Genetyka drobnoustrojów

Autor: Andrzej K. Bednarek

Genetyka drobnoustrojów

Spis treści

Część ćwiczeniowa

1. Koniugacja

2. Transformacja

3. Trandsukcja

4. Mutageneza

Genetyka bakterii – materiał do ćwiczeń

Ćwiczenie 1. Koniugacja bakterii

Koniugacja bakterii to proces płciowy, umożliwiający wymianę i rekombinację materiału genetycznego. Warunkiem wystąpienia koniugacji jest obecność w komórce bakterii czynnika płciowego F (fertility factor) w postaci plazmidu. Koniugacja zachodzi pomiędzy bakteriami posiadającymi plazmid F, bakterie takie oznacza się jako F+ i bakteriami nie posiadającymi tego czynnika płciowego, oznaczanymi jako F-. Replikacja czynnika płciowego jest niezależna od replikacji podstawowego genomu bakteryjnego. Plazmid F może występować w komórkach bakterii w trzech formach, jako:

• całkowicie samodzielna jednostka replikacji, oznaczany jest wtedy symbolem F+, zawiera on około 100 genów;

• plazmid posiadający fragment zawierający jeden lub kilka genów z podstawowego genomu, powstający podczas niedokładnego wyłączenia z chromosomu bakteryjnego, oznaczany symbolem F’;

• plazmid zintegrowany w specyficznej lokalizacji z genomem podstawowym; oznaczany symbolem Hfr (high frequency of recombination). Jeśli dany plazmid posiada możliwość czasowego integrowania z genomem podstawowym nazywamy go episomem.

Po raz pierwszy przeniesienie czynnika F pomiędzy komórkami Eschericha coli opisali Joshua Lederberg i Edward Tatum w 1946 roku. Komórki zawierające czynnik F posiadają na swojej powierzchni długie białkowe twory nazywane pili. Zazwyczaj komórka bakterii posiada na powierzchni nie więcej niż trzy takie pili. Geny wymagane do produkcji pili znajdują się na czynniku F i jest ich około 20. Jeden pilus integruje z kilkoma białkami na komórce biorcy, co umożliwia otwarcie kanału dla transferu materiału genetycznego. Pilus zbudowany jest z białka piliny. Pilus może być całkiem długi i może kilkakrotnie przekraczać długość komórki E. coli.

Proces koniugacji możemy podzielić na cztery przedziały: wytworzenie pary koniugacyjnej; replikacja koniugacyjna; transfer DNA; dojrzewanie.

Wytworzenie pary koniugacyjnej

W momencie kontaktu z komórką biorcy pilus depolimeryzuje u podstawy i komórki zbliżają się do siebie i powstaje pomiędzy nimi kanał. Kiedy komórki są już wystarczająco blisko rozpoczyna się koniugacyjna replikacja DNA. Powstaje wtedy jednoniciowa liniowa kopia DNA, która przechodzi do komórki biorcy. Miejsce inicjacji replikacji koniugacyjnej (origin) znajduje się na czynniku F, dlatego pomiędzy koniugującymi bakteriami F+ i F- przenoszony jest tylko on. Kiedy czynnik F znajdzie się w komórce biorcy zachodzi synteza drugiej nici i cyrkularyzacja plazmidu. Następuje rozdzielenie komórek i już obydwie posiadają plazmidy F.

Zdarza się, że komórki bakterii mogą tracić czynnik F i ulegają rewersji do F-. Dzieje się tak dlatego, że replikacja plazmidu jest niezależna od replikacji genomu bakteryjnego i w trakcie podziału komórki może nie dojść do powielenia F lub nie trafia on do jednej z komórek potomnych.

Czynnik F ma zdolność integracji do genomu bakterii, a następnie może się z niego z powrotem odłączać. Liczba miejsc integracji jest ograniczona i charakteryzują się one homologią sekwencji DNA pomiędzy F a genomem.Po właczeniu plazmidu F do chromosomu bakteryjnego powstaje komórka Hfr. Przy podziale komórki bakteryjnej czynnik F zintegrowany z genomem podlega replikacji genomowej. Jednakże połączenie komórki Hfr z komórką F- poprzez pilus powoduje uruchomienie replikacji koniugacyjnej, która rozpoczyna się od origin na czynniku F. Powstaje jednoniciowa kopia całego genomu, która może być przeniesiona do komórki biorcy. Wraz z czynnikiem F przenoszone są również geny dawcy, które mogą rekombinować z genomem biorcy. W ten sposób komórka biorcy uzyskuje nowe cechy.

