Wykorzystanie markerów genetycznych w kontroli pochodzenia zwierząt

Chromosom - forma organizacji materiału genetycznego wewnątrz komórki.

Locus- określony obszar chromosomu zajmowany przez gen. W obrębie chromosomu znajduje się wiele różnych loci.

Allel - jedna z wersji genu w określonym miejscu (locus) na danym chromosomie homologicznym. Allele tego samego genu różnią się jednym lub kilkoma nukleotydami. Występowanie więcej niż jednej wersji danego genu określa się jako polimorfizm.

Gen - podstawowa jednostka dziedziczności

Ochrona zasobów genetycznych zwierząt ma na celu m. in. zachowanie zmienności genetycznej w obrębie określonej rasy

Zmienność genetyczna - naturalne różnice sekwencji DNA (genotypu) organizmów jednego gatunku. Przy ochronie populacji zagrożonych wyginięciem trzeba zachować pewną minimalną pulę genową zapewniającą zmienność genetyczną.

Obecnie dzięki znajomości nowych technik biotechnologicznych zmienność genetyczną ocenić można na podstawie tzw. markerów genetycznych.

Marker genetyczny jest to gen warunkujący cechę lub zespół cech jakościowych zauważalnych w fenotypie osobnika , występujący w dwóch łatwo rozróżnialnych allelach którego dziedziczenie można śledzić w czasie krzyżówki genetycznej, umożliwiając ustalenie pozycji genu na mapie.

Markery genetyczne podzielono na dwie klasy. Do klasy I należą sekwencje kodujące, a ich polimorfizm określany jest poprzez analizę metodą serologiczną i elektroforezę białek lub poprzez badanie DNA tych genów. Do najpopularniejszych markerów należących do tej klasy należą: układy grupowe krwi, białka surowicy krwi, erytrocytów, leukocytów i mleka. Klasę II stanowią sekwencje niekodujące, m. in. sekwencje minisatelitarne i sekwencje mikrosatelitarne, które identyfikowane są przy zastosowaniu metod elektroforetycznych.

Mają one wspólne właściwości:

1. Wszystkie podlegają dziedziczeniu wg praw Mendla.

2. Identyfikacja ich jest możliwa przez zastosowanie metod immunologicznych lub biochemicznych.

Do klasy pierwszej należą geny kodujące cechy jakościowe organizmu:

1. antygeny erytrocytalne (układy grupowe krwi) -identyfikowane metodami serologicznymi i przekazywane potomstwu w formach zwanych fenogrupami;

2. antygeny MHC- antygeny głównego kompleksu zgodności tkankowej (BoLa, 23 chromosom)

3. antygeny białek surowicy krwi- są to tzw. allotypy immunoglobulin i allotypy lipoprotein

4. białka polimorficzne osocza krwi, erytrocytów, mleka

Do klasy drugiej zaliczamy:

1. Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych - RFLPs

2. Minisatelitarny polimorfizm DNA

3. Mikrosatelitarny polimorfizm DNA

4. Polimorfizm losowo amplifikowanych fragmentów- RAPD.

Zastosowanie markerów genetycznych:

1. Kontrola pochodzenia

2. Ocena zmienności genetycznej

3. Określenie dystansów genetycznych

4. Ustalenie mapy genomowej

Kontrola pochodzenia zwierząt prowadzona jest od wielu lat. Dotychczas w procesie tym najczęściej wykorzystywano układy grupowe krwi oraz polimorficzne białka. Dotychczas u bydła poznano ponad 100 antygenów erytrocytarnych, które ze względu na ich dziedziczenie należą do 12 układów grupowych krwi: A, B, C, F, J, L, M, S, Z, N', R', T'

Najwcześniej wykorzystywanymi markerami w analizie genetycznej np. do kontroli pochodzenia były układy grupowe krwi, należące do markerów I klasy. Antygeny erytrocytarne zwierząt zaczęły cieszyć się dużym zainteresowaniem na przełomie lat 50 i 60, czego wynikiem było określenie wielu układów grupowych. U bydła poznanych zostało aż 11 układów grupowych przy czym najbardziej polimorficzny okazał się układ B, w którym wykryto 40 antygenów i opisano około 1 000 alleli. W przypadku kontroli pochodzenia najlepszymi układami są te, w których występuje wiele antygenów, w związku z czym poza układem B u bydła wykorzystywane są także układy C (12 antygenów) oraz S (8 antygenów). Jednakże wykorzystanie antygenów erytrocytarnych w identyfikacji osobniczej nie zawsze daje nam jednoznaczne wskazanie na parę rodzicielską, dlatego zaleca się by kontrola pochodzenia poszerzona została o analizę polimorfizmu DNA.

