10. ELEMENTY GENETYKI MOLEKULARNEJ CYKLU ROZWOJOWEGO

(EVO - DEVO)

Analiza skamienialosci wykazuje, ze w okresie kambryjskim (miedzy 490 a 545 milionow lat temu) nastapila eksplozja form zwierzecych.. Takie formy jak mieczaki, stawonogi, szkarlupnie, strunowce czy pierscienice pojawiaja sie w tym okresie po raz pierwszy. W okresie wczesniejszym (pozny neoproteozoik) spotyka sie w zasadzie slady gabek (porifera) oraz jamochlonow (cnidaria) (Ryc. 10-1). Zwierzeta dwuboczne (bilateria) pojawily sie wiec prawdopodobnie w tym okresie - prawdopodobnie, poniewaz slady zwierzat pelzajacych (a wiec nie wykluczone, ze dwubocznych) spotyka sie w okresie prekambryjskim.

Zwierzeta, ktore pojawily sie w kambrze maja charakterystyczny plan budowy ciala. Sa one mianowicie zbudowane z elementow modularnych, powtarzajacych sie wielokrotnie lecz zroznicowanych, takich jak segmenty u owadow i skorupiakow czy zeby u ssakow (u gadow zeby sa w zasadzie jednakowe, u ssakow rozroznia sie kly, siekacze, zeby przedtrzonowe i trzonowe). Ewolucja struktury organizmu polega glownie na modyfikacji tych elementow:

1. Podczas ewolucji moze zmieniac sie ilosc elementow modularnych. I tak np. liczba kregow u kregowcow jest zmienna: weze moga miec kilkaset, zaby kilka. Rowniez liczba segmentow moze wynosic kilkanascie u owadow a kilkadziesiat u stonogi.

2. Elementy szeregowo homologiczne ulegaja roznicowaniu. U owadow czolki, odnoza, elementy aparatu gebowego i genitaliow sa homologiczne. U kregowcow wyroznia sie rozne typy kregow.

3. Roznicowaniu ulegaja elementy homologiczne "rownolegle" a wiec u roznych gatunkow zwierzat. Skrzydla ptakow czy nietoperza, pletwy wieloryba, przedramie czlowieka, konczyny przednie czworonogow sa homologiczne (Ryc. 10-2).

4. Podczas ewolucji pojawiaja sie i ewoluuja "wynalazki" takie jak futro, piora, rogi, zeby czy plamy na skrzydlach u motyli.

Rozne komorki w roznych organach maja swoja morfologie. Roznicowanie komorek organizmu odbywa sie przez selektywna ekspresje tysiecy genow w komorkach roznych tkanek. Dyryguje nia specyficzny program, ktorego cechy i strukture dopiero niedawno zaczeto poznawac.

Genetyczny program cyklu rozwojowego. Program, ktory kontroluje wiekszosc cech planu ciala zwierzat jest realizowany przez zespol genow poznanych wpierw u owadow. Sa to zawsze albo czynniki transkrypcyjne, dzialajace w obrebie jednej komorki w jadrze komorkowym i bedace skladnikami kompleksu transkrypcyjnego albo bialka biorace udzial w transdukcji sygnalu, dzialajace w cytoplazmie, na powierzchni blony komorkowej, lub dyfundujace z komorki na zewnatrz. Podstawowe elementy modelu wyjasniajacego dzialanie programu cyklu rozwojowego zostaly zidentyfikowane na dlugo przed tym zanim zrozumiano jego funkcjonowanie na poziomie molekularnym. Naleza do nich

Organizatory - sa to regiony embrionu albo tkanki, ktore wplywaja na budowe i funkcje otaczajacych komorek i tkanek. Transplantacja organizatora z jednego miejsca w inne powoduje powstanie dodatkowych organow oraz przeorganizowanie sie osi embrionu. Istnienie organizatorow wykazano u owadow (Ryc 10-3). Podobne obserwacje dokonano rowniez na embrionach kregowcow. (Ryc. 10-4).

Morfogeny - sa to substancje, produkowane przez organizatory, ktore w zaleznosci od stezenia powoduja rozne skutki w komorkach otaczajacych zrodlo morfogenu. I tak np. wykazano, ze u owadow budowa embrionu zalezy m. in. od dwoch centrow organizacji, przedniego i tylnego (anterior, posterior). Podobnie polarnosc komorek wewnatrz segmentow u owadow jest wynikiem gradientu substancji sygnalizujacych. Trudno bylo wyjasnic dlaczego, mimo, ze wszystkie komorki w embrionie sa w kontakcie, jedne reaguja a inne nie reaguja na obecnosc morfogenu. Wyjasnienie postuluje istnienie pol morfogenetycznych.

