ĆWICZENIE NR 3

WYKORZYSTANIE MEOD SPEKTROSKOPOWYCH

(UV-VIS, FTIR) W ANALIZIE ŻYWNOŚCI

ZASTOSOWANIE POTENCJOMETRII W ANALIZIE ŻYWNOŚCI

1. CEL ĆWICZENIA:

Wyznaczanie widm i zapoznanie się z obsługą spektrofotometrów

Nabycie umiejętności obsługi różnych typów pehametrów

2. WPROWADZENIE

Spektroskopia to dziedzina nauki, która obejmuje metody badania materii przy użyciu promieniowania elektromagnetycznego, które może być w danym układzie wytworzone (emisja) lub może z tym układem oddziaływać (adsorbcja).

Definicje wybranych terminów:

Zakres nadfioletu, UV (ang. Ultraviolet) -zakres widma elektromagnetycznego od 10 do 380nm, zwykle 200-380nm.

Zakres widzialny, VIS (ang. Visible) -zakres widma elektromagnetycznego widzialny dla oka 380 do 780nm.

Absorpcja - przekształcenie energii promienistej w inne formy energii wskutek oddziaływania z materią.

Ślepa próba - roztwór przygotowany w ten sposób aby kompensował absorbancję pochodzącą od odczynników lub też składników próbki różnych od oznaczanego.

Tło - absorbcja wszystkich nieznanych, lub znanych ale nie oznaczanych, składników próbki.

Grubość warstwy absorbującej, - w przypadku cieczy i gazów odległość między wewnętrznymi powierzchniami ścian naczyńka zawierającego ośrodek absorbujacy.

Transmitancja, T -stosunek natężenia wiązki promieniowania przepuszczanego przez próbkę do natężenia wiązki padającej T = I/I₀ w praktyce T = I_S/I_r.

Absorbancja A - logarytm dziesiętny odwrotności transmitancji; A = log(1/T).

Widmo - uporządkowana zależność między moca promieniowania absorbowanego lub emitowanego i jego liczbą falową, długością promieniowania bądź częstością.

Widmo absorbcji - widmo, które powstaje w wyniku przejścia promieniowania przez ośrodek absorbujący.

Krzywa wzorcowa -wykres zależności pomiędzy mierzona wielkością (absorbcją, transmitancją) a stężeniem oznaczanej substancji.

Spektroskopia IR - rodzaj spektroskopii, w której stosuje się promieniowanie podczerwone. Najpowszechniej stosowaną techniką IR jest absorpcyjna spektroskopia IR, służąca do otrzymywania widm oscylacyjnych (choć w zakresie dalekiej podczerwieni obserwuje się także przejścia rotacyjne). Przy pomocy spektroskopii IR można ustalić jakie grupy funkcyjne obecne są w analizowanym związku. Spektroskopia w podczerwieni pozwala na analizę zarówno struktury cząsteczek jak i ich oddziaływania z otoczeniem. Jest to jedna z podstawowych metod stosowanych w badaniu wiązań wodorowych. Metodą komplementarną do spektroskopii IR jest spektroskopia Ramana.

Zalety metod spektrofotometrycznych:

1. dostępna, prosta w obsłudze i stosunkowo tania aparatura,

2. wysoka czułość pomiaru,

3. duża dokładność [1-5%] [0.2-0.5% dla metod różnicowych] i precyzja pomiaru dla stężeń >10^-4% [<10%] dla śladów >10^-7 [<30%] ,

4. uniwersalność, absorbancja powinna się mieścić w zakresie od 0.1 do 1.0

Potencjometria

jest metodą wykorzystującą zależność między aktywnością oznaczanego jonu w roztworze, a potencjałem elektrycznym elektrody. Praktycznie wyznacza się stężenie oznaczanego składnika na podstawie SEM ogniwa utworzonego z elektrody wzorcowej i pomiarowej (dla roztworów rozcieńczonych). 

Mierząc stężenie jonów wodorowych wkraczamy w zakres PEHAMETRII.

pH jest ujemnym log [H⁺] z wartości stężenia jonów wodorowych. 
Pomiaru stężenia jonów dokonuje się praktycznie np. mierząc SEM ogniwa złożonego z dwóch elektrod wchodzących w skład tzw. elektrody kombinowanej (Rys. 1). 

