zasada metody

Ninhydryna w wyniku kilkuetapowej reakcji daje w obecności związków posiadających grupę a-karboksylową oraz a-
aminową niebieskofioletowy produkt - purpurę Ruhemanna

reakcja ksantoproteinowa Pierścień aromatyczny pod wpływem kwasu azotowego V ulega znitrowaniu. Nitrowe pochodne pierścieni aromatycznych mają w środowisku zasadowym zabarwienie pomarańczowe.

Reakcji Fola - reakcja charakterystyczna umożliwiająca identyfikację aminokwasów zawierających w łańcuchu bocznym grupę hydrosulfidową (-SH) (cysteina) lub wiązania dwusiarczkowe (-S-S-) (cystyna).

Do wykrywania tych aminokwasów służy zespół dwóch reakcji. Pierwsza z nich to rozkład badanego substratu w środowisku zasadowym w podwyższonej temperaturze.

W wyniku tej reakcji siarka (jony siarczkowe (S2-)) z jonami ołowiowymi (II) (Pb2+)(octan ołowiu(II)) tworzy siarczek ołowiu(II) (PbS) (czarny, nierozpuszczalny osad).

^Na₂S + (CH₃COOH)₂Pb → 2 CH₃COONa + PbS^↓

Metionina nie daje się wykryć w tej reakcji.

reakcja biuretowa Piotrowskiego Jony miedziowe w środowisku zasadowym tworzą fioletowy kompleks z co najmniej dwoma wiązaniami peptydowymi.

Rozdział barwników roslinnych technika cienkowarstwowej chromatografii

podziałowej (TLC - ^{thin layer chromatography)}

Faza stacjonarna o właściwościach sorpcyjnych (tu celuloza) jest umieszczona jako cienka warstwa na płytce szklanej. Substancje rozdzielane nanosi się punktowo przy dolnej krawędzi płytki, po czym płytkę umieszcza się w komorze chromatograficznej zanurzonej na kilka milimetrów w eluencie, tak by naniesione substancje nie zostały zanurzone. Eluent stopniowo wspina się po płytce dzięki zjawisku kapilarnemu. Powoduje to przemieszczanie się rozdzielanych substancji ku górze. Prędkość ruchu poszczególnych składników rozdzielanej mieszaniny jest zależna od oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi obecnymi w analizowanej próbce, a fazą rozdzielczą i eluentem. Prędkość ta jest więc inna dla każdej z substancji zawartej w analizowanej próbce.

1. Fotometryczne oznaczanie zawartości białka ^{Białko poddaje się reakcji biuretowej. Na podstawie absorbancji roztworu i krzywej wzorcowej określa się stężenie białka.}

Odsalanie roztworu białka metoda chromatografii sita molekularnego ^{Badaną mieszaninę rozdziela się na kolumnie z sefadeksu. Cząstki o dużej masie cząsteczkowej nie wnikają w mikropory więc szybko przemieszczają się przez wolne przestrzenie miedzy granulkami i wędrują w dół kolumny wraz z czołem rozpuszczalnika. Cząsteczki mniejsze (mniejsze od wielkości porów) wnikają do wnętrza porów i ich prędkość migracji jest znacznie mniejsza. Im cząsteczka mniejsza tym głębiej będzie penetrować pory granulek, tym wolniej będzie migrować przez złoże i tym później pojawi się ona w eluacie od cząsteczki większej od niej.}

przeprowadzono reakcje fosfatazy kwaśnej z różnymi stężeniami p-nitrofenylofosforanu w charakterze substratu. Na podstawie zmierzonej absorbancji obliczono ilość uwolnionego w reakcji 4-nitrofenolu. Pozwoliło to po dalszych obliczeniach sporządzić wykres Lineweavera - Burka oraz wyznaczyć stałą Km i Vmax

Stała Michaelisa (Km) - jest to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie szybkości maksymalnej (Vmax) tej reakcji

Równanie Michaelisa-Menten opisuje zależność szybkości reakcji od stężenia substratu:

Oznaczanie zawartości witaminy C w materiale roślinnym metodą miareczkową

2. Oksydymetrycznie (stosuje się mianowany roztwor utleniacza ) oznaczono ilość kwasu askorbinowego utleniając go za pomocą 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCIP). Zawartość kwasu askorbinowego obliczono z ilości zużytego mianowanego roztworu barwnika wykorzystując fakt że reakcja przebiega stchiometrycznie w stosunku 1:1

Reakcje charakterystyczne sacharydów

próbie Molischa. Nastąpiła zmiana barwy roztworu na fioletowy.

