należące do powtórzeń rozproszonych w genomie, to fragmenty DNA mające zdolność do przemieszczania się w obrębie genomu. Zjawisko transpozycji DNA występuje dość powszechnie w ludzkim genomie, lecz zazwyczaj nie obejmuje sekwencji kodujących.

W powtórzeniach tandemowych występują geny (rDNA) kodujące rRNA (ok. 450 kopii)oraz geny kodujące białka histonowe (ok. 30-40 kopii). Do sekwencji tandemowych o wielkiej liczbie powtórzeń należy DNA satelitarny.

Genom człowieka, jest mozaiką izochor czyli długich, liczących ponad 300 000 par zasad regionów DNA o homogennym składzie zasad azotowych. Poszczególne rodziny izochor różnią się sumą i zawartością par zasad G-C i C-G (G+C) oraz gęstością.

Zawartość zasad G+C w genomie jest miarą gęstości genów:

Rodzina izochor	Procentowy udział danej rodziny izochor w genomie człowieka	Zawartość genów w danej rodzinie izochor
H3 Izochory ciężkie, bardzo bogate w G+C tzw.„rdzeniem genomu”	ok. 3-4%	ok.76%
H1 i H2 Izochory ciężkie, bogate w zasady G+C	ok. 31%	ok.20%
L1 i L2 Izochory „lekkie”, ubogie w zasady G+C	ok. 62%	ok.4%

Istnieją różnice w zawartości poszczególnych rodzin izochor w prążkach chromosomalnych.

Wykazano, że to właśnie w prążkach T znajduje się ok. 46-58% wszystkich genów człowieka. Prążki T zbudowane przeważnie z rodzin izochor H2 i H3,w obrębie których struktura chromatyny jest „otwarta'' i charakteryzuje się łatwym dostępem deoksyrybonukleaz (DNA-z), ze względu na niedobór lub brak histonu H1, acetylację histonu H3 i H4 oraz większy odstęp między nukleosomami. Prążki T stanowią więc tę część genomu, która wykazuje najwyższą aktywność transkrypcyjną i rekombinacyjną.

Techniki badania genomu i ich zastosowanie praktyczne

1. PCR- reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - metoda powielania łańcuchów DNA wynaleziona przez Kary'ego Mullisa w 1983 (dziesięć lat później otrzymał za to Nagrodę Nobla).

PCR stosuje się np. w badaniach nad ekspresją genów, w diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, badaniu śladów z miejsca zbrodni, paleontologii.

Podstawowymi substratami reakcji PCR są: matrycowy DNA (fragment, który chcemy powielić), mieszanka nukleotydów, startery (primery) komplementarne do fragmentów matrycy, znajdujących się na obu końcach interesującego nas fragmentu DNA oraz termostabilna polimerazę DNA.

Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów tj.:

1. Denaturacja - rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA w temp. około 95 °C. /15 sekund.

2. Annealing - etap hybrydyzacji odcinków starterowych, zachodzi w temp. pomiędzy 45-60 °C (określonej dla danej pary starterów). Roztwory primerów dodawane są w dużym nadmiarze w stosunku do matrycy, aby zminimalizować prawdopodobieństwo, że zamiast hybryd starter-matryca utworzą się hybrydy połączonych ze sobą dwóch nici matrycy.

3. Elongacja - właściwa synteza DNA czyli amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 °C powoduje utworzenie kompleksu matryca, startery, polimeraza DNA, co rozpoczyna syntezę nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund.

Cykl powtarza się, zaś w kolejnych cyklach jako matryca mogą służyć wszystkie zsyntetyzowane dotychczas cząsteczki DNA. Dlatego dopóki nie zabraknie substratów reakcji zachodzi ona coraz szybciej, powodując coraz większy przyrost ilości powielanych fragmentów DNA. Metoda PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie ilości amplifikowanego łańcucha DNA.