KALIBRACJA

• kalibrację należy przeprowadzić zgodnie z procedurą opisaną w instrukcji obsługi pehametru, z którym elektroda ma współpracować.

• dokładność pomiaru poprawia mieszanie mierzonego medium. Pomiędzy kolejnymi pomiarami (jeśli elektroda nie pracuje w sposób ciągły) zaleca się opłukać elektrodę wodą destylowaną i osuszyć bibułą (papierowym ręcznikiem).

• należy wykonywać kalibrację dwupunktową (wielopunktową). Zaleca się, aby wśród używanych roztworów kalibracyjnych był bufor pH 7 (do sprawdzenia punktu zerowego elektrody), a wartość drugiego buforu była bliska spodziewanej wartości mierzonej próbki (drugi punkt kalibracji służy do określenia nachylenia elektrody).

• częstotliwość kalibracji zależy od wymaganej dokładności pomiarów oraz od warunków pracy elektrody: ilości i rodzaju zanieczyszczeń mierzonego roztworu.

• elektrody, które pracują w sposób ciągły, należy kalibrować przynajmniej raz w tygodniu, o ile praktyka pomiarowa nie wskazuje inaczej.

• w warunkach przemysłowych często stosuje się kalibrację jednopunktową, wykorzystującą tzw. kalibrację porównawczą. Wolno z niej korzystać tylko wtedy, gdy pomiary pH są stabilne. Pobiera się próbkę badanej cieczy i mierzy się jej pH przy pomocy np. pehametru przenośnego (wyposażonego w inną elektrodę). Zmierzona wartość służy do weryfikacji mierzonej wartości procesowej - w procedurze kalibracji jednopunktowej.

3. Wykonanie ćwiczenia

1. Wyznaczanie widm w podczerwieni (próbę wskazuje prowadzący)

1. włącz czarnym przyciskiem spektrofotometr (znajduje się z tyłu urządzenia)

2. włącz komputer

3. wybierz program WinFirst a następnie WinFirst Lite (ukazuje się panel)

4. w przypadku braku panelu przywróć go klikając na:

5. wybierz odpowiednią metodę: kliknij na panelu Load method a następnie żądaną metodę najczęściej: atr (metodę wskazuje prowadzący)

6. po wybraniu (zaznaczeniu) metody kliknij OK.

7. zdejmij tło „próba ślepa” : na panelu zaznacz Background a następnie kliknij SCAN

8. po wykonaniu tych opcji po chwili na ekranie pojawi się komunikat: Please Prepare for a Background Scan kliknij OK.

9. po zdjęciu tła nanieś lub włóż próbę do spektrofotometru (najczęściej próbę nanosi się na kryształ; jeśli jest ona rozpuszczona to poczekaj aż rozpuszczalnik odparuje)

10. na panelu zaznacz Sample a następnie kliknij SCAN

11. po wykonaniu tych opcji po chwili na ekranie pojawi się komunikat: Please Prepare for a Sample Scan kliknij OK.

12. po ok. 1 min otrzymujemy widmo danej próby/związku

13. w celu zapisania widma kliknij na File a następnie SAVE Sample As

14. W polu file name: wpisz nazwę próby max 6 znaków

15. W polu Save file as type: wybierz odpowiedni format pliku np. JACAMP-DX

16. Wybierz folder: analityka

17. Zapisz plik

18. Po zapisaniu widma wyczyść dokładnie kryształ a następnie nanieś kolejną próbę

2. Wyznaczanie widm w UV -VIS

1. włącz czarnym przyciskiem spektrofotometr (znajduje się z tyłu urządzenia)

2. poczekaj kilka minut (następuje test spektrofotometru)

3. włóż dyskietkę

4. wybierz odpowiednia metodę: kursor przesuń na LIBRARY a następnie kliknij ENTER

5. w przypadku wytyczenia widma w całym zakresie UV-VIS wybierz metodykę WIDMO następnie naciśnij ENTER ukazuje się kilka komunikatów zaznacz kursorem LOAD i naciśnij ENTER

6. obserwuj komunikaty jakie pokazują się na panelu w przypadku pojawienia się komunikatu „please wait” proszę czekać aż on zniknie

7. do czystej kuwety wlej próbę ślepą i włóż do spektrofotometru

8. kliknij ZERO BASE (poczekaj 2-3 minuty)

