Genetyka zwierz

ą

t

Hodowla zwierz

ą

t II rok

Wykład 11 (15.12.2009 – 5.01.2010)

Markery genetyczne w hodowli zwierz

ą

t

dr hab. Dorota Cie

ś

lak, prof. nadzw

Marker genetyczny - definicja

dowolna cecha jako

ś

ciowa, uwarunkowana w sposób prosty

łatwa do kontroli i przydatna do celów analizy genetycznej

3

Marker genetyczny - charakterystyka

Polimorfizm

– im wi

ę

ksza liczba alleli w locus danego

markera tym wi

ę

ksza jego przydatno

ść

do analizy (układ

homozygotyczny – stwierdzenie zaj

ś

cia c/o jest niemo

ż

liwe)

Wysoki udział osobników heterozygotycznych

– je

ż

eli

dominuje jeden z wielu alleli w danym locus
(np. frekwencja powy

ż

ej 0.9) wówczas mimo du

ż

ego

polimorfizmu locus to jest mało informatywne

Mutacje

– cz

ę

sto

ść

mutacji w locus markera powinna by

ć

bardzo niska;

Rodzaje

markerów

genetycznych

klasa I

sekwencje koduj

ą

ce –

analiza produktów genów

lub sekwencji DNA genów

klasa II

sekwencje niekoduj

ą

ce –

analiza sekwencji DNA

głównie powtarzalne sekwencje

mikrosatelitarne

, w mniejszym

stopniu minisatelitarne

klasa I

sekwencje koduj

ą

ce –

analiza sekwencji DNA genów

lub produktów genów

Markery genetyczne klasy I (sekwencje

koduj

ą

ce = geny)

– antygeny erytrocytarne (grupy krwi)

– polimorficzne białka (surowicy krwi, mleka,

jaja itp.)

– antygeny głównego kompleksu zgodno

ś

ci

tkankowej

Grupy krwi

• W te

ś

cie serologicznym wykrywana jest

determinanta antygenowa

– surowica testowa zawiera specyficzne

przeciwciało rozpoznaj

ą

ce dany antygen

– reakcja „antygen - przeciwciało” aglutynacja

lub hemoliza

Genetyczne

podło

ż

e

polimorfizmu

erytrocytarnego

Charon &

Ś

wito

ń

ski 2004

• białko mo

ż

e mie

ć

jedn

ą

lub wi

ę

cej determinant

antygenowych

• ró

ż

ne formy determinant antygenowych s

ą

wynikiem

mutacji punktowych w genach je koduj

ą

cych

• allel mo

ż

e by

ć

odpowiedzialny za powstanie białka o

kilku determinantach antygenowych

Układy grupowe krwi

zwierz

ą

t gospodarskich

• Bydło

11

83

1122

•

Ś

winia

15

76

76

• Ko

ń

7

34

56

• Kura domowa

13

Liczba

Układów

antygenów

alleli

Białka surowicy krwi, erytrocytów,

leukocytów

• druga co do wielko

ś

ci grupa markerów klasy I

• polimorfizm wynika ze zmienno

ś

ci form strukturalnych

białek (mutacje punktowe w genie koduj

ą

cym białko lub

enzym odpowiedzialny za modyfikacje potranslacyjne)

• najbardziej polimorficzne białka np. inhibitor

α

-proteaz

konia – 20 alleli

Polimorfizm markerów genetycznych – metody

detekcji

• Grupy krwi

– test serologiczny (surowice testowe)

• Polimorfizm białek

– elektroforeza

• Polimorfizm DNA

– elektroforeza (sekwencje mikrosatelitarne)

– hybrydyzacja ze znakowan

ą

sond

ą

(sekwencje minisatelitarne - tzw. „odcisk
palca DNA”)

Polimorfizm

białek mleka

Kazeiny

np. w locus

α

s1 wykryto

5 alleli

białko serwatki

β

-laktoglobulina

DNA

–

analiza

niezale

ż

na od

płci, wieku,
stanu
fizjologicznego

białko –

analiza mleka
(wył

ą

cznie u

samic podczas
laktacji)

Identyfikacja polimorfizmu białek przy pomocy

elektroforezy

•

rozdział w stałym polu elektrycznym

•

szybko

ść

przemieszczania zale

ż

y od masy, konformacji

przestrzennej i ładunku

Polimorfizm nukleotydów sekwencji

koduj

ą

cych – genów (markery I klasy)

zmiany pojedynczych nukleotydów -

SNP

(single

nucleotide polymorphism) wykrywane przy u

ż

yciu

endonukleaz – enzymów restrykcyjnych technik

ą

RFLP (polimorfizm długo

ś

ci fragmentów

restrykcyjnych)