Zintegrowany czynnik F może wyłączyć się z genomu wraz z sąsiadującymi genami (nazywamy go wtedy F’), które w procesie koniugacji zostaną również przeniesione do komórek biorcy. Integracja czynnika F do genomu jest stosunkowo częsta i wynosi 10-5 na komórkę na generację.

Tradycyjna mapa genomu Escherichia coli przedstawiona jest w postaci kolistej, a za jednostki przyjmuje się minuty. Poniższa mapa przedstawia genom E. coli z widocznymi miejscami integracji czynnika F (Hfr; P; KL; B; PK itp.). Można łatwo zauważyć, że czynnik F integruje nie tylko w różnych miejscach genomu, ale także w przeciwnych kierunkach.

Minutowa podziałka mapy genomu E. coli związana jest bezpośrednio z procesem koniugacyjnej replikacji i przenoszeniem genomu do komórki biorcy. Kompletna replikacja wymaga około 100 minut i tyle trwa też transfer liniowego, jednonicowego DNA. Czas 0 oznacza lokalizację genomowego origin. Jeżeli w określonym czasie będziemy przerywać proces koniugacji, na przykład poprzez intensywne wytrząsanie przerywające połączenia pomiędzy komórkami, to zauważymy, że nie wszystkie geny uległy przeniesieniu. Zanim metody biologii molekularnej umożliwiły dokładne poznanie genomu bakterii, koniugacja pozwalała na ustalenie lokalizacji genów nachromosomie. W tym celu jako biorcy możemy użyć bakterii auksotroficznych, takich których wzrost uzależniony jest od obecności w środowisku określonego metabolitu (aminokwas, witamina, zasada purynowa). Jako dawca może nam posłużyć szczep Hfr niezależny od tych metabolitów. Prowadzimy koniugacje pomiędzy Hfr z różnymi miejscami integracji a F-, które przerywamy po upływie określonego czasu. W ten sposób jesteśmy w stanie określić odległość (w minutach) pomiędzy operonami zawierającymi geny syntezy określonych aminokwasów lub innych metabolitów i ich wzajemną lokalizację wobec punktu 0. Przy takim mapowaniu konieczna jest odpowiednia selekcja rekombinantów. Używa się tutaj odpowiednich podłoży hodowlanych nie zawierających metabolitów, od których uzależnione są komórki biorcy. Czynnikiem selekcyjnym, eliminującym wzrost dawcy może być antybiotyk, na który biorca posiada oporność.

W naszym eksperymencie koniugacyjnym biorcą będzie szczep z defektami metabolicznymi, ale zawierający gen oporności na streptomycynę. Dawcami będą dwa szczepy Hfr Escherichia coli K12, wrażliwe na streptomycynę, z odległymi od siebie i zwróconymi w przeciwnych kierunkach miejscami integracji plazmidu F.

Szczep biorcy

AB1157 F-(DSM 9036)thr-1 ara-14 leuB6 Delta(gpt-proA)62 lacY1 tsx-33 qsr- supE44galK2 lambda- rac- hisG4(Oc) rfbD1 mgl-51 rpsL31(strR) kdgK51 xyl-5 mtl-1 argE3(Oc) thi-1

Szczep dawcy 1

DSM 423 Hfr H61 thr strS

Szczep dawcy 2

DSM 8226 Hfr D MetB strS

Jak widzimy, szczep biorcy posiada wiele defektów metabolicznych. W naszym eksperymencie będziemy sprawdzać przeniesienie genów odpowiedzialnych za syntezę proliny, leucyny oraz metabolizm galaktozy. W tym celu musimy przygotować odpowiednie podłoża do hodowli bakterii. Będziemy używać podłoża minimalnego Davisa uzupełnionego odpowiednimi metabolitami. Brak metabolitu niezbędnego dla biorcy spowoduje, że na płytkach pojawią się jedynie kolonie rekombinantów pokoniugacyjnych, ponieważ wzrost kolonii dawcy zostanie zahamowany dodatkiem antybiotyku (streptomycyny). Szczep biorcy posiada więcej defektów metabolicznych niż badamy, podłoże minimalne musi być dodatkowo uzupełnione o histydynę, treoninę, glutaminę i tiaminę.