9. wylej z kuwety próbę ślepą przepłucz kuwetę używanym rozpuszczalnikiem a następnie wlej próbę właściwą

10. kliknij RUN

11. w celu zapisania danych kliknij na SAVE DATE

12. wpisz nazwę próby (kursorami wybierz żądane litery i zatwierdzaj je klikając ENTER) po wpisaniu nazwy naciśnij ACCEPT

13. wybierz typ pliku: podświetl kursorem TYPE naciśnij ENTER podświetl typ np. CSV i jeszcze raz naciśnij ENTER

14. zapisz plik kliknij SAVE (dane zapisujemy na dyskietce)

15. przenieś dane do Excela i zrób wykres, przeliczając wartości na 1cm/1%

wg wzoru

gdzie:

A - wartość absorbancji przy określonej długości fali

n - zawartość tłuszczu w 10cm³

16. porównaj zawartość dienów (A 234 nm) i trienów (A 268 nm) w analizowanych próbach

3. Wykalibrować pehametr wg załączonej instrukcji obsługi

Przygotowanie i przechowywanie elektrody pH

Jeżeli producent elektrody kombinowanej pH nie poda innego sposobu postępowania należy: nową elektrodę moczyć w wodzie destylowanej, nasyconym roztworze KCI lub roztworze buforowym 4 pH przez okres około 12 godzin; przed pomiarem zsunąć pierścienie osłonowe (jeżeli są stosowane w danym typie elektrody). Pierścień dolny, osłaniający łącznik elektrody, przesuwa się w górę, wzdłuż korpusu, pierścień górny, z otworu służącego do uzupełniania KCI, w dół korpusu elektrody. Usunięcie dolnego pierścienia jest konieczne, gdyż w przeciwnym wypadku elektroda nie będzie mierzyć. Górny pierścień należy zdjąć podczas pomiaru roztworów o wysokiej temperaturze oraz w celu lepszego samooczyszczenia łącznika w przypadku pomiarów roztworów z osadami. Wypływający przez łącznik KCI nie dopuszcza wtedy do jego zatkania; podczas pomiarów nie wolno trzymać za kabel elektrody;

po każdym pomiarze elektrodę opłukać wodą destylowaną; podczas osuszania bibułą membrany elektrody, delikatnie dotykając, usunąć nadmiar roztworu; po pracy przechowywać elektrodę w wodzie destylowanej, nasyconym roztworze KCI lub roztworze buforowym 4 pH. Pierścienie osłonowe nasunąć na elektrodę; w przypadku długich przerw w użytkowaniu elektrodę osuszyć bibułą i przechowywać w opakowaniu; po wyjęciu z opakowania usunąć ewentualny osad za pomocą wody; przed ponownym użyciem elektrodę moczyć w wodzie destylowanej przez okres kilku godzin; kontrolować poziom elektrolitu i okresowo uzupełniać przez górny otwór w korpusie elektrody (nasyconym roztworem KCI).

W celu przygotowania przyrządu do pracy należy wykonać następujące czynności:

• przygotować elektrodę pH-metryczną zgodnie z zaleceniami producenta lub instrukcji;

• podłączyć elektrodę do przyrządu;

• wykalibrować przyrząd wg instrukcji.

WŁĄCZENIE I WYŁĄCZENIE PRZYRZĄDU

Po włączeniu przyrządu klawiszem ON/OFF na wyświetlaczu pojawiają się wszystkie symbole. Jeżeli parametry ostatniej kalibracji zachowane są w pamięci, to po 2 sekundach przyrząd przechodzi do trybu pomiaru pH. Trwałe utrzymywanie się testu oznacza utratę charakterystyki elektrody. Po naciśnięciu klawisza CAL przyrząd przyjmie do pomiarów standardową charakterystykę elektrody, ale nie zapisze jej w pamięci. Jeżeli nie zostanie przeprowadzona kalibracja, to po ponownym włączeniu przyrządu sytuacja się powtórzy. Minimalny okres czasu między włączeniem i wyłączeniem przyrządu wynosi 2 sekundy.