RFLP

(polimorfizm długo

ś

ci fragmentów restrykcyjnych)

• Zasada:

– specyficzno

ść

trawienia przez enzym restrykcyjny zale

ż

y

od tego, czy w danej sekwencji nukleotydów nie wyst

ą

piła

mutacja

• Cel:

– identyfikacja mutacji punktowej w obr

ę

bie sekwencji

rozpoznawanej przez okre

ś

lony enzym restrykcyjny

• Etapy:

– amplifikacja fragmentu DNA (technika PCR)

– trawienie DNA wybranym enzymem restrykcyjnym

– elektroforeza fragmentów DNA

Enzymy restrykcyjne (endonukleazy)

Pochodz

ą

z komórek bakteryjnych, w których

słu

żą

do obrony przed obcym DNA (np.

bakteriofagów)

Rozcinaj

ą

cz

ą

steczk

ę

DNA po rozpoznaniu

charakterystycznej dla danego enzymu
sekwencji nukleotydów

Trawienie DNA przez endonukleazy

enzym rozpoznaje sekwencj

ę

CGCG i rozcina j

ą

mi

ę

dzy

zasadami G i C

np. enzym Tha I

sekwencja niezmieniona – enzym rozpoznaje sekwencj

ę

i tnie ła

ń

cuch

5` …CGCG…. 3`

5`..CG CG..3`

3` …GCGC…. 5`

3`..GC GC..5`

sekwencja zmutowana – enzym nie rozpoznaje sekwencji, brak ci

ę

cia

5` …CG

A

G…. 3`

3` …GCGC…. 5`

Mutacja punktowa (zmiana sekwencji nukleotydów)

mo

ż

e spowodowa

ć

1.

zanik istniej

ą

cego miejsca restrykcyjnego

(rozpoznawanego wcze

ś

niej przez dany enzym)

2. pojawienie si

ę

nowego miejsca restrykcyjnego

W zale

ż

no

ś

ci od sytuacji powstaje nowy układ mo

ż

liwy

do identyfikacji przy u

ż

yciu enzymu restrykcyjnego, a co

wa

ż

niejsze ró

ż

nicuj

ą

cy osobniki w populacji

Rozdzia

ł

elektroforetyczny produktu PCR (659 pz) dla

genu RYR1; M – marker wielko

ś

ci GeneRuler™ 50 bp

DNA

600pz

M

Test molekularny (PCR-RFLP)

Analiza restrykcyjna produktów PCR dla genu receptora

rianodyny (

ś

winia domowa)

M – marker wielko

ś

ci DNA GeneRuler™ 50 bp.

Ś

cie

ż

ki 1 – produkt PCR (659

pz), 2 i 7 – genotyp CC (524 pz, 135 pz), 2 – genotyp CT (524 pz, 358 pz, 166

pz, 135 pz), 4, 5 i 6 – genotyp TT (358 pz, 166 pz, 135 pz.(Enzym

restrykcyjny – Alw 21I)

600pz

M

1

2

3

4

5

6

7

524pz
358pz

166pz

135pz

klasa II

sekwencje niekoduj

ą

ce –

głównie powtarzalne

sekwencje

mikrosatelitarne

, w

mniejszym stopniu

minisatelitarne

analiza sekwencji DNA

Polimorfizm (wielopostaciowo

ść

)

sekwencji niekoduj

ą

cych - zmienna

liczba powtórze

ń

tandemowych

(markery klasy II)

Polimorfizm sekwencji powtarzaj

ą

cych si

ę

tandemowo

Sekwencje powtarzaj

ą

ce si

ę

tandemowo

(wielokrotne powtórzenie okre

ś

lonego motywu – sekwencji

DNA, jeden za drugim, w ró

ż

nych miejscach genomu)

– sekwencje

mikrosatelitarne (do 10 nukleotydów

)

– sekwencje

minisatelitarne (> 10 nukleotydów

)

Sekwencje

minisatelitarne

- odcisk

palca DNA (DNA fingerprint)

Polimorfizm jest wykrywany metod

ą

hybrydyzacji

– izolacja całkowitego DNA z komórki

– trawienie genomowego DNA wybranym enzymem restrykcyjnym

– elektroforeza

– hybrydyzacja DNA z wyznakowan

ą

sond

ą

dla danej sekwencji

– detekcja obrazu na kliszy radiograficznej

*

sekwencja minisatelitarna : np. GGGAGGTGGGCAGGAGG

*

*

*

*

*

+

_

*

Polimorfizm sekwencji minisatelitarnych -

równoczesna analiza wielu loci - „odcisk

palca DNA”