Schemat przygotowania specyficznych podłoży do badania odpowiednich fenotypów przedstawia poniższa tabela.

nazwa	glukoza	galaktoza	prolina	leucyna
Bez proliny (P)	+	-	-	+
Bez leucyny (L)	+	-	+	-
Bez aspartamu (A)	+	-	+	+
Z galaktozą (G)	-	+	+	+

Glukozę i galaktozę dodajemy do podłoża w ilości 5 g/l; tiaminę 2-5 μg/l; aminokwasy 50 μg/ml; antybiotyk selekcyjny - streptomycynę 100 μg/ml.

Koniugację będziemy przerywać po 0, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40 minutach i natychmiast wysiewać bakterie na płytki selekcyjne.

Wykonanie eksperymentu:

Jedna grupa prowadzą koniugację wykorzystując szczep DSM 423 Hfr H61, druga DSM 8226 Hfr D. Wszyscy muszą być odpowiednio przygotowani i dokładnie zapoznać się ze schematem eksperymentu. W eksperymencie tym bardzo istotne jest przestrzeganie odpowiednich przedziałów czasowych. Dlatego wszystkie niezbędne materiały i płytki muszą być przygotowane zanim rozpoczniemy koniugację.

Dzień 1.

1. Przenieść 1 ml hodowli biorcy (AB1157 F-= DSM 9036) znajdującej się w logarytmicznej fazie wzrostu do kolby 250 ml;

2. Dodać 50 μl hodowli szczepu dawcy Hfr (odpowiednio Hfr H61 lub Hfr D);

3. Inkubować przez 4 minuty w temperaturze 37°C;

4. Delikatnie dodać 9 ml medium LB, delikatnie wymieszać;

5. Natychmiast pobrać 0,5 ml mieszaniny koniugacyjnej do probówki i energiczne wytrzasnąć przez 10 sekund ( czyli czas 0)

6. Przenieść po 25 μl do probówek zawierających 7 ml top-agar, delikatnie wymieszać i wylać na płytki z medium selekcyjnym;

7. W odpowiednich przedziałach czasowych (6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40 minut) pobierać próbki mieszaniny koniugacyjnej i wysiewać jak powyżej na medium selekcyjne;

8. Płytki pozostawiamy w temperaturze pokojowej.

Uwaga: czasami trudno jest pobrać próbkę i wysiać na płytki selekcyjne w odpowiednim czasie. Aby uniknąć błędów, lepiej jest notować rzeczywiste czasy pobrania mieszaniny koniugacyjnej, niż popełnić błąd próbując dostosować się do czasów zaprojektowanych w eksperymencie.

Dzień 2.

1. Zliczyć kolonie bakterii, które wyrosły na poszczególnych mediach selekcyjnych i zapisać wyniki w odpowiedniej tabeli;

2. Zebrać wyniki dla wszystkich eksperymentów, obliczyć średnią liczbę kolonii i sporządzić wykresy zależności liczby kolonii od czasu koniugacji; oś x – czas koniugacji od 0 do 50 minut, oś y – średnia liczba kolonii;

3.Na podstawie uzyskanych danych narysować mapę genomu E. coli zawierającą geny kodujące badane cechy fenotypowe, mapa w postaci liniowej od 0 do 100 minut (miejsca integracji szczepów dawcy: Hfr H – minuta 85; Hfr D – minuta 12).

Ćwiczenie 2. Transformacja

Transformacja to przyjęcie przez komórkę bakteryjną cząsteczki DNA i włączenie jej poprzez rekombinację do bakteryjnego chromosomu. W transformacji naturalnej DNA pochodzi z komórki bakterii dawcy, praktycznie każda część genomu może zostać pobrana przez komórkę biorcy. Naturalna transformacja jest gatunkowo specyficzna lub ograniczona do bakterii blisko spokrewnionych, ponieważ rekombinacja wymaga homologicznych odcinków DNA.

W trakcie śmierci komórki bakteryjnej (lizy) DNA uwalniane jest do środowiska. Wtedy fragmenty kwasu nukleinowego mogą zostać pobrane przez bakterie kompetentne tj. posiadające zdolność transformacji. W przypadku niektórych gatunków bakterii transformacja jest ustalonym i ważnym mechanizmem wymiany informacji genetycznej.