2.Próbie Benedicta poddano roztwór glukozy, maltozy, sacharozy i skrobi. glukoza i maltoza jako cukry redukujące dały w tej reakcji wynik pozytywny (ceglastoczerwony osad tlenku miezi(I).

3.Skrobie i sacharozę podano hydrolizie kwasowej. Następnie oba cukry potraktowano odczynnikiem Benedicta. Skrobia uległa rozkładowi do glukozy w związku z czym dała pozytywny wynik próby Benedicta. Sacharoza jako cukier nie redukujący dała wynik negatywny.

4.Glukozę i maltozę poddano reakcji Barfoeda. Glukoza dała pozytywny wynik (ceglastoczerwony osad) reakcji jako że jest monocukrem redukującym a maltoza jako dwucukier dała wynik negatywny.

5.Fruktozę i glukozę poddano reakcji Seliwanowa. Fruktoza dała wynik pozytywny (czerwony osad) reakcji jako że jest ketozą a glukoza negatywny.

6.Arabinozę i glukozę poddano reakcji Biala. Arabinoza dała pozytywny wynik (zielony roztwór) reak
cji jako że jest pentozą a glukoza negatywny.

Aktywność enzymów amylolitycznych - Metoda z heksacyjanożelazianem (III) potasu

Heksacyjanożelazian (III) potasu redukując się do heksacyjanożelazian (II) potasu traci barwę żółtą pozwala wykryć produkty hydrolizy skrobi: dekstryny, oligosacharydy oraz glukozę.

K₃Fe(CN)₆ + cukry redukujące → K₄Fe(CN)₆

żółty → bezbarwny

Ilościowe oznaczenie glikogenu oraz badanie niektórych jego właściwości

kreślenie powstałej podczas hydrolizy glikogenu glukozy odbywa się dzięki właściwością redukującym glukozy. Zredukowana miedź (Cu²⁺ do Cu⁺) daje barwny (niebieski) roztwór, w wyniku reakcji odczynnikiem Nelsona, w ilości proporcjonalnej do powstałej ilości glukozy

Glukoza+Cu²⁺ -(OH^-)→Cu₂^IO

Cu^IO+odczynnik aresenomolibdenowy (Nelsona) → błękit molibdenowy (niebieski)

aktywność proteolityczna trypsyny określana jest w metodzie Ansona na podstawie powstałych w wyniku proteolizy kazeiny: tyrozyny i tryptofanu rozpuszczalne w kwasie tricholooctowym. Aminokwsy wykrywane są odczynnikiem Folina redukowanego do błękitu fosforanumolibdenowgo. Absorbancje powstałego roztworu mierzy się przy 670nm

aktywność aminotransferazy asparaginianowej mierzy się ilości wytworzonego szczawiooctanu (a z niego pirogronianu) przy użyciu dehydrogenaz

Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej polega na pomiarze ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych z lipidów mleka pod działaniem lipazy trzustkowej w temp. 37°C i początkowym pH 7.7, którego wartość z upływem czasu ulega niewielkiemu obniżeniu (do pH 7.0) w wyniku uwalniania kwasów tłuszczowych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych oznacza się przez miareczkowanie mieszaniny inkubacyjnej mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego wobec fenoloftaleiny. W opisanej metodzie, dopiero po 60 minutach inkubacji uzyskuje się proporcjonalność między ilością wyciągu trzustkowego a szybkością reakcji.

3. wytrącanie kwasów nukleinowych z roztworu wodnego

1. zasada metody: reakcja Biala - rekcja pozwala wykryć pentozy w nukleotydach purynowych

pentoza+odczynnik Biala → furfural → orcyna→ barwny kompleks

4. reakcja Dischego W środowisku kwaśnym deoksyryboza (wolna lub w nukleotydach purynowych) tworzy z difenyloaminą produkt kondensacji o barwie niebieskiej.