Elektroforeza DNA + hybrydyzacja z sond

ą

*

*

*

*

Identyfikacja

ś

ladów

biologicznych

Dowód: plama krwi na

miejscu przest

ę

pstwa

(

bloodstain

)

1-6 profil DNA sze

ś

ciu

podejrzanych

Sekwencje

mikrosatelitarne

• Tandemowe

powtórzenia kilku

nukleotydów (najcz

ęś

ciej 2 - 4)

5’

CACACA

CACACACACA 3’

3’ GTGTGTGTGTGTGTGT 5’

Allel A (CA)

8

5’ CACACACACACACACACACA 3’

3’ GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT 5’

Allel B (CA)

10

Sekwencje mikrosatelitarne

• Wyst

ę

puj

ą

w wielu miejscach genomu (w

intronach, eksonach i promotorach genów)

• odró

ż

niane s

ą

od siebie dzi

ę

ki sekwencjom

„flankuj

ą

cym” (ograniczaj

ą

cym), które maj

ą

unikalny układ nukleotydów

Sekwencje flankuj

ą

ce (organiczaj

ą

ce)

sekwencje mikrosatelitarne

…….AACGTTGGATC

CACACACACACACACACACA

TGGTCAAGGGTTAA……

Sekwencje mikrosatelitarne

• najliczniejsza grupa markerów klasy II (wysoki

stopie

ń

polimorfizmu i równomierne rozproszenie

w genomie)

• polimorfizm identyfikuje si

ę

poprzez amplifikacj

ę

odcinka DNA metod

ą

PCR i odczyt wyniku na

ż

elu lub poprzez elektroforez

ę

(zazwyczaj

prowadzona w automatycznym sekwenatorze)

Markery genetyczne w hodowli

zwierz

ą

t

Wykorzystanie markerów

genetycznych w hodowli zwierz

ą

t

• Kontrola pochodzenia

• Identyfikacja markerów sprz

ęż

onych z genami

kontroluj

ą

cymi istotne cechy hodowlane

(markerowe mapy genomu)

• Ocena zmienno

ś

ci genetycznej wewn

ą

trz i mi

ę

dzy

populacjami (dystans genetyczny, poziom hetero-
i homozygotyczno

ś

ci, zmiany zachodz

ą

ce w

strukturze genetycznej populacji)

Kontrola pochodzenia przy pomocy

markerów genetycznych

w fenotypie/genotypie potomka musz

ą

wyst

ą

pi

ć

warianty/alele pochodz

ą

ce

od rodziców, niezgodno

ść

cho

ć

by w jednym locus czyni układ niemo

ż

liwym

Kontrola pochodzenia przy pomocy

markerów genetycznych

• Ustalenie fenotypu osobnika i jego domniemanych

rodziców (układy grupowe krwi z wieloma
antygenami np. B u bydła – 40 antygenów)

• Okre

ś

lenie (na ile to mo

ż

liwe) genotypu osobników

– trudne w przypadku grup krwi (fenogrupy)

– łatwe w przypadku polimorfizmu białek i

sekwencji mikrosatelitarnych DNA

• Porównanie fenotypu i genotypu osobnika z

fenotypami i genotypami domniemanych rodziców

Przykładowe zestawienie danych dot kontroli pochodzenia

Charon & Switonski 2004

Kontrola pochodzenia przy pomocy

markerów genetycznych

• Wykluczenie pochodzenia

:

– je

ś

li w genotypie (fenotypie) potomka wyst

ą

pi

ą

inne allele (lub antygeny - fenotyp) ni

ż

stwierdzone u domniemanych rodziców

• Wyst

ą

pienie zgodno

ś

ci genotypu

(fenotypu) osobnika

z genotypem (fenotypem) domniemanych rodziców
pozwala stwierdzi

ć

,

ż

e

nie ma podstaw do

wykluczenia pochodzenia

z prawdopodobie

ń

stwem:

– ponad 99% - je

ś

li badano ok. 10 polimorficznych

loci mikrosatelitarnych

Analiza dziedziczenia alleli sekwencji mikrosatelitarnej

(pozycja 2319) w rodzinie lisa pospolitego

(elektroforeza w

ż

elu poliakrylamidowym)

339pz

220pz

marker
DNA

AA BC AB AB

AC

M

3 allele:

A - 235 pz

B - 243pz

C - 263pz

AA

BC

AB

AB

AC

Dziedziczenie alleli sekwencji mikrosatelitarnej

2319 w rodzinie lisa pospolitego

(analiza w automatycznym sekwenatorze)