W trakcie eksperymentów w laboratorium przeprowadzimy transformację u bakterii Bacillus subtilis. Komórki dawcy to szczep dziki (Bacillus subtilis DSM 10), szczep biorcy (Bacillus subtilis DSM 9565) jest mutantem, auksotrofem, który nie posiada zdolności syntezy trzech aminokwasów: lizyny, metioniny i tryptofanu. Po transformacji sprawdzimy, czy szczep biorcy uzyskał zdolność wzrostu na podłożu pozbawionym jednego, dwóch lub trzech tych aminokwasów.

Transformacja

Pracujemy w grupach dwuosobowych.

Dzień 1.

Przygotowanie DNA bakterii dawcy.

1. Z 24 godzinnej hodowli szczepu dzikiego (dawcy) Bacillus subtilis pobrać 5 ml do probówki wirówkowej i odwirować 5 000 rpm przez 10 minut.

2. Delikatnie usunąć supernatant. Komórki zawiesić w 5 ml sterylnego buforu fosforanowego.

3. Dodać 5 μl roztworu lizozymu o stężeniu 20 mg/ml i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej, mieszać delikatnie.

4. Schłodzić probówkę w łaźni lodowej.

5. Dodać 100 μl chloroformu. Wymieszać. Następuje liza komórek i uwolnienie DNA.

6. Tak przygotowany preparat DNA można przechowywać w 4°C przez kilka dni.

Przygotowanie kompetentnych komórek biorcy Bacillus subtilis

1. Komórki biorcy hodować 24 godziny w 50 ml medium LB.

2. Hodowlę schłodzić w łaźni lodowej. Przenieść całość hodowli do probówki i odwirować

5 000 rpm przez 10 minut.

3. Delikatnie usunąć supernatant i zawiesić komórki w 15 ml medium MM1.

4. Przenieść 12.5 ml zawiesiny komórek do kolby 250 ml i inkubować z wytrząsaniem przez pięć godzin w temperaturze pokojowej.

5. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej i odwirować 5 000 rpm przez 10 minut.

6. Delikatnie usunąć supernatant i zawiesić komórki w 15 ml medium MM2.

Transformacja komórek kompetentnych

1. Przenieść 0.9 ml zawiesiny komórek kompetentnych B. subtilis DSM 9565 biorcy do sterylnej probówki. Dodać 0.1 ml roztworu DNA wyizolowanego z komórek dawcy B. subtilis DSM 10. Roztwór DNA pobierać bardzo ostrożnie, większość DNA znajduje się w białej warstwie tuż nad chloroformem. Przeniesienie nawet niewielkiej ilości chloroformu do komórek kompetentnych zabije je.

2. Inkubować zawiesinę w 37°C przez 30 minut z delikatnym mieszaniem.

3. Wysiać 0.1 ml mieszaniny na płytkę minimalną uzupełnioną aminokwasami: lizyną, metioniną i tryptofanem.

4. Rozcieńczyć mieszaninę transformacyjną 1:10 sterylną wodą. Wysiać 0.1 ml rozcieńczonej mieszaniny na płytkę minimalną uzupełnioną aminokwasami.

5. Hodować bakterie przez 48-72 godziny w 37°C.

Dzień 2.

1. Przenieść po 50-100 kolonii na 4 płytki:

a) z medium minimalnym z lizyną, metioniną i tryptofanem;

b) z lizyną i metioniną;

c) z tryptofanem i metioniną;

d) z tryptofanem. Kolonie wysiewać zgodnie ze schematem na rysunku.

2. Inkubować hodowle przez 48 godzin w 37°C.

Dzień 3.

Odczytać z płytek, które kolonie rosną na płytkach deficytowych dla biorcy. Płytka uzupełniona trzema aminokwasami jest płytką referencyjną. Jeśli na tej płytce kolonia nie wyrosła, wyniki z pozostałych dla tej kolonii należy pominąć.