Pole morfogenetyczne jest to przestrzen w ktorej funkcjonuje pewna czesc programu cyklu rozwojowego. Jesli np. wyciac maly skrawek tkanki poczwarki motyla z miejsca, ktore u doroslego owada odpowiada centrum plamki na skrzydle (organizator plamki), a nastepnie przeszczepic ten skrawek w inne miejsce, to naogol przeszczep taki sie przyjmuje. Wynik zalezy od tego w ktore miejsce na przyszlym skrzydle dokonano przeszczepu (Ryc. 10 - 3). Jesli przeszczepu dokonano w miejsce znajdujace sie przy nasadzie skrzydla to plama nie pojawi sie (niewlasciwe pole morfogenetyczne). Jesli jest to miejsce blizej krawedzi skrzydla to plama sie pojawi. To, czy na skrzydle pojawi sie duza czy mala plama zalezy od tego czy wycinek pobrano z miejsca odpowiadajacego plamie duzej czy malej (komorki czesci centralnej plamki duzej produkuja wiecej morfogenu niz komorki centralne plamki malej i dlatego dyfundujac powoduje on powstanie wiekszej plamy). W kazdym przypadku pobranie wycinka z miejsca odpowiadajacego centrum plamy powoduje, ze u doroslego owada na skrzydla nie pojawi sie w tym miejscu plama (zrodlo morfogenu zostaje usuniete). Pole morfogenetyczne moze ulec rowniez transplantacji. Zawiazki organow sa przykladem pol morfogenetycznych. Mozna powiedziec, ze istnieje wiele poziomow pol. Polem zerowego rzedu jest caly embrion, polami pierwszego rzedu sa np. segmenty owada, polami drugiego rzedy sa zawiazki organow, polem trzeciego rzedu sa czesci organow. itp.

Dalszy postep w zrozumieniu funkcjonowania organizatorow, pol morfogenetycznych i morfogenow stal sie mozliwy dzieki odkryciu genow, ktorych produkty byly odpowiedzialne za te funkcje a wiec kontrolowaly tworzenie sie i charakter pol morfogenetycznych.

Geny programu cyklu rozwojowego. Geny rzadzace programem cyklu rozwojowego zostaly zidentyfikowane wpierw u drosofili w ten sposob, ze otrzymano mutanty, ktore zmienialy ksztalt i funkcje czesci ciala (Ryc 10-5) oraz zmienialy ekspresje pewnych bialek. Glowne cechy tych genow to

1. Sa czynnikami transkrypcyjnymi lub elementami skladowymi ukladow transdukcji sygnalu.

2. Ekspresja ich jest przestrzennie i czasowo ograniczona.

3. Moga byc scharakteryzowane przez fenotyp mutantow. Mutacje w genach funkcjonujacych w tej samej sciezce cyklu rozwojowego daja podobne fenotypy.

4. Geny programu cyklu rozwojowego sa zachowane w roznych liniach filogenetycznych powstalych w czasie ewolucji organizmow. Jest ich stosunkowo niewiele.

Ekspresja genow programu cyklu rozwojowego zalezy od stezenia bialek regulatorowych. Stwierdza sie dwojakiego rodzaju zaleznosci. W pierwszym przypadku ekspresja jest stopniowana (zwiekszana lub zmniejszana) w zaleznosci od intensywnosci sygnalu. W drugim przypadku ekspresja jest inicjowana przez sygnal o intensywnosci progowej, po czym juz nie zalezy od intensywnosci sygnalu. W regulacji ekspresji genu biora udzial zarowno represory jak i aktywatory. Wiele genow regulowanych jest przez dwa lub wiecej aktywatory lub represory. Aktywacja genow programu cyklu rozwojowego posiada scisle okreslona hierarchie regulacyjna. I tak geny matczyne ulegaja ekspresji wzdluz calego embrionu, geny gap w przedziale o szerokosci 15 - 20 komorek, geny pair rule w przedziale o szerokosci 3 - 4 komorek natomiast geny segment polarity w przedziale o szerokosci 1 - 2 komorki. Istnieje rowniez program ekspresji w czasie.

Tworzenie sie osi organizmu przod/tyl. Drosofila rozwija sie z jaja (Ryc.10-6). W pierwszym etapie rozwoju jadro komorkowe ulega kolejnym cyklom replikacji. Po 1.25 godziny od chwili startu cyklu rozwojowego w cytoplazmie znajduje sie 128 jader (2⁷). Po dwu godzinach embrion zawiera ponad 1500 jader i jest jeszcze w formie syncytium. Wtedy zaczynaja sie dopiero tworzyc komorki. Po 2.5 godzinach od startu embrion ma 500 m dlugosci i 170 m srednicy i zawiera 5000 komorek. O losach kazdej z tych komorek decyduje jej polozenie. Zakladajac ze komorki leza na powierzchni walca o grubosci jednej komorki pozycja pary komorek polozonych z lewej i z prawej strony walca jest jednoznacznie okreslona wspolrzednymi na osiach przod-tyl (Anterior/Posterior, A/P) i grzbiet-brzuch (Dorsal/Ventral, D/V). Informacja o pozycji kazdej komorki jest zawarta poczatkowo w gradiencie produktow translacji mRNA produkowanego w organizmie matki, ktore umieszcza ona w embrionie. Te mRNA sa spisywane z genow, ktore nazywane sa genami matczynymi. (maternal effect, Ryc. 10 - 7 i 10 - 8) System wspolrzednych A/P tworzy sie w wyniku istnienia czterech poziomow regulacji.