2. W genomie człowieka i innych Eukaryota występują tzw. minisatelity czyli niewielkie fragmenty sekwencji satelitarnych o małej liczbie powtórzeń jednostki podstawowej. Minisatelity zawierają powtórzenia tandemowe złożone z 9-80 pz. Ich duża zmienność wynika z różnej liczby powtórzeń danego motywu w określonym locus. Zmienność ta, została określona, jako VNTR (Variable Number Tandem Repeats) czyli polimorfizm liczb tandemowych powtórzeń. Techniki hybrydyzacyjne pozwalają na uzyskanie tzw. „genetycznego odcisku palca”, poprzez analizę kilku takich loci danego osobnika. Ten unikatowy obraz wykorzystuje się m.in. w kryminalistyce do identyfikacji sprawcy przestępstwa lub identyfikacji zwłok, jak również przy ustalaniu ojcostwa.

3. W przypadku silnie zdegradowanego DNA (należy pamiętać, ze degradacja biomolekuł rozpoczyna się wkrótce po powstaniu śladu biologicznego) jedyną metodą umożliwiającą identyfikację śladów biologicznych jest analiza mtDNA. Jako wzorcową stosuje się zweryfikowaną referencyjną sekwencję z Cambridge =rCRS. Analizy mtDNA wykorzystuje się m.in. do analizy starych szczątków ludzkich, analizy pojedynczych włosów pozbawionych cebulki włosowej, do identyfikacji ofiar masowych katastrof (określenie pokrewieństwa w linii żeńskiej). Na podstawie analizy mtDNA można także określić geograficzne pochodzenie badanej próbki, gdyż mtDNA wykazuje wyraźne zróżnicowanie w populacjach pochodzących z różnych kontynentów.

Dziedziczenia dysfunkcji mitochondriów

*Mutacje w mitochondrialnym DNA są odpowiedzialne za wystąpienie wielu chorób dziedziczących się po linii matczynej, m.in.

1. zespołuKearnsa-Sayre'a -KSS(oftalmoplegia, zwyrodnienie barwnikowe siatkówki, kardiomiopatia),

2. dziedzicznej neuropatii nerwu wzrokowego - LHON (zespół Lebera)

3. encefalomiopatii, kwasicy mleczanowej z objawami udaropodobnymi -MELAS.

Choroby związane z dysfunkcją mitochondriów mogą być również powodowane przez mutacje w genach jądrowych kodujących białka mitochondrialne. Do tego typu chorób należy zespół Leigha czyli podostra dziecięca encefalopatia martwicza(MILS), u podłoża którego leży upośledzenie funkcji wielu enzymów łańcucha oddechowego. MILS dziedziczy się w linii matczynej w sposób sprzężony z chromosomem X lub w sposób autosomalny recesywny.

Wskazania do skierowania do poradni genetycznej

1. Osoby z rozpoznaniem lub podejrzeniem chorób genetycznie uwarunkowanych,

2. Wady rozwojowe izolowane oraz zespoły wad rozwojowych,

3. Niepełnosprawność intelektualna,

4. Niepowodzenia rozrodu (brak ciąży, 2 poronienia samoistne, poród martwy),

5. Ekspozycja na mutageny i teratogenny,

6. Małżeństwa między osobami spokrewnionymi (tzw. krewniacze; poradnictwo w celu wykrycia zagrożenia wystąpieniem chorób autosomalnych recesywnych u potomstwa),

7. Wiek ciężarnej powyżej 35 roku życia (podwyższone ryzyko wystąpienia aberracji liczbowej chromosomów u potomstwa).

Diagnostyka w przypadku chorób genetycznych

1. Przyjęcie wstępnego rozpoznania na podstawie oceny fenotypu, z zastosowaniem obowiązujących kryteriów klinicznych, morfologicznych i behawioralnych (tzw. diagnoza fenotypowa),

2. Wywiad rodzinny i analiza rodowodu,

3. Weryfikacja rozpoznania za pomocą testów genetycznych (rodzaj testu powinien być dostosowany do specyfiki schorzenia, wymagana jest pisemnie poświadczona, świadoma zgoda osoby badanej lub jej przedstawiciela ustawowego).

