Inżynieria Biomedyczna i Radiacyjna

BIOMATERIAŁY

LABORATORIUM

Ćwiczenie

Matryce do regeneracji tkanki kostnej

Ćwiczenie wykonali:

Magdalena Ambroziak

Małgorzata Baran

Magdalena Ciekańska

Ewelina Kalinowska

Andrzej Miłek

Magdalena Olejniczak

Piotr Pesta

Anna Piecyk

Justyna Wojtkiewicz

Data wykonania ćwiczenia: 22.10.2010

WPROWADZENIE

Kości stanowią podstawowy element budulcowy szkieletu człowieka. Składają się głównie z tkanki kostnej, która charakteryzuje się bogatym unaczynieniem i unerwieniem oraz zmiennością w czasie życia człowieka.

Układ kostny pełni bardzo istotne funkcje, dlatego ważne jest jego prawidłowe funkcjonowanie oraz budowa, która często bywa zakłócana poprzez różnego rodzaju ubytki, urazy, pęknięcia czy zwyrodnienia.

Z punktu widzenia medycyny leczenie zmian kostnych jest niezwykle trudne, gdyż wymaga ogromnej precyzji, a w przypadku przeszczepów - biozgodności oraz odpowiedniej struktury wszczepianego implantu.

Dlatego metodą najczęściej stosowaną są autoprzeszczepy kości - przeszczepy tkanki kostnej w obrębie jednego organizmu, dokonywane z miejsc o mniejszych obciążeniach do miejsc, gdzie występują ubytki.

Wykonanie takiego przeszczepu nie zawsze jest jednak możliwe, dlatego alternatywne dla tej metody jest wykorzystanie biomateriałów jako rusztowania do hodowli komórek kostnych i wszczepianie pacjentom biozgodnych układów: porowata matryca - komórki kostne.

Przetestowano różnego rodzaju biomateriały i jako potencjalne źródło matryc najlepiej sprawdzają się układy polimerowe i hydrożelowe. Wymagane jest jednak, by materiały te były biodegradowalne (po wszczepieniu powinny stopniowo ulegać wchłanianiu przez organizm i być zastępowane właściwą, narastającą początkowo na nich tkanką kostną), a także by charakteryzowały się możliwie dużą porowatością. Duża ilość, wielkość oraz głębokość porów, a także ich wzajemnie połączenie zwiększają efektywną powierzchnię przyłączania komórek kostnych, pozwalają na swobodną ich penetrację do wnętrza matrycy oraz umożliwiają wszystkim komórkom dostęp do dostarczanych składników odżywczych, niezbędnych dla prawidłowego wzrostu, funkcjonowania i namnażania się. Korzystne jest także tworzenie przez biomateriał stabilnej struktury trójwymiarowej oraz odpowiednie właściwości mechaniczne - istotne jest by wytworzoną na tego typu matrycy tkankę charakteryzowały właściwości możliwie najbardziej zbliżone do tkanki organicznej, którą mają zastąpić.

Jako potencjalne źródło dla hodowli tkankowej badane są syntetyczne biopolimery, głównie liniowe alifatyczne poliestry, polikwasy mlekowy (PLA) czy glikolowy (PGA), a także ich kopolimery. Zaletą wymienionych polimerów jest sprawdzona wcześniej biokompatybilność i biodegradowalność (rozkładają się odpowiednio do kwasów mlekowego i glikolowego) oraz korzystna, z punktu widzenia procedury wytwarzania porowatych skafoldów, do implantów struktura włóknista, mikrosferowa czy warstwowa.

Szczególnym typem polimerów są hydrożele - bazujące głównie na glikolu polietylenowym oraz jego kopolimerach. Znaczącą zaletą tych materiałów jest ich wewnętrzne usieciowanie pozwalające na wiązanie dużych ilości wody między łańcuchami - daje to możliwość wypełniania ubytków tkanki kostnej o nieregularnym kształcie, problem stanowi natomiast osiągnięcie wysokiego stopnia biodegradowalności.