1. Geny matczyne odpowiadaja za gradient czynnikow transkrypcyjnych wzdluz embrionu (Ryc. 10 - 9).

2. Geny gap (przedzialu) definiuja bardziej precyzyjnie czesci embrionu z ktorych tworzy sie glowa tulow i odwlok (Ryc. 10 - 10).

3. Geny pair-rule (reguly-par) definiuja siedem segmentow w embrionie (Ryc. 10 - 11).

4. Geny segment polarity (polarnosci segmentow) (Ryc. 10 - 11) sa odpowiedzialne za powstanie czternastu segmentow ciala owada. Produkty genow segment polarity sa z reguly bialkami sciezki transdukcji sygnalu (Ryc. 10 - 12), w odroznieniu od produktow genow pair rule bedacych czynnikami transkrypcyjnymi.

Ad 1. Utworzenie gradientu matczynych czynnikow transkrypcyjnych. Jajo zawiera jedno jadro. W przednim biegunie jaja znajduje sie RNA matczyne spisane z genu bcd (bicoid). Nastepuje tam translacja i dyfuzja bialka w strone bieguna tylnego. RNA jest zahaczone koncem 5' regionu nie ulegajacego translacji do szkieletu komorkowego (cytoskeleton) i nie moze samo dyfundowac. U drosofili w ustaleniu osi przod-tyl biora udzial trzy inne geny matczyne. Wszystkie sa wstrzykiwane w postaci mRNA do przedniego bieguna jaja z tym, ze mRNA z ktorego spisuje sie bialko Nos (nanos) jest transportowane do bieguna tylnego, zahacza sie do szkieletu i tam ulega translacji. Natomiast mRNA spisane z genow hunchback (hb) i caudal (cad) sa rozmieszczone w cytoplazmie. Translacja tych mRNA jest regulowana przez produkty genow bcd i nos (ktorymi sa bialka Bcd i Nos). Bialko Nos wiaze sie z mRNA spisanego z genu hb i inhibuje jego translacje, natomiast translacja mRNA spisanego z genu cad jest inhibowana przez bialko Bcd. W pozniejszej fazie cyklu rozwojowego gen Hb zygotyczny (nie matczyny) jest aktywowany przez bialko Bcd, ktore wiaze sie w sposob kooperatywny do kilku miejsc w regionie regulatorowym tego genu (w tym przypadku mRNA jest syntetyzowany na wlasnych genach embrionu a nie genach matczynych).

Ad 2. Geny Gap sa pierwszymi genami zygotycznymi, ktore ulegaja ekspresji w embrionie. Rozne geny Gap sa transkrybowane w roznych regionach embrionu w zaleznosci od poziomu bialek Bcd, Cad i Hb (Ryc. 10 - 10, 10-13).

Ad 3. Szereg bialek ulega w embrionie ekspresji w ten sposob, ze powstaje w nim wzor siedmiu prazkow (a raczej pierscieni). Na poczatku badan ekspresji genow cyklu rozwojowego bylo niezrozumiale w jaki sposob ekspresja genow gap i genow matczynych, ktore nie maja charakteru periodycznego daje periodyczna ekspresje genow pair-rule. Po zsekwencjonowaniu tych genow i ustaleniu ich struktury okazalo sie, ze ekspresja w kazdym prazku jest regulowana przez inny system regulacji. I tak np. siedem prazkow ekspresji genu eve (even skipped - "parzysty wypada") jest wynikiem istnienia siedmiu oddzielnych regionow regulatorowych (Ryc. 10-14). Kazdy z tych regionow zawiera kilka miejsc wiazania czynnikow transkrypcyjnych, aktywatorow lub represorow. W sumie gen eve ulega ekspresji w siedmiu prazkach, kazdy o szerokosci 3,4 komorek.

Ad 4. Regulacja genow segment polarity poprzez bialka pair-rule. Geny segment polarity sa odpowiedzialne za powstanie czternastu prazkow w embrionie i w larwie. Transkrypcja tych genow jest regulowana przez produkty genow pair rule. Poza tym istnieje wzajemna regulacja. Na przyklad geny wingless (wg) i hedgehog (hh) maja szczegolna ekspresje. Bialko Hh jest produkowane we wszystkich tylnych komorkach kazdego segmentu, ktore to komorki produkuja rowniez bialko Engrailed. Hh sygnalizuje komorkom z przodu, przez transducery, ze maja uruchomic transkrypcje genu wingless, ktory, rowniez przez transducery przesyla informacje do komorek tylnych utrzymujaca aktywnosc genu Hh oraz en (Ryc. 10-15).

