W3 - REGULACJA EKSPRESJI GENÓW

Złożoność naszego gatunku wynika nie tylko z liczby posiadanych genów (około 25 000), lecz także z bardzo skomplikowanej i precyzyjnej regulacji ich działania. Nadal pozostaje tajemnicą to, według jakiego programu działają nasze geny, jaki jest szczegółowy schemat ich ekspresji i jakie uruchamiają je sygnały. W 1961 roku odkryto istnienie mRNA i przedstawiono model regulacji działania genów, w którym RNA wiąże świat DNA ze światem białek, przekładając alfabet DNA na alfabet białek. Ta zasada stanowi tzw. centralny dogmat biologii. Główną funkcją RNA jest tłumaczenie informacji genetycznej z języka nukleotydów na język aminokwasów - RNA odgrywa rolę pośrednika między DNA i białkami. Za to odkrycie francuscy biolodzy Francois Jacobs i Jacques Monod otrzymali w 1965 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny.

I. Pojęcie ekspresji genów

Ekspresja genu to sposób realizacji informacji genetycznej - jej przekształcenie w RNA i białka: to sposób ujawniania się genu w postaci fenotypu. Ekspresja genu to wytwarzanie produktu genu (białka - polipeptydu lub funkcjonalnego RNA) zakodowanego w określonej sekwencji nukleotydów, czyli ekspresja genu to biosynteza białka (łańcucha polipeptydowego) kodowanego przez ten gen. Ekspresja genu to proces odczytywania tego genu, wyrażony stopniem jego aktywności, dlatego ekspresję genu określa się zarówno na poziomie mRNA, jak i na poziomie samego białka. Geny są przepisami na określone białka: każde białko to przetworzony (przetłumaczony) gen lub geny. Ekspresja genów prowadzi do powstania odpowiednich cech komórek i organizmu jako całości. Biosynteza białka odbywa