Profilaktyka w chorobach dziedzicznych

1. Profilaktyka pierwotna- ten typ profilaktyki polega na identyfikacji i eliminacji potencjalnie szkodliwych czynników środowiskowych w celu ochrony pacjentów z predyspozycją genetyczną do wad o etiologii wieloczynnikowej tj. np. rozszczep wargi i podniebienia, zwężenie odźwiernika czy wady cewy nerwowej. Obejmuje działania mające na celu zapobieganie pojawieniu się nieprawidłowego fenotypu np. poprzez suplementację diety kwasem foliowym w okresie prekoncepcyjnym i w pierwszym trymestrze ciąży, aby zmniejszyć ryzyko wystąpienia wady cewy nerwowej u płodu (nie ma tego typu profilaktyki w stosunku do wad wrodzonych o etiologii monogenowej i spowodowanych aberracjami chromosomowymi gdyż są one zwykle spowodowane nowymi mutacjami).

Profilaktyka pierwotna obejmuje również ochronę płodu przed infekcjami wewnątrzmacicznymi (będących jedną z przyczyn wad rozwojowych) oraz profilaktyke wad u płodu w związku z przewlekłą chorobą matki (tj. m.in. cukrzyca, padaczka, fenyloketonuria).

2. Profilaktyka wtórna- stosowana w przypadku rodzin ryzyka genetycznego, tzn. takich w których urodziło się dziecko z wadami uwarunkowanymi genetycznie. Obejmuje np. badania prenatalne, badania przesiewowe noworodków.

Klonowanie

Klonem określamy identyczne pod względem genetycznym organizmy lub komórki powstałe z jednego osobnika drogą rozmnażania bezpłciowego.

Klonowanie metodą transplantacji jader

1. Enukleacja czyli usunięcie materiału genetycznego z oocytu (najczęściej w stadium II metafazy) i zastąpienie go jądrem komórkowym (w fazie G0 lub G1) pochodzącym z:

1. pierwotnych komórek zarodkowych tj. blastomery, komórki węzła zarodkowego lub trofoektodermy (tzw. klonowanie zarodkowe)

2. komórek somatycznych tj. (tzw. klonowanie somatyczne)

2. Zaktywizowanie zmodyfikowanych komórek -biorcy (jako bodźca używa się m.in. impulsów prądu stałego, 7% etanolu, jonów strontu, trójfosforanu inozytolu).

3. Transfer zarodka w stadium moruli lub blastuli do macicy samicy-biorczyni.

Organizmy transgeniczne

Organizmy transgeniczne (GMO) są organizmami trwale wzbogaconymi o obce DNA dzięki zastosowaniu technik inżynierii genetycznej. Wprowadzony do komórek biorcy transgen zostaje trwale zintegrowany z genomem biorcy i jest przekazywany komórkom potomnym. W przypadku gdy jedynie część komórek zostanie zmodyfikowana poprzez wprowadzenie trans genu powstanie organizm, którego komórki zawierają dwa lub więcej typów genomów (tzw. chimera).

Techniki uzyskiwania zwierząt transgenicznych:

Mikroiniekcja do przedjądrzy

-Wywołanie hiperowulacji i zapłodnienie samicy dawczyni

- Pobranie zapłodnionych komórek jajowych z jajowodów samicy dawczyni (po ok. 24 h)

- Mikroiniekcja transgenu (ok. 1000 kopii) do jednego z przedjądrzy (najczęściej męskiego bo jest większe i znajduje się bliżej błony komórkowej)

- Umieszczenie zygoty w płynie hodowlanym (dalsze podziały)

-Przeniesienie zarodka (w stadium 2-4 blastomerów) do macicy samicy-biorczyni.

Wydajność transgenezy jest stosunkowo niewielka i zależy również od gatunku zwierzęcia (0,5%dla bydła i 20% dla myszy). Przypadkowe jest zarówno miejsce integracji trans genu jak i liczba kopii wprowadzonego genu ulegajaca integracji.

---