5. wykrywanie tyminy Reakcja na obecność tyminy, odróżniająca oba typy kwasów nukleinowych (DNA i RNA), polega na wytworzeniu przez te zasadę z diazowa pochodna kwasu sulfanilowego kompleksu o barwie czerwonobrunatnej; a dodatek hydroksyloaminy, w środowisko zasadowym wzmacnia barwę kompleksu.

obserwacje: w probówce z badaną substancją nastąpiła zmiana barwy na czerwonobrunatną

Reakcja na obecność fosforanów polega na łączeniu się molibdenianu amonowego z jonem fosforanowym, w wyniku, czego powstaje nierozpuszczalny fosfomolibdenian amonu, żółto zabarwiony osad.

obserwacje: w probówce z badaną substancją nastąpiła zmiana barwy na żółtą - zawiera kwasy fosforanowe

Glikogen - polisacharyd (wielocukier), którego cząsteczki zbudowane są z połączonych ok. 100000 reszt D-glukozy (C6H12O6). W organizmach zwierzęcych jest gromadzony w wątrobie, w mniejszym stężeniu występuje też w tkance mięśni poprzecznie prążkowanych (szkieletowych).

Jest głównym wielocukrem, który stanowi materiał zapasowy w komórkach zwierzęcych. Ma strukturę podobną do amylopektyny, tylko, że jego cząsteczki są bardziej rozgałęzione i jego łańcuchy są krótsze.

Cząsteczki glukozy w prostym łańcuchu połączone są wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. Rozgałęzienie tworzone jest co 8-12 monomerów przez wiązanie α-1,6-glikozydowe. Glikogen w miarę potrzeby może być szybko rozkładany do glukozy i w przeciwieństwie do tłuszczów, uwalniana glukoza może być źródłem energii w przemianach beztlenowych. Do najbogatszych w ten materiał zapasowy narządów należą wątroba (10% jej masy) i mięśnie (łącznie ok. 2% wszystkich). Glikogen występuje w postaci ziaren o średnicy 10-40 nm zawieszonych w cytoplazmie.

Rozkład glikogenu (glikogenoliza) przebiega dwoma torami: fosforolitycznym i hydrolitycznym. Rozkład ten jest indukowany działaniem glukagonu (hormon produkowany przez komórki α trzustki), a jego skutkiem jest podniesienie poziomu cukru we krwi. Rozkład glikogenu w wątrobie spowodowany jest zapotrzebowaniem organizmu w cukier. Odwrotny proces zachodzi w momencie oddziaływania insuliny (antagonistyczny hormon glukagonu), kiedy to zachodzi wiązanie glukozy z krwi w glikogen w wątrobie.

klasy enzymów:

1) oksydoreduktazy

2) transferazy

3) hydrolazy

4) liazy

5) izomerazy

6) ligazy

fosfataza kwaśna EC 3.1.3.2 czyli 1.hydrolaza

Roślinne fosfatazy kwaśne, w większości są dimerami zbudowanymi z podjednostek o

charakterze glikoprotein i masie 50-60 kD. Występują w różnych organach roślin: w bulwach,

nasionach, warstwie aleuronowej ziarniaków, owocach, liścieniach, brodawkach

korzeniowych i liściach. Na terenie komórki fosfatazy kwaśne zlokalizowane są w cytosolu,

wakuolach lub ścianie komórkowej. Fosfatazy kwaśne charakteryzują się niską

specyficznością substratową. Mogą katalizować defosforylację różnych naturalnych

substratów, takich jak 3-fosfoglicerynian, fosfoenolopirogronian (PEP), fityna, ATP, czy

ufosforylowane na tyrozynie białka. Funkcje biochemiczne fosfataz kwaśych w komórkach

roślin nie zostały dokładnie poznane. Przypuszcza się, że uwalniają fosforan ze związków

organicznych w warunkach niedoboru fosforanów, w warunkach stresu zasolenia lub deficytu

wody, bądź w warunkach stresu wywołanego atakiem patogenów, w ontogenezie. Do

najbardziej poznanych enzymów roślinnych należą: fitaza jak również fosfatazy należące do

nadrodziny fosfataz tyrozynowych.

U zwierząt, fosfataza kwaśna jest enzymem obecnym głównie w lizosomach komórek

kości, gruczołu krokowego, jelit, trzustki i nerek, w płytkach krwi i krwinkach czerwonych.

Zwiększony poziom fosfatazy kwaśnej jest obserwowany w niektórych chorobach

nowotworowych.