Ćwiczenie 3. Transdukcja jest to przeniesienie materiału genetycznego do komórki bakteryjnej z wykorzystaniem bakteriofaga. W naszym eksperymencie wykorzystamy faga P1. Wielkość genomu P1 to 110 tysięcy par zasad. Ma on postać dwuniciowego, linowego DNA, jednakże replikuje w postaci kolistej. W czasie cyklu litycznego bakteriofaga P1 dochodzi do przypadkowego upakowania fragmentów DNA bakteryjnego wraz z niekompletnym DNA fagowym w kapsyd. Powstają wtedy defektywne cząsteczki fagowe. Komórka bakteryjna będąca gospodarzem P1 ginie przy uwolnieniu bakteriofagów. Fagi defektywne posiadają pełen zestaw białek niezbędny do wstrzyknięcia DNA do komórki bakterii, jednak nie posiadają zestawu genów fagowych potrzebnych do wytworzenia nowych cząsteczek faga. Dzięki takim nielizogennymfagom może dojść do przeniesienia genów bakteryjnych z jednej komórki do drugiej. Po przeniesieniu do komórki E. coli biorcy DNA z komórki E. coli dawcy dochodzi do rekombinacji i włączenia przenoszonych genów dawcy do chromosomu biorcy. Ponieważ pakowanie DNA E. coli do kapsydów bakteriofagowych jest całkowicie przypadkowe, każdy gen dawcy może zostać przeniesiony do chromosomu biorcy. Częstość rekombinacji post-transdukcyjnej nie jest wysoka i jest to zazwyczaj jedno zdarzenie na 106-108 zainfekowanych komórek. Ponieważ istnieje możliwość zapakowania do kapsydu odcinka około 100 kbp, dlatego możliwa jest ko-transdukcja jedynie takich genów, które znajdują się blisko siebie.

W trakcie infekcji do komórki E. coli może wniknąć DNA z wielu kapsydów fagowych. Jeśli komórka jest jednocześnie infekowana DNA dawcy i DNA fagowym przechodzi pełen cykl lityczny i ginie. Większość P1 w lizacie to cząsteczki fagowe zdolne do indukcji pełnego cyklu litycznego. Dlatego, aby zwiększyć szanse na przeżycie rekombinantów musimy ograniczyć możliwość jednoczesnej infekcji komórki E. coli przez dwie lub więcej cząsteczek fagowych. W tym celu komórki infekujemy zawiesiną fagów o bardzo niskim mianie, nie przekraczającym jednej cząsteczki P1 na jedną komórkę E. coli. Jednocześnie możemy zastosować chemiczną inhibicję wiązania P1 z komórką bakteryjną, w tym celu możemy użyć cytrynianiu, który jako chelat wiąże jony wapnia niezbędne dla efektywnej adsorpcji fagów na komórkach. Innym sposobem może być użycie lizogennego mutanta P1, niezdolnego do pełnego cyklu litycznego bez pomocy fagów prawidłowych.

Eksperyment przeprowadzimy wykorzystując te same szczepy E. coli, co w koniugacji. Najpierw zainfekujemy szczep dawcy DSM 423 Hfr H61 thr strS, następnie otrzymanymi cząsteczkami P1 zainfekujemy szczep biorcy AB1157.

Dzień 1

Do pipetowania lizatu fagowego i komórek zainfekowanych fagami używamy tylko końcówek do pipet wyposażonych w filtry. Po pieptowaniu fagów lub zakażonych komórek końcówka pipety musi być umyta alkoholem. Nieprzestrzeganie tychzaleceń może spowodować zainfekowanie fagami wszystkich E.coli używanych w eksperymencie.

Przygotowanie lizatu fagowego

Każda grupa otrzymuje płytkę z E. coli Hfr H61 zainfekowanymi bakteriofagiem P1.

1. Z płytki zeskrobać warstwę top-agar i przenieść do zakręcanej probówki wirowniczej, dodać 3 ml sterylnego buforu fagowego BF i kroplę chloroformu. Zakręcić i wirować 2500 rpm przez 10 minut w 4°C.

2. Supernatant przenieść do nowej probówki dodać kroplę chloroformu i wstawić do lodówki 4°C.

3. Z nocnej hodowli AB1157 pobrać 0.1 ml i dodać do 5 ml LB + 5 mM CaCl2 i hodować w 37°C przez 4 godziny.

4. Przenieść bakterie do komórki wirowniczej i odwirować 10 000 rpm przez 5 min w 4°C. Odsączyć supernantant i delikatnie zawiesić komórki w 5 ml buforu MC.

5. Rozcieńczyć lizat fagowy: 0.1 ml lizatu dodać do 0.9 ml buforu MC (rozcieńczenie 10-1). Pobrać 0.1 ml rozcieńczenia i przenieść do kolejnej probówki zawierającej 0.9 ml MC (rozcieńczenie 10-2).