Kalibracja elektrody pH

Każda elektroda wymaga kalibracji, ponieważ pomiar bez kalibracji wprowadza błąd związany z cechami elektrody. Kalibracja jest konieczna po każdej zmianie elektrody na nową. Zaleca się powtarzanie tej czynności przed serią pomiarów, po długotrwałym używaniu tej samej elektrody lub po dłuższej przerwie w pomiarach. Do kalibracji niezbędne są dwa roztwory buforowe o ściśle określonej wartości: pierwszy o wartości 7 pH oraz drugi o wartości 4 pH lub 9 pH. Stosowanie innych roztworów niź podane jest niedopuszczalne. Wartość drugiego roztworu buforowego powinna być zbliżona do przewidywanej wartości pH badanego roztworu. Eliminuje to w większym stopniu błąd elektrody.

Przed przystąpieniem do kalibracji należy odpowiednio przygotować przyrząd i elektrodę.

W celu wykalibrowania elektrody należy:

• zmierzyć temperaturę roztworów wzorcowych i doprowadzić ją do wartości podanej przez producenta;

• włączyć przyrząd klawiszem ON-OFF

• zanurzyć elektrodę w roztworze buforowym 7 pH,

• po ustabilizowaniu się wskazania (czasami nawet kilka minut) nacisnąć i przytrzymać klawisz CAL do momentu pojawienia się na wyświetlaczu napisu CAL;

• wyjąć elektrodę, przepłukać ją w strumieniu wody destylowanej i osuszyć membranę bibułą filtracyjną

• zanurzyć elektrodę w roztworze buforowym o wartości 4 pH lub 9 pH (pamiętaj że wartość drugiego roztworu buforowego powinna być zbliżona do przewidywanej wartości pH badanego roztworu)

• po ustabilizowaniu się wskazania nacisnąć i przytrzymać klawisz CAL do momentu pojawienia się na wyświetlaczu napisu cal,

• wyjąć elektrodę, przepłukać ją w strumieniu wody destylowanej, osuszyć membranę bibułą filtracyjną lub spłukać roztworem, który będzie badany.

Uwaga: w czasie kalibracji wskazania przyrządu będą się różnić od wartości roztworów buforowych, dopiero po naciśnięciu klawisza CAL będą takie same.

Jeżeli po naciśnięciu klawisza CAL i wyświetleniu napisu tni na wyświetlaczu pojawi się napis Err_t to znaczy, że zastosowano niewłaściwy roztwór buforowy lub niesprawną elektrodę. Kalibrowany punkt pozostanie taki, jak przed kalibracją

Pomiar pH

Przed pomiarem pH należy przygotować przyrząd i wykalibrować elektrodę

Następnie należy:

• włączyć przyrząd klawiszem ON-OFF;

• zanurzyć elektrodę w badanym roztworze, nie dotykając dna i boków naczynia;

• odczekać do ustabilizowania się wskazań na wyświetlaczu i odczytać wartość pH.

Czas pomiaru zależy w głównej mierze od elektrody. Po upływie około 20 sekund wartość odczytu jest zbliżona do ostatecznej. Bardzo dokładny pomiar wymaga jednak odczekania do pełnej stabilizacji, co trwa około 1 minuty. Po zakończeniu pomiarów wyłączyć przyrząd.

Po skończonej pracy wyczyść i osusz elektrodę

4. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Spektrofotometria

2. Budowa i zasada działania spektrofotometru

3. Budowa i zasada działania pehametru

4. Rodzaje elektrod.

5. LITERATURA

1. Szczepaniak W. Metody instrumentalne w analizie chemicznej. Wydawnictwo Naukowe PWN, 1997.

2. Terlecki J. (red.), Ćwiczenia laboratoryjne z biofizyki i fizyki. Podręcznik dla studentów., Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1999.

3. Szyszko E. Instrumentalne metody analityczne. PZWL, 1982

4. Ewing G.E. Metody instrumentalne w analizie chemicznej. PWN, 1980.

Analityka żywności Technologia Żywności i Żywienie Człowieka studia drugiego stopnia

9

METODY OCENTY TOWARÓW TOWAROZNAWSTWO II ROK

1 - elektroda wyprowadzająca chlorosrebrowa 
2 - roztwór wewnętrzny elektrody chlorosrebrowej (0,1 mol/dm³ HCl) 
3 - membrana szklana (niskooporowa;100-500 MW) 
4 - elektroda porównawcza chlorosrebrowa 
5 - roztwór wewnętrzny elektrody porównawczej (nasycony roztwór KCl nasycony AgCl) 
6 - przewód wyprowadzający sygnał 
7 - wlew roztworu wewnętrznego

---