Najpopularniejsze są w badaniach odcinki mikrosatelitarnego DNA. Sekwencje mikrosatelitarne są to proste, tandemowe powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronukleotydowych sekwencji zwanych motywami (STR). Najczęściej są to jednak dwunukleotydowe motywy powtórzeń. Często motyw taki może być, regularnie przerywany inną sekwencją.

Mikrosatelity charakteryzują:

• duże zróżnicowanie ilości powtórzeń motywu podstawowego (duży polimorfizm)

• proste mendlowskie dziedziczenie

• równomierne rozmieszczenie w genomach

Tu pomocna staje się łańcuchowa reakcja polimerazy, (Polymerase Cham Reaction - PCR. Po rozdziale na żelu lub po hybrydyzacji ze znana sondą dowiadujemy się, jakiej długości mikrosatelita występuje u badanego osobnika pod względem analizowanego loci. Jeżeli zastosujemy metodę multiplex PCR otrzymamy cały zestaw prążków do przeanalizowania.

Cykl reakcji PCR obejmuje następujące po sobie 3 etapy:

1. denaturacja dupleksu DNA w temp. 92°C - 96°C

2. hybrydyzacja starterów do komplementarnych miejsc na

matrycy w temp. 37°C - 72°C

3. wydłużanie startera od końca 3'-OH przez dosyntetyzowanie

kolejnych deoksynukleotyów przy udziale polimerazy DNA w temperaturze 72°C

Powtarzanie takich cykli daje w efekcie powielenie zdefiniowanej sekwencji DNA

W wyniku PCR liczba cząsteczek DNA rośnie w postępie geometrycznym (po każdym cyklu ich liczba ulega podwojeniu). Po zakończeniu około 30 cykli liczba kopii DNA przekracza kilka milionów.

Przykładowy motyw powtórzeń sekwencji mikrosatelitarnej może mieć postać; CATA

    Allel 1.
CATACATACATACATACATACATACATACATACATACATACATACATA

    Allel 2.
CATACATACATACATACATACATACATACATACATACATACATA

    Allel 3.
CATACATACATACATACATACATACATACATACATACATA

Minisatelitarny polimorfizm DNA odkryty został w 1985 roku. Miejsca takie to sekwencje zawierające zmienną liczbę tandemowych powtórzeń kilkunasto- lub kilkudziesięciu nukleotydowego motywu. W zależności od ilości powtórzeń fragment taki ma charakterystyczną długość. Może ona być badana tą samą metodą PCR wraz z elektroforezą, połączoną z hybrydyzacją z wyznakowaną sondą. Wykonanie analizy DNA każdego organizmu polega na uzyskaniu charakterystycznego osobniczo układu prążków na elektofogramie i hybrydyzacji tego produktu z wyznakowaną sondą, reprezentującą konkretną sekwencję powtarzalną. Układ takich prążków nazywany jest odciskiem palca DNA inaczej DNA fingerpriting.

Przykładowy motyw powtórzeń sekwencji minisatelitarnej może mieć postać; AGGGCTGGAGG

   Allel 1.
AGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGG
    Allel 2.
AGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGG
    Allel 3.
AGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGG

Prócz wykorzystania sekwencji mini i mikrosatelitarnych planuje się do kontroli pochodzenia wykorzystywać również polimorfizm pojedynczych nukleotydów SNP, czyli single nukleotide polymorphism. Polimorfizm taki to skutek mutacji to znaczy zamiany pojedynczych nukleotydów, czyli mutacji punktowych.

Bardzo dużą zaletą tej metody jest to, że mutacje takie są bardzo powszechne w genomie. Mutacje alleli SNP mogą być wykrywane techniką RFLP, jeśli tylko spowodują powstanie miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne.

4

---