Tworzenie sie osi grzbietowo brzusznej organizmu. (Ryc. 10-16) Grzbietowo brzuszna os wspolrzednych (dorsal/ventral, D/V) jest zapewniona przez gradient szeregu matczynych czynnikow transkrypcyjnych, z ktorych najlepiej poznanym jest produkt genu dorsal (dl). Najwieksze stezenie bialka dorsal stwierdza sie w komorkach brzusznych, mniejsze w bocznych, nie znaleziono go w komorkach tkanek grzbietu. Szereg genow zygotycznych jest regulowanych przez bialko dl i ich ekspresja zachodzi przy roznych stezeniach progowych tego bialka. Np. gen snail ma powinowactwo do tego bialka i ulega ekspresji tylko w komorkach brzusznych. Ekspresja genu rhomboid jest aktywowana przez mniejsze stezenie bialka dl poniewaz elementy regulatorowe maja wieksze powiniwactwo do bialka dl, ale jest inhibowana przez bialko snail. W wyniku tych oddzialywan (aktywacja malym stezeniem bialka dl i represja bialkiem snail) gen rhomboid ulega ekspresji tylko w komorkach boczno-brzusznych. Geny zygotyczne decapentaplegic (dpp), zerknült (zen), short gastrulation (sog), twist (twi) i snail (sna) biora rowniez udzial w powstaniu tej osi. Ponadto geny Delta (Dl) i Notch (N), aktywne w komorkach nerwowych, biora udzial w podzieleniu osi D/V na podregiony.

Selektory specyficznosci regionalnej segmentow. Sposrod genow kontroli cyklu rozwojowego pierwsze zostaly poznane te, ktore kontroluja charakter segmentow ciala muchy drosofili. Nazwano je genami Hox. W 1915 roku Calvin Bridges otrzymal spontanicznego mutanta, w ktorym przezmianki zmutowaly w druga pare skrzydel (Ryc. 10-5). Przezmianki i skrzydla sa szeregowo homologiczne a wiec mutacja ta (bithorax) powoduje czesciowa transformacje jednej struktury szeregowo homologicznej w inna. Bardziej kompletna transformacja (ultrabithorax) daje czteroskrzydla muche. Inna spektakularna mutacja (w genie antenapedia) powoduje zmiane czolek w odnoza. Kierunek transformacji zalezy od tego czy mutacja powoduje utrate funkcji genu homeotycznego czy tez pojawienie sie tej funkcji w polu morfogenetycznym w ktorym normalnie jej nie ma. Gen Ubx dziala w przezmiankach i powoduje ich wyksztalcenie sie. Wypadniecie tej funkcji powoduje pojawienie sie w tym miejscu skrzydel. Jesli natomiast spowoduje sie ekspresje genu Antp w polu morfogenetycznym, w ktorym normalnie jego ekspresja nie zachodzi, a w ktorym ksztaltuja sie czolki, powoduje to ich przeksztalcenie sie ich w odnoza. Fascynujaca cecha genow homeotycznych jest to, ze jedna mutacja powoduje dramatyczna zmiane w planie budowy ciala zwierzecia a ponadto ze jedna z czesci ciala zwierzecia staje sie podobna do drugiej. Ekspresja genow Hox jest wiec zwiazana z roznicami pomiedzy segmentami. Np. kazda para nog owada ma nieco inna morfologie. Wykazano, ze pierwsza para ma morfologie zalezna od genu Scr, druga para od genu Antp a trzecia od genu Ubx. Zarowno czolki jak i czesci aparatu gebowego i odnozy rozwijaja sie z seryjnie homologicznych pol morfogenetycznych. W nieobecnosci genow Hox wszystkie te pola rozwinelyby sie w czolki. Geny Hox sa wiec selektorami specyficznosci regionalnej segmentu. Nie one jednak odpowiedzialne sa za samo tworzenie sie segmentow. O tym decyduja geny matczyne, gap, pair-rule i segment polarity. Geny Hox decyduja tylko o tym w jakie tkanki rozwina sie komorki w odpowiednich polach morfogenetycznych segmentow

Ekspresja genow Hox wplywa na specyficznosc segmentow zarowno w embrionie larwy i doroslego owada (ryc. 10 - 17). Grupuje sie te geny w dwa kompleksy Ubx i Antp, ktore oprocz genow Ultrabithorax i Antenapedia zawieraja geny labial (lab), proboscipedia (pb), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr), abdominal-a (abd-A) i Abdominal-B (Abd-B). Naogol calkowita utrata funkcji genu Hox jest letalna. W naturze spotyka sie zwykle utrate czesciowa.

Kolejnosc segmentow w ciele owada jest taka sama jak kolejnosc genow Hox kodujacych bialka regulujace strukture i funkcje tych segmentow. Ten efekt nazywa sie kolinearnoscia. Transkrypcja RNA oraz obecnosc bialek kodowanych przez geny Hox byla badana bardzo szczegolowo. Stwierdzono, ze ich ekspresja zachodzi w przestrzennie ograniczonych domenach u drosofili zarowno w embrionach jak i w larwach oraz u doroslego owada. Zazwyczaj tylko w pewnych segmentach owada a mianowicie w tych, ktore ulegaja zmianie u mutantow. Np. gen Ubx ulega ekspresji w przednim segmencie odwloka i w tylnym segmencie tulowia. Te wlasnie segmenty sa zmienione przez mutacje Ubx. Brak ekspresji Ubx powoduje przeksztalcenie sie przezmianek w skrzydla. Granice ekspresji nie pokrywaja sie jednak z granicami segmentow. Zaczyna sie ona zwykle w tylnej czesci jednego segmentu i kontynuuje w przedniej czesci nastepnego segmentu. Ta jednostka ekspresji nazywa sie parasegmentem.