Bardzo wskazane jest także, by bioskafoldy do hodowli komórek kostnych posiadały mikrostrukturę możliwie zbliżoną do mikrostruktury tkanki kostnej w skali nano- (tzn. rzędu 50 - 500 nm)

Porowata struktura matrycy polimerowej z naszczepionymi wzrastającymi komórkami kostnymi (osteocyty)

Technologia wytwarzania skafoldów

Technologia wytwarzania wysoce porowatych matryc polimerowych obejmuje na obecnym etapie trzy podstawowe metody:

• metodę wypełniania solą i odmywania

• metodę separacji fazowej

• metodę podgrzewania z dodatkiem porogenów.

Metoda wypełniania solą i odmywania

• polega na sporządzeniu mieszaniny stopionego polimeru ze zmieloną solą na ciepło i wymywaniu przez wodę soli z polimeru po wystygnięciu układu

• porowatość matrycy można regulować proporcjami wagowymi między polimerem i solą oraz stopniem rozdrobnienia ziaren soli

Metoda separacji fazowej

• polega na wprowadzaniu organicznego roztworu polimeru pod ciśnieniem do naczynia z wodą, gdzie następuje dyfuzja rozpuszczalnika organicznego i wytrącanie polimeru w formie włókien, które po wymieszaniu ulegają splątaniu tworząc trójwymiarową matrycę; nadmiar rozpuszczalnika usuwany jest poprzez wielokrotne moczenie matrycy w wodzie lub osuszanie próżniowe

Metoda podgrzewania z dodatkiem porogenów

• polega na wprowadzeniu soli łatwo ulegającej rozkładowi termicznemu do stopionego polimeru i ogrzewaniu powstałego układu polimer - porogen do temperatury przekraczającej temperaturę rozkładu soli, w której powinny zacząć powstawać w matrycy bąbelki gazu (późniejsze pory).

CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia było wykonanie porowatych matryc na bazie Poli(ε-polikaprolaktonu) - PCL oraz zbadanie ich porowatości.

PRZEBIEG ĆWICZENIA

1. Przygotowanie 21% roztworu PCL w acetonie w temperaturze 40^oC.

2. Umieszczenie czystego roztworu PCL w metalowej formie, ulokowanej na dnie szklanego niskiego naczynia, zalanie wodą dejonizowaną i pozostawienie do dalszych obserwacji oraz do wytrącenia polimeru.

3. Przygotowanie past polimerowych z przygotowanego roztworu PCL oraz porogenu (NaCl) o różnej wielkości ziaren i w różnych proporcjach wagowych.

Próbka	Rozmiar ziaren porogenu (NaCl) - średnica [μm]	Stosunek wagowy NaCl : PCL
1	<125	1 : 1
2	125 - 250	1 : 1
3	250 - 500	1 : 1
4			2 : 1

4. Wykonanie analogicznych czynności jak w przypadku czystego PCL dla przygotowanych past.

5. Usunięcie ze wszystkich próbek foremek po wytrąceniu polimeru.

6. Przepłukanie otrzymanych kostek kompozytu czystą wodą w celu wypłukania pozostałości porogenu oraz wysuszenie ich pod próżnią.

7. Zważenie otrzymanych próbek kompozytu oraz określenie ich geometrii.

WYNIKI DOŚWIADCZENIA

Rozmiar ziaren porogenu (NaCl) (średnica) [μm]	Stosunek wagowy NaCl : PCL	Geometria kostek polimeru (długości krawędzi)			Masa kostki polimerowej m [g]
				a [cm]		b [cm]	c [cm]
		<125	1 : 1	0,887	1,307	1,302	0,2968
				1,055	1,116	0,511	0,2302
				0,579	1,185	1,179	0,26
				1,321	1,165	0,697	0,211
				0,761	1,294	1,356	0,2272
PCL czysty		1,504	1,536	1,047	0,5774
				0,983	1,492	1,527	0,436
				1,376	1,362	0,843	0,4383
				1,498	1,432	0,906	0,6443
				0,717	1,354	1,355	0,3527
125 - 250	2 : 1	0,824	1,413	1,412	0,4867
				1,194	1,26	0,814	0,3875
				0,827	1,345	1,378	0,5585
				0,798	1,361	1,294	0,5934
				0,861	1,227	1,252	0,4255
		<125	2 : 1	0,936	1,408	1,443	0,376
				0,427	1,399	1,385	0,208
				0,818	1,377	1,346	0,3168
				0,681	1,154	1,203	0,2727
				1,312	1,383	0,677	0,2567