6. Przygotować mieszaninę transdukcyjną. Do 3 zamykanych probówek dodać 0.1 ml zawiesiny bakterii AB1157 i 0.1 ml lizatu fagowego z rozcieńczeń 100, 10^-1 i 10^-2. Przygotować również probówki zawierające tylko 0.1 ml zawiesiny bakterii i tylko 0.1 lizatu fagowego 100. Wszystkie probówki (5) inkubować w 37°C przez 20 minut.

7. Dodać 0.2 ml 0.1 M cytrynianu sodu i przenieść zawartość każdej probówki do 7 ml F-top agar (z łaźni 55°C) i natychmiast wylać na płytki z antybiotykiem streptamycyną. Należy pracować szybko aby top-agar nie zdążył skrzepnąć przed wylaniem na płytki bazowe. Pozostawić płytki na 10-15 minut.

8. Inkubować płytki w 37°C przez noc lub dłużej.

Dzień 2.

1. Przenieść 100 kolonii z płytek na płytki z medium selekcyjnym przygotowanym według schematu. Płytki dodatkowo zawierają antybiotyk selekcyjny streptamycyne.

nazwa	glukoza	galaktoza	prolina	leucyna
Bez proliny (P)	+	-	-	+
Bez leucyny (L)	+	-	+	-
Bez aspartamu (A)	+	-	+	+
Z galaktozą (G)	-	+	+	+

Glukozę i galaktozę dodajemy do podłoża w ilości 5 g/l; tiaminę 2-5 μg/l; aminokwasy 50 μg/ml; antybiotyk selekcyjny - streptomycynę 100 μg/ml.

2. Inkubować płytki przez noc lub dłużej w 37°C.

Dzień 3.

1. Zliczyć kolonie bakterii, które wyrosły na poszczególnych mediach selekcyjnych i zapisać wyniki w odpowiedniej tabeli.

2. Zebrać wyniki dla wszystkich eksperymentów, obliczyć średnią liczbę kolonii.

Ćwiczenie 4 .Mutageneza

Izolacja i charakterystyka mutantów jest podstawą badań genetycznych, mapowania genów i identyfikacji ich funkcji. Olbrzymia większość artykułów naukowych dotyczących genetyki opiera się na izolacji, identyfikacji i charakterystyce mutantów.

W badaniach mutagenezy wykonamy dwa eksperymenty. Jeden oparty będzie na zjawisku mutagenezy wywołanej promieniowaniem UV. W drugim spróbujemy wyizolować mutanty pojawiające się spontanicznie w hodowli bakterii.

Naświetlanie komórek bakterii promieniowaniem UV o krótkiej długości fali (254 nm) generuje w DNA dimery pirymidynowe powstające pomiędzy sąsiednimi zasadami w tej samej nici. Najczęściej są to dimery tyminy. Komórki Escherichia coli posiadają dwa bardzo wydajne systemy naprawy takich uszkodzeń. Jeden wykorzystuje enzym fotoliazę i energię światła do usuwania nieprawidłowych wiązań. Drugi jest systemem naprawczym „ciemnym” i wykorzystuje mechanizm naprawy przez usuwanie nukleotydów lub inne systemy naprawcze jak na przykład „SOS”. System naprawczy z fotoliazą można zablokować w prosty sposób, trzymając komórki bakterii cały czas w ciemności. W naszym eksperymencie z mutagenezą UV wykorzystamy dwa szczepy Escherichia coli. Jeden „dziki” posiadający sprawne wszystkie mechanizmy naprawcze, drugi będący mutantem recA, genu kodującego białko biorące udział praktycznie we wszystkich „ciemnych” mechanizmach naprawczych.

E.coli H61 (DSM 423 Hfr H61 )przy dużych uszkodzeniach DNA promieniowaniem UV uruchamia system naprawczy „SOS”, który umożliwia bardzo efektywną naprawę uszkodzeń, ale nie jest systemem bezbłędnym. Dlatego częstość pojawiania się mutantów H61 po naświetleniu jest stosunkowo wysoka. Drugi szczep E. coli TOP10 jest znacznie bardziej wrażliwy na promieniowanie UV i przeżywalność bakterii po naświetleniu jest niska. Jednocześnie, wada w układach naprawczych powoduje znacznie niższą częstość pojawiania się mutantów niż w przypadku szczepu dzikiego.