Podobienstwo funkcji genow Hox znajduje odbicie w podobienstwie ich struktury. Bialka kodowane przez te geny wiaza sie z DNA w sposob specyficzny do sekwencji i kontroluja ekspresje genow. Motyw homeobox zawarty jest w 20 roznych genach.

Geny Hox sa aktywowane w szerokiej domenie dwoch lub wiecej parasegmentow.Wewnatrz domeny ma miejsce modulacja poziomu ekspresji. Ekspresja zachodzi zarowno w komorkach mezo jak i endodermy. W cyklu rozwojowym nastepuja zmiany ekspresji tych genow. Jest ona regulowana na kilku poziomach.

Za trzy pierwsze poziomy regulacji ekspresji genow Hox odpowiedzialne sa trzy klasy genow zygotycznych gap, pair rule i segment polarity. Czwarty poziom regulacji dokonuje sie z zastosowaniem bialek kodowanych przez geny Hox (represja ekspresji jednego genu przez produkt drugiego). Piaty poziom to autoregulacja na zasadzie sprzezenia zwrotnego ujemnego (produkty genow Hox hamuja swoja wlasna ekspresje). Szosty poziom regulacji to regulacja struktury chromatyny przez produkty genow polycomb (represor) i trithorax (aktywator). Dzialaja one przez utworzenie heterochromatyny lub euchromatyny. Istnieje specyficzna sekwencja nukleotydow zwana "polycomb response element", ktora wiaze sie z bialkiem polycomb posiadajacym chromodomene, podobnie jak bialko HP1 wystepujace w heterochromatynie kregowcow (patrz rozdzial 8). Bialko polycomb tworzy heterochromatyne w regionie chromosomu o dlugosci dziesiatkow kb inaktywujac geny, ktore tam sie znajduja. Ta sytuacja jest dziedziczna komorkowo (dziedziczenie epigenetyczne).

Pola morfogenetyczne drugiego rzedu. Kiedy juz system wspolrzednych A/D i D/V zostal ustalony i na niego nalozony zostal system ekspresji genow Hox poprzedzony ekspresja genow gap, pair rule i segment polarity, nastepuje utworzenie drugorzedowych pol morfogenetycznych, ktore zwiazane sa z rozwojem roznych organow i tkanek. A wiec program regulacji cyklu rozwojowego zwierzecia ustala w embrionie pozycje zawiazkow organow takich jak slinianki, serce, konczyny lub narzady lotu, na zasadzie analogicznej jak ustala sie pozycje geograficzna mierzac wspolrzedne punktu na kuli ziemskiej. W przypadku embrionu, zaleznie od obecnosci i stezenia bialek sygnalizacyjnych w komorce, program ustala ekspresje lub represje odpowiednich genow.

Selektory specyficznosci pol morfogenetycznych organow. W obrebie kazdego segmentu znajduje sie szereg roznych organow, ktorych wyksztalcenie sie zalezy od produktow odpowiednich genow. Sposrod genow decydujacych o specyficznosci pol morfogenetycznych organow najlepiej poznany jest gen eyless (ey) (Ryc. 10 - 18). Jest to gen kodujacy czynnik transkrypcyjny odpowiedzialeny za wyksztalcenie sie oka. Mutacja w genie ey powoduje nieutworzenie sie oka. Jesli gen ten ulega ekspresji w innym polu morfogenetycznym z ktorego normalnie rozwija sie skrzydlo albo konczyna, to powoduje to rozwoj tkanki oka w tym polu. Jest on wiec glownym genem regulatorowym programu cyklu rozwojowego tkanki oka.

Gen Distal-less (Dll) jest odpowiedzialny za rozwoj zewnetrznych czesci wszystkich konczyn dolnych wliczajac w to nogi czesci aparatu gebowego, genitalia i czolki. Ekspresja tego genu w innych polach morfogenetycznych powoduje wyrastanie konczyn w niewlasciwych miejscach.

Geny vestigial (vg) i scalloped (sd) sa odpowiedzialne za tworzenie sie narzadow lotu, skrzydel i przezmianek. Bialko Sd wiaze sie z DNA w regionach regulatorowych, bialko Vg, ktore jest aktywatorem transkrypcji wiaze sie z bialkiem Sd. Jednak kompleks DNA-Vg-Sd nie wystarcza do aktywacji transkrypcji genu. Potrzebny jest jeszcze do tego dodatkowy sygnal, ktorym moze byc bialko produkowane w pewnych tylko komorkach skrzydla i ewentualnie w innych czesciach ciala, gdzie reguluje ekspresje zupelnie innych genow.

