Inżynieria genetyczna - zespół technik pozwalających na badanie procesów dziedziczenia i ekspresji informacji genetycznej na poziomie molekularnym i submolekularnym
Markery molekularne są to:
rozdzielone w polu elektrycznym fragmenty DNA lub polipeptydy, wykazujący polimorfizm genetyczny
mapowane cechy nie będące genami.
Markery molekularne winny się cechować:
silnym polimorfizmem
dziedziczeniem kodominującym
wysoką frekwencją i równomiernym rozłożeniem w genomie
powtarzalnością prostą metodą wykrywalności
Mapowanie genomów
Mapowanie genetyczne - dotyczy konstruowania map pokazujących pozycję genów i innych charakterystycznych sekwencji w genomie
Mapowanie fizyczne - konstruowanie map z wykorzystaniem technik biologii molekularnej (badania cząstek DNA) umożliwiające pokazanie pozycji różnych typów sekwencji z genami włącznie.
W mapowaniu genetycznym wykorzystuje się krzyżowanie organizmów i analizę rodowodów
Obecnie jako markery używa się nie tylko geny, lecz markery DNA
Podstawą mapowania genetycznego jest obliczanie częstości rekombinacji
Mapa genetyczna musi pokazywać pozycje poszczególnych genów w stosunku do określonych wyznaczników (markerów)
Mapowane cechy nie będące genami nazywa się markerami DNA. Tak jak markery genowe, aby były użyteczne muszą występować w przynajmniej dwóch formach allelicznych.
Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)
RFLP były pierwszymi badanymi typami markerów DNA. Fragmenty restrykcyjne powstają, gdy na cząsteczkę DNA działa się endonukleazą restrykcyjną, enzymem tnącym DNA w określonych sekwencjach, np.
5'GAATTC-3'
3'CTTAAG-5'
Niektóre miejsca restrykcyjne są polimorficzne, występują jako dwa allele: jeden allel o prawidłowej sekwencji dla miejsca restrykcyjnego, cięty enzymem podczas trawienia DNA i drugim allelu nierozpoznawalnym przez endonukleazę. W drugim przypadku dwa graniczące fragmenty restrykcyjne po traktowaniu enzymem pozostają ze sobą złączone , co prowadzi do polimorfizmu długości. Jeżeli różnice genetyczne dwu osobników dotyczą długości fragmentu powstałego po enzymatycznym trawieniu DNA, to powstałe różnej długości fragmenty można rozdzielić za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym. Odzwierciedleniem zróżnicowania genetycznego badanych genotypów jest występowanie różnego wzoru identyfikowanych fragmentów restrykcyjnych.
Polimorfizm markerów RFLP może wynikać zarówno z pojedynczych zmian nukleotydów jak i zmian obejmujących większe fragmenty DNA.
Identyfikacja hybrydyzujących fragmentów DNA odbywa się metodą autoradiografii bądź innymi metodami.
MARKERY UZYSKIWANE W METODZIE PCR
Miejsca znaczone sekwencyjnie (STS)
Marker STS jest fragmentem długości 200-300 par zasad otrzymywany metodą PCR z użyciem specyficznych starterów. Startery są projektowane na podstawie znajomości sekwencji całego fragmentu
Proste sekwencje powtarzalne (SSR, STS)
Genomy roślinne charakteryzuje obecność licznych powtórzeń sekwencji tandemowych. Szczególnie przydatne są tzw. mikrosatelity, składające się z wielokrotnie powtórzonych krótkich sekwencji np. (AT) , ( A) (T), itd. Mikrosatelity są rozmieszczone równomiernie na wszystkich chromosomach, wykazują silny polimorfizm pod względem długości, warunkowany różną liczbą powtórzeń sekwencji podstawowej. Każdy SSR jest oflankowany unikatowymi sekwencjami
"Odcisk palca" genotypów roślinnych
W metodzie tej generuje się obrazy prążkowe wynikające z długości DNA między sekwencjami mikrosatelitarnymi
Losowo amplifikowany polimorficzny DNA (RAPD)
Reakcja amplifikacji prowadzona jest z użyciem jednego, najczęściej 10 nukleotydowego startera o dowolnie wybranej sekwencji, co pozwala uzyskać do kilkunastu produktów. Fragmenty rozdziela się elektroforetycznie
Markery molekularne są wykorzystywane do tworzenia map genetycznych i fizycznych. Na chromosomach lokalizuje się zarówno cechy jakościowe (QTL) jak i ilościowe.
PCR stwarza możliwość badania kwasów nukleinowych, pochodzących ze znikomo małych ilości materiałów. Służy wielokrotnemu powielaniu niezmiernie małych próbek materiału genetycznego. PCR znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach biologicznych, medycznych, kryminalistyce.
Przebieg łańcuchowej reakcji polimerazowej
Po przeprowadzeniu około 30 cykli zmian temperatury i trwającym około 1,5 godzinnym procesie fragment, który stanowił np. mniej niż 1 milionową część DNA może być reprezentowany 98 % mieszaniny. Dokładna ilość zależy od wielu czynników. Pragnąc powielić wybrany odcinek genu musimy dokonać syntezy starterów liczących po około 20 nukleotydów. Istnieje ponad bilion różnych sekwencji dwudziestomerów, co zapewnia unikalność tej sekwencji w organizmach. PCR prowadzi do powielenia wybranego fragmentu nici DNA (od 5 kb do 40 kb). Reakcję przeprowadza się mieszając ze sobą cząsteczki DNA stanowiącej matryce z: nukleotydami, dwoma starterami i termostabilną polimerazą DNA (odpornej na denaturację). Dwa startery muszą przyłączyć się do obu końcy namnażanych fragmentów DNA .
W pierwszym etapie procecu nić DNA, po działaniu temperaturą około 90 stopni rozpada się na pojedyncze nici. Drugim etapem jest ochłodzenie mieszaniny do temp. około 50 stopni, w której to temperaturze startery odnajdują komplementarne do ich sekwencji odcinki genomu. Po dodaniu termostabilnej polimerazy i podwyższeniu temperatury do około 72 stopni następuje synteza nowych nici. Kolejne podwyższenie temperatury do około 90 stopni rozpoczyna kolejny cykl namnażania DNA.
ELEKTROFOREZA W ŻELU
Jest to standardowa metoda rozdziału cząsteczek DNA różnej długości.
Elektroforeza to przemieszczanie się naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym . Ujemnie naładowane cząsteczki wędrują w kierunku elektrody dodatniej, a dodatnio naładowane w kierunku elektrody ujemnej. Elektroforezę przeprowadza się w żelu . Żel jest siecią porów przez które cząsteczki DNA muszą się przeciskać aby dotrzeć do dodatniej elektrody. Krótsze cząsteczki są słabiej zatrzymywane przez pory niż cząsteczki dłuższe , a więc wędrują przez żel krócej. Cząsteczki różnej wielkości tworzą na żelu prążki