W przypadku izolacji mutantów niezbędny jest system selekcji klonów umożliwiający wyłowienie odpowiednich mutantów spośród innych komórek bakteryjnych.

W naszym przypadku jako czynnik selekcyjny zastosujemy antybiotyk rifamycynę. Antybiotyk ten blokuje syntezę RNA poprzez tworzenie kompleksu z rosnącym oligonukleotydem RNA. Rifamycyna działa na prokariotyczne polimerazy RNA zależne od DNA.. Mutacja w genie RNA polimerazy może spowodować zmiany w strukturze enzymu blokujące działanie antybiotyku.

Drugim eksperymentem będzie obserwacja pojawiających się sporadycznie mutantów w hodowli Serratia marcescens, pałeczki będącej komensalem ludzkiego przewodu pokarmowego, mogącej przejawiać działanie patogenne w wypadku osłabienia odporności. Jednym z ważnych mechanizmów przeżycia bakterii w przewodzie pokarmowym jest możliwość dostosowania się do zmiennych i często niekorzystnych warunków - jadamy różne pokarmy i przyjmujemy leki, które mogą mieć niekorzystny wpływ na bakterie.

W naszym eksperymencie będziemy obserwować częstość pojawiania się mutantów S. marcescens uzyskujących oporność na streptomycynę.

Mutageneza UV

Dzień 1.

1. Rozcieńczyć nocne hodowle E.coli szczepu „dzikiego” (DSM 423 Hfr H61) oraz szczepu TOP10 1:20 świeżą pożywką LB i hodować 3 godziny w 37°C.

2. Odwirować 5 ml hodowli 5000 rpm 10 minut i zawiesić komórki w 5 ml 0.1 M MgSO4. Dobrze zawiesić bakterie.

3. Przenieść zawiesinę bakterii do pustej szalki Petriego.

4. Naświetlać bakterie w czasach (0, 5, 10, 60, 120, 180, 240 sek) i po kolejnych czasach naświetlania pobierać do 2 probówek: 10μl zawiesiny do probówki zawierającej 0.9 ml sterylnej wody. Następnie przenieść do 2 kolejnych probówek zawierających 0.9 ml LB 0.1 ml zawiesiny ( z probówki wcześniejszej).

5. Wysiewać w ciemności jedną probówkę na płytki LB bez antybiotyku a drugą na płytkę z medium selekcyjnym (z antybiotykiem rifamycyną). Inkubować zarówno płytki jak i podłoża płynne w 37°C.

Dzień 2.

1. Policzyć liczbę kolonii pojawiającą się na płytkach z medium selekcyjnym i bez rifamycyny.

2. Wyniki przeżywalności komórek obydwu szczepów i częstości pojawiania się mutacji zapisać w odpowiednich tabelach.

	E.coli typu dzikiego	TOP10
Czas UV(sek)	LB bez antybiotyku	LB z antybiotykiem
0
5
10
60
120
180
240

Mutageneza spontaniczna

Dzień 1.

1. Na płytkę z gradientem streptomycyny wysiać 0.3 ml nocnej hodowli Serratia marcescens

2.Wysiać również Serratia marcescensna płytkę bez antybiotyku.

3. Inkubować płytki w 37°C przez 24-48 godzin.

Dzień 2.

1. Pobrać po 2 kolonie z płytki z gradientem streptomycyny z regionów o różnym stężeniu antybiotyku (stężenie minimalne, stężenie środkowe, stężenie maksymalne). Kolonie dobrze zawiesić w 1 ml sterylnej wody.

2. Wysiać po 0.1 ml do probówek z 5 ml LB zawierających streptomycynę w ilości: 0.00 mg; 0.01 mg i 0.05 mg.

3. Podobnie wysiać bakterie oryginalne, z płytki nie zawierającej antybiotyku na hodowle płynne z5 ml LB zawierających streptomycynę w ilości: 0.00 mg; 0.01 mg i 0.05 mg.

Dzień 3.

1. Wyniki przedstawić w formie rysunku płytki gradientowej oraz oceny wzrostu bakterii w hodowli płynnej.

2. Wyniki przedstawić jako: 0 brak wzrostu; + słaby wzrost;….; +++++ silny wzrost.