Do tych oddzialywan dochodza jeszcze oddzialywania produktow genow Hox. I tak np. w przypadku pola morfogenetycznego skrzydel bialko Ubx inhibuje ekspresje genu wg. W wyniku dzialania bialka Ubx pole morfogenetyczne homologiczne do rozwijajacego sie skrzydla rozwija sie w przezmianki.

Pola odpowiadajace konczynom i narzadom lotu rozwijaja sie z malych populacji okolo 20 komorek, ktore zawdzieczaja swoja specyficznosc aktywacji odpowiednich genow. I tak gen Dll (Distal-less) ulega ekspresji w komorkach zawiazkow konczyn (Ryc. 10-19). Jego ekspresja jest stymulowana przez produkt genu wingles (wg), ktory nalezy do genow segment polarity i jest bialkiem sygnalizacyjnym. Wydzielany jest przez komorki polozone w tylnej czesci kazdego z 14 parasegmentow. Jednak gen Dll nie ulega ekspresji wszedzie tam gdzie zachodzi ekspresja genu wg poniewaz jest ona inhibowana przez produkty genow Ubx i abd-A (a wiec Dll nie ulega ekspresji w przednich segmentach odwloka i w ostatnim segmencie tulowia). Produkt genu dorsal, ktory ulega ekspresji w komorkach brzusznych inhibuje ekspresje genu Decapentaplegic (Dpp) A wiec Dpp ulega ekspresji w komorkach grzbietowych a jego produkt powoduje z kolei inhibicje genu Dll. Tak wiec gen Dll nie ulega ekspresji w komorkach grzbietowych. W komorkach brzusznych natomiast jego ekspresja jest rowniez blokowana, ale przez inne bialko, ktore jest produktem genu spi (spitz). W wyniku tych oddzialywan bialko Dll pojawia sie tylko w komorkach boczno brzusznych i tylko w segmentach glowy i tulowia.

Tworzenie sie osi wspolrzednych w polach drugiego rzedu. W miare jak pola morfogenetyczne drugiego rzedu (takie jak zawiazki organow) rosna, zaczyna sie ich roznicowanie i tworza sie w nich nowe uklady wspolrzednych, ktore stanowia podstawe dla morfogenezy powstajacych organow. Najlepiej poznany jest program regulujacy powstawanie skrzydla u drosofili. Skrzydlo rozwija sie z dysku, ktory zwiera okolo 30 komorek po pierwszej wylince. W tych komorkach, podczas ich namnazania, nastepuje: (a) zroznicowanie pola od innych seryjnie homologicznych pol, (b) utworzenie nowego ukladu wspolrzednych, oraz (c) ustalenie pozycji elementow skladowych tego pola morfogenetycznego. Procesy te zachodza w sposob podobny jak to mialo miejsce u calego owada. Pierwszy zestaw bialek regulatorowych stanowia bialka sygnalizacyjne (morfogeny) dlugodystansowe i krotkodystansowe, ktore okreslaja powierzchnie w obrebie skrzydla, w ktorych pewne geny sa aktywowane lub ulegaja represji. Sygnaly te definiuja (podobnie jak w calym owadzie) uklad osi wspolrzednych przod-tyl A/P i grzbiet-brzuch (D/V), a takze dodatkowo trzecia os wspolrzednych blisko-daleko (proximodistal, P/D). Drugi zestaw to regulatorow to selektory, ktore kontroluja specyficzna odpowiedz na sygnaly pierwszej grupy, zaleznie od komorek i od pola morfogenetycznego. Tozsamosc seryjnie homologicznych pol jest okreslona przez trzecia grupe genow specyficznych dla okreslonych pol morfogenetycznych, takich jak geny Hox lub podobne.

Os wspolrzednych A/P w skrzydle powstaje w wyniku funkcjonowanie bialek Engrailed, Hedgehog i Dpp (Ryc 10 - 20). Komorki tylne i przednie skrzydla rozwijaja sie w dwoch liniach klonalnych. W komorkach tylnych (posterior) gen engrailed (en) ulega ekspresji, a w przednich nie. W skrzydle istnieje ostra granica pomiedzy tymi dwoma typami komorek. Dzieki aktywnosci regulatorowej genu en komorki tylne syntetyzuja krotkodystansowe bialko sygnalizacyjne Hedgehog (Hh). Komorki przednie syntetyzuja bialko Patched, ktore jest receptorem Hh. Transdukcja bialka Hh indukuje w komorkach granicznych bialko Dpp, ktore dyfunduje w dwoch kierunkach dzialajac jako morfogen. Reguluje ono ekspresje genow w sposob zalezny od stezenia. Os wspolrzednych D/V powstaje na tej samej zasadzie, z tym, ze bialkiem, ktore roznicuje linie komorek dorsal od linii ventral jest bialko Apterous, produkowane w komorkach polozonych grzbietowo. Apterous reguluje ekspresje bialek Serrate i Fringe. Te dwa bialka z kolei reaguja z uniwersalnie produkowanym bialkiem Notch. To z kolei jest przyczyna ekspresji bialka Wingless przez komorki lezace na granicy pomiedzy powierzchniami dorsal i ventral. Bialko Wg jest morfogenem. Dyfunduje ono do obu powierzchni i reguluje ekspresje innych genow w zaleznosci od stezenia. Os P/D jest utworzona przez bialko Dll, ktore jest produkowane przez komorki najbardziej oddalone od tulowia (distal).