OPRACOWANIE WYNIKÓW

1. Obliczenie objętości otrzymanych kostek polimerowych, na podstawie zmierzonej geometrii i wzoru:

2. Obliczenie gęstości otrzymanych kształtek, na podstawie zależności:

3. Obliczenie porowatości otrzymanych struktur, w oparciu o równanie:

Rozmiar ziaren porogenu (NaCl) (średnica) [μm]	Stosunek wagowy NaCl : PCL	Masa kostki polimerowej m [g]	Objętość kostki polimerowej V [cm^3]	Gęstość struktury d	Porowatość struktury P [%]
<125	1 : 1	0,2968	1,509	0,197	82,17
				0,2302	0,602	0,383	65,31
				0,26	0,809	0,321	70,86
				0,211	1,073	0,197	82,17
				0,2272	1,335	0,170	84,57
PCL czysty		0,5774	2,419	0,239	78,36
				0,436	2,240	0,195	82,35
				0,4383	1,580	0,277	74,85
				0,6443	1,943	0,332	69,94
				0,3527	1,315	0,268	75,69
125 - 250	2 : 1	0,4867	1,644	0,296	73,16
				0,3875	1,225	0,316	71,31
				0,5585	1,533	0,364	66,97
				0,5934	1,405	0,422	61,72
				0,4255	1,323	0,322	70,83
		<125	2 : 1	0,376	1,902	0,198	82,07
				0,208	0,827	0,251	77,21
				0,3168	1,516	0,209	81,06
				0,2727	0,945	0,288	73,85
				0,2567	1,228	0,209	81,05

4. Obliczenie średnich arytmetycznych dla danych wielkości porogenu wartości porowatości wraz z odpowiadającymi im odchyleniami standardowymi

Rozmiar ziaren porogenu (NaCl) (średnica) [μm]	Stosunek wagowy NaCl : PCL	Średnia porowatość struktury P [%]	Odchylenie standardowe ΔP [%]
<125	1 : 1	77,02	8,44
PCL czysty		76,24	4,57
125 - 250	2 : 1	68,80	4,55
<125	2 : 1	79,05	3,45

PODSUMOWANIE

• Wykonane ćwiczenie pozwoliło nam dokonać analizy, w jaki sposób wielkość ziaren porogenu oraz skład wagowy matrycy (stosunek masowy NaCl : PCL) wpływa na porowatość otrzymywanych matryc polimerowych:

• im mniejsze ziarna porogenu, a tym samym większa ich ilość w jednostce masy, tym większa jest porowatość matrycy polimerowej

• im większa zawartość masowa porogenu w stosunku do zawartości PCL w matrycy, tym większa jej porowatość.

• Ponieważ z praktycznego punktu widzenia istotne jest wytwarzanie struktur wysoce porowatych, wskazane jest używanie porogenu o jak najmniejszych średnicach cząstek oraz w proporcjach przewyższających ilość polimeru (stosunek porogen : polimer porogen > polimer).

• Na wielkość, liczebność oraz przestrzenne rozmieszczenie porów w matrycy wpływają przede wszystkim zawartość porogenu w stosunku do polimerowego budulca matrycy oraz stopień rozdrobnienia jego ziaren - zwiększaniu porowatości struktur sprzyjają następujące czynniki:

• duże rozdrobnienia ziaren porogenu - małe średnice ziaren powodują, że w jednostce masy ziaren jest więcej

• przewaga ilości porogenu w składzie wagowym matrycy polimerowej.

BIBLIOGRAFIA

• http://www.mif.pg.gda.pl/homepages/maria/pdf/INM_13.pdf

• http://www.mitr.p.lodz.pl/biomat/scaffold.html

• Instrukcja laboratoryjna

---