Na ćwiczeniu będzie wykorzystany wodny wyciąg fosfatazy kwaśnej z siewek pszenżyta.

Jako substrat będzie zastosowany p-nitrofenylofosforan (pNPP). Reakcję hydrolizy tego

związku przedstawia rysunek1. Powstający produkt reakcji, p-nitrofenol (pNP), przyjmuje w

1środowisku zasadowym barwę żółtozieloną, a jego ilość jest miarą aktywności fosfatazy.

Podstawową jednostką jest jednostka uniwersalna ( standardowa. Za taką jednostkę przyjęto ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmola substratu w ciągu 1 min., w temperaturze 30°C i optymalnych warunkach pH oraz stężenia substratu.

Inhibicja allosteryczna - obniżenie aktywności katalitycznej enzymu w wyniku zmiany jego konformacji spowodowanej przyłączeniem się inhibitora do innego miejsca niż miejsce aktywne. W związku z brakiem współzawodnictwa substratu i inhibitora o miejsce aktywne, zwiększenie stężenia substratu nie może przezwyciężyć inhibicji. Inhibitor znacznie zmniejsza liczbę obrotów enzymu, nie ma wpływu na liczbę cząsteczek enzymu wiążących substrat.

W przypadku inhibicji allosterycznej obserwuje się brak zmiany wartości stałej Michaelisa (gdyż miejsc wiążących na enzymie dostępnych dla substratu jest tyle samo), przy jednoczesnym pomniejszeniu wartości szybkości maksymalnej (z powodu działania inhibitora, zmniejszającego szybkość reakcji katalizowanej przez enzym).

inhibicja kompetycyjna - współzawodnictwo inhibitora z substratem o miejsce aktywne enzymu; przy dużych stężeniach substratu inhibitor zostaje usunięty przez substrat. Przeciwieństwem inhibicji kompetycyjnej jest inhibicja niekompetycyjna. W inhibicji kompetycyjnej inhibitor wiąże się w miejscu aktywnym, inhibicji niekompetycyjnej - poza miejscem aktywnym.

Substrat i inhibitor współzawodniczą o miejsce katalityczne (aktywne), przez co zwiększenie stężenia substratu lub inhibitora, powoduje przesunięcie szybkości reakcji na szalę jednego z nich. Jeśli stężenie substratu będzie przewyższać stężenie inhibitora, to szybkość reakcji zmniejszy się nieznacznie bądź w ogóle nie ulegnie zmianie. Jeśli przeważać będzie ilość inhibitora w roztworze, to reakcja katalizowana ulegnie inhibicji czyli zmniejszeniu szybkości reakcji. W przypadku inhibicji kompetycyjnej powinowactwo enzymu do substratu ulega zmniejszeniu (stała Michaelisa rośnie).

Przykład: substratem dla dehydrogenazy bursztynianowej jest bursztynian, a jej inhibitorem kompetycyjnym malonian (związki te różnią się budową tylko o jedną grupę metylenową).

Inhibicja niekompetycyjna, hamowanie niekompetycyjne (niewspółzawodnicze) - typ inhibicji odwracalnej enzymów.

Inhibitor niekompetycyjny wiąże się w zupełnie innym miejscu enzymu niż centrum aktywne i centrum allosteryczne. Jeśli inhibitorem jest duża cząsteczka, zachodzi sytuacja, w której cząsteczka ta wiąże się do domeny białka zawierającej centrum aktywne. Wiązanie to nie wpływa na strukturę części enzymatycznej białka, ale zasłania wejście do centrum aktywnego, przez co enzym jest nieaktywny. W przypadku kiedy inhibitor przyłączy się tak, że będzie zasłaniał centrum tylko częściowo lub w ogóle, reakcja będzie zachodziła, jednakże wolniej.

Inhibitory niekompetycyjne nieodwracalne nie wykazują strukturalnego podobieństwa do substratu, zwiększenie stężenia substratu na ogół nie zmniejsza hamowania.