Selektory specyficznosci komorkowej. Sa to geny, ktore ulegaja ekspresji w niektorych komorkach pol morfogenetycznych organow. Na przyklad cztery geny kompleksu Achaete-Scute Complex (AS-C) sa zwiazane z tworzeniem neuronow. Te geny sa odpowiedzialne za charakter komorek w tkance. Dwa geny nautilus i DMEF-2 zwiazane sa z roznicowaniem komorek miesni.

Ewolucja genow Hox (ryc. 10 - 21). Sposrod genow bioracych udzial w cyklu rozwojowym zwierzat najlepiej poznana jest rodzina genow Hox. Mozna wiec na jej przykladzie przesledzic ich ewolucje. Jamochlony (cnidaria) posiadaja dwa geny Hox, z ktorych jeden jest blizszy genom lab i pb (a wiec ulegajacym ekspresji w przednich segmentach drosofili), a drugi jest blizszy genowi Abd-B (ulegajacemu ekspresji w tylnych segmentach odwloka). Wszystkie zwierzeta dwuboczne maja, przynajmniej dwa geny grupy tylnej, piec genow grupy srodkowej (Dfd - abd-A) i kilka genow grupy przedniej. Wynika z tego, ze wspolny przodek wszystkich dwubocznych mial przynajmniej siedem genow Hox i ze przynajmniej piec z nich pojawilo sie zanim nastapilo oddzielenie sie linii filogenetycznej prowadzacej do wspolczesnych dwubocznych. Zwazywszy, ze geny Hox wykazuja znaczny stopien homologii, lokus w ktorym sa one zgrupowane ma charakter sekwencji powtarzajacej. Z tego wzgledu wzglednie latwo ulegaja one nierownomiernemu procesowi crossing-over w wyniku ktorego jeden produkt rekombinacji zawiera wiecej "powtorzen" niz substrat a drugi produkt mniej (patrz ryc. 5-17d). Slady takiej ekspansji i kontrakcji rodziny Hox obserwuje sie w genomach licznych zwierzat. U nicieni (nematoda) np. stwierdza sie obecnosc tylko dwoch genow grupy srodkowej. Poniewaz zwierzeta, ktore oddzielily sie wczesniej od linii filogenetycznej prowadzacej do nematoda (np. szkarlupnie) maja wiecej genow tej grupy, podobnie jak zwierzeta, ktore oddzielily sie pozniej, nalezy przypuszczac, ze u przodkow nicieni zaszla delecja czesci srodkowych genow Hox. Moze sie to wiazac z uproszczeniem budowy ich ciala, jako ze sa to czesto pasozyty, ktorych czesc funkcji zyciowych zapewnia gospodarz.

Druga ekspancja genow Hox nastapila w wyniku dwoch nastepujacych po sobie duplikacji (lub w wyniku tetraploidyzacji) w genomie przodkow kregowcow. Wynika to z porownania rodzin tych genow u kregowcow z genami Hox u cephalochordata (np. lancetnik). Geny Hox kregowcow po tetraploidyzacji ulegly zroznicowaniu, po czym niektore z nich zmienily funkcie a niektore ulegly delecji. Komplikacja w budowie ciala zwierzat obserwowana podczas ewolucji jest wiec wynikiem komplikacji w strukturze genow regulacji cyklu rozwojowego. Natomiast roznicowanie morfologiczne nie ma zadnego zwiazku z organizacja i liczebnoscia rodziny genow tej klasy. U ssakow, ptakow oraz plazow znaleziono te same ortologiczne geny Hox w liczbie 39, ktore to geny biora udzial w budowaniu struktur organizmu zaowno u kolibra jak i slonia.

Niektore z genow cyklu rozwojowego zachowaly swoja funkcje przez setki milionow lat. Na przyklad mysi gen Pax6 jest ortologiczny z genem eyless u drosofili i obydwa odpowiadaja za uksztaltowanie sie oczu u tych zwierzat. Wydaje sie prawdopodobne, ze gen ten mial podobna funkcje u przodkow dwubocznych zwanych "urbilateria". Nie znaczy to ze zwierzeta ta mialy oczy takie jak drosofila czy jak mysz, ale wydaje sie prawdopodobne, ze mialy jakis organ swiatloczuly, w ktorego uformowaniu bral udzial wspolny przodek genu ey i Pax6. Dotyczy to rownez genu dll, ktory jest odpowiedzialny za uksztaltowanie sie organow zewnetrznych zarowno u drosofili jak i u myszy.

176

157

Ryc 10-1. Drzewo filogenetyczne metazoa. Rycina przedstawia trzy klady zwierzat dwybocznych Deuterostomata, Lophotrochozoa i Ecdyzoa

Ryc. 10-2. Roznicowanie struktur homologicznych. Konczyny przednie kregowcow sa strukturami homologicznymi, ktorych anatomia ulegla ewolucji i adaptacji w roznych liniach filogenetycznych

Ryc. 10-3. Organizatory w skrzydlach motyla. A. Ognisko (czesc centralna) tylnej plamy (Fp) zostalo przetransplantowane w pozycje "e". Po prawej przeszczep w powiekszeniu. B. Ogniska plam przedniej i tylnej zostaly zamienione co powoduje zamiane srednicy plam. Po prawej, skrzydlo kontrolne. C. Ognisko przedniej plamy przeniesione w pozycje "e". D. Transplantacja skrawka okoloogniskowego(PrF) w pozycje "e" nie powoduje pojawienia sie plamy. E. Ognisko tylnej plamy przeniesione w okolice u nasady skrzydla nie powoduje pojawienia sie plamy.

Ryc. 10-4. Wyniki transplantacji organizatorow w embrionach kurczecia.

Ryc. 10-5. Mutanty homeotyczne u drosofili. U gory szczep dziki, ponizej potrojny mutatnt w genie Ultrabithorax na dole mutant w genie Antennapedia.

Ryc 10-17. Geny Hox u drosofili i wzor ekspresji tych genow w embrionie oraz u doroslego owada.

Ryc. 10-18. Geny selektorowe (a) specyficzne dla okreslonych czesci ciala drosofili. (b) w embrionie i w zawiazkach organow stwierdza sie ekspresje odpowiednich genow selektorowych

Ryc. 10-6. Pierwsze etapy rozwojowe drosofili.

Ryc. 10-8. Fenotypy mutantow w genach kontrolujacych polarnosc embrionu drosofili.

Ryc. 10-7. Fenotypy potomkow mutantow w genach matczynych.

Ryc. 10-10. Ekspresja genow matczynych oraz genow gap w embrionie drosofili

Ryc. 10-9. Ekspresja morfogenow matczynych bicoid i nanos w embrionie drosofili.

Ryc 10-11. Ekspresja (a) genu gap (Krüppel), (b) genu pair rule (Hairy) i (c) genu segment polarity (engrailed) w embrionie drosofili.

Ryc 10-12. Transdukcja sygnalu. Typowe bialko sygnalizacyjne wiaze sie z receptorem na blonie komorkowej, co prowadzi do uwolnienia lub aktywacji (np. przez fosforylacje) bialka wewnatrz komorki. Aktywacja receptora powoduje czesto modyfikacje nieaktywnego czynnika transkrypcyjnego, ktory jest transportowany do jadra.

Ryc 10-13. Hierarchia regulacji segmentacji w embrionie drosofili. Z prawej wzor ekspresji genow w embrionie na roznych stadiach rozwojowych. Z prawej mozliwe oddzialywania biorace udzial w regulacji.

Ryc 10-14. Regulacja ekspresji genu eve w drugim prazku w embrionie drosofili. Element regulatorowy 2 kontroluje ekspresje w prazku 2. Zawiera on sekwencje regulatorowe oddzialywujace z produktami genow Hunchback i Bicoid, ktore sa aktywatorami eve oraz Krüppel i Giant, ktore maja funkcje represorow.

Ryc. 10-16. Os grzbietowo brzuszna. a) ekspresja roznych genow zygotycznych w roznych regionach embrionu. b) Bateria genow regulowanych przez produkt genu dorsal. c) Gradient produktu genu dorsal. Stezenie bialka Dorsal jest najwyzsze w komorkach brzusznych (V) a najnizsze w komorkach grzbietowych (D)

Ryc. 10-15. Regulacja genu segment polarity. Regulacja tych genow zachodzi w wyniku oddzialywan w ktorych posrednicza bialka sygnalizacyjne. Bialko sygnalizacyjne Hedgehog eksportowane z komorki w ktorej ulega ekspresji gen en indukuje ekspresje wg w komorce sasiedniej przy pomocy wieloetapowej sciezki sygnalizacyjnej hh. wg natomiast sygnalizuje swoja sciezka sygnalizacyjna informacje prowadzaca do ekspresji en.

Ryc. 10-19. Regulacja ekspresji genow selektorowych przez geny Hox oraz przez bialka sygnalizacyjne.

Ryc 10-20. Organizacja osi D/V i A/P w skrzydlach drosofili.

Ryc 10-21. Ewolucja genow Hox u metazoa. Cnidaria posiadaja tylko dwa geny odpowiadajace skrajnym genom Hox . Ewolucja Bilateria byla skorelowana z ekspansja centralnych genow Hox. We wczesnym okresie rozwoju kregowcow caly segment genow Hox ulegl duplikacji.

lancetnik

szkarlupnie

(jezowiec)

stawonogi

pratchawce

nicienie

pierscienice

mieczaki

plazince

parzydelkowce

jamochlony

kregowce

---