Metoda miareczkowa oznaczania kwasu askorbinowego polega na jego utlenieniu za pomocą mianowanego roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCIP). Jest to metoda oksydymetryczna, ponieważ stosuje się mianowany roztwór utleniacza. Zawartość kwasu askorbinowego oblicza się z ilości zużytego mianowanego roztworu barwnika, ponieważ reakcja przebiega stchiometrycznie w stosunku 1:1 Używany niebieski barwnik 2,6-dichlorofenoloindofenol w środowisku kwaśnym w formie utlenionej

jest różowy, a w formie zredukowanej bezbarwny. Trwała barwa różowa podczas miareczkowania

powstaje po całkowitym utlenieniu kwasu askorbinowego w momencie dodania pierwszej kropli

nadmiaru barwnika

sacharydy:

aldoheksoza - glukoza;

ketoheksoza - fruktoza;

aldopentoza - arabinoza;

disacharyd nieredukujący - sacharoza

disacharyd redukujący - maltoza

Reakcja Molischa W środowisku silnie kwaśnym cukier ulega odwodnieniu do furfuralu lub hydroksymetylofurfuralu, które kondensują z α-naftolem dając fioletowy produkt kondensacji - wykrywa cukry

Reakcja Benedicta - zachodzi w środowisku zasadowym, sprzyjającym przesunięciu równowagi między formą pierścieniową i łańcuchową sacharydu w kierunku reaktywnej formy łańcuchowej. W tych warunkach reakcji następuje utlenienie sacharydów redukujących do odpowiednich hydroksykwasów, a obecne w odczynniku Benedicta jony Cu2+ redukują się do jonów Cu+ wypadających z roztworu w postaci nierozpuszczalnego tlenku miedziawego(Cu2O). Obecny w odczynniku Benedicta cytrynian trisodowy zapobiega wytrącaniu się osadu Cu(OH)2, co moŜe nastąpić przy małej ilości cukru. wykrywa monosacharydy

Reakcja Barfoeda - redukcja jonów miedziowych Cu +2 do Cu + przeprowadzana jest w środowisku słabo kwaśnym, co powoduje znaczne obniŜenie reaktywności sacharydów Czerwony osad Cu20 powstaje w reakcji z monosacharydem wkrótce po ogrzaniu mieszaniny reakcyjnej. Reakcja ta pozwala na odróŜnienie monosacharydów od disacharydów redukujących.

Reakcja Biala - służy do odróżniania pentoz od heksoz. Pentozy przekształcają się w furfural kondensujący z orcynolem, w wyniku czego powstaje produkt o barwie zielonej

Reakcja Benedicta - dodatni odczyn w reakcji Benedicta dają tylko te disacharydy, w których jeden z monosacharydów ma wolny atom węgla anomerycznego. Ten monosacharyd moŜe przechodzić wówczas w formę łańcuchową i dzięki temu nadaje właściwości redukujące cząsteczce disacharydu. Disacharydy utworzone z dwóch cukrów prostych połączonych poprzez oba atomy węgli anomerycznych (np. sacharoza) nie wykazują właściwości redukujących ze względu na brak moŜliwości odtworzenia wolnej grupy karbonylowej.

Reakcja Barfoeda - ze względu na niŜszą reaktywność wolnych grup karbonylowych pozytywny wynik tej reakcji dla disacharydów redukujących moŜna jedynie uzyskać w wyniku dłuŜszego ich ogrzewania. Hydroliza kwasowa sacharozy - polega na rozpadzie sacharozy na cukry proste: glukozę i fruktozę pod wpływem kationów H+ i i podwyŜszonej temperatury.

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay), czyli test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny - jeden z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem. W podstawowej wersji testu ELISA, pewna ilość antygenu unieruchomiona jest na powierzchni fazy stałej. Wykonanie testu polega na wprowadzeniu materiału biologicznego zawierającego przeciwciała specyficzne dla unieruchomionego antygenu. Przeciwciała te powinny być uprzednio połączone wiązaniem kowalencyjnym z enzymem. Unieruchomiony antygen i specyficzne przeciwciało tworzą kompleks immunologiczny, dzięki któremu przeciwciało zostaje trwale związane z podłożem. Po przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu odpowiedniego substratu, enzym związany ze specyficznym przeciwciałem katalizuje reakcję, której produkt (najczęściej barwny) można oznaczyć spektrofotometrycznie.

Przeciwciała monoklonalne (mAb - ang. Monoclonal AntiBodies) - zbiór przeciwciał, które wykazują jednakową swoistość względem danego antygenu i ewentualnie takie samo lub podobne powinowactwo. Nazwa wywodzi się stąd, że wszystkie takie przeciwciała są otrzymywane z jednego klonu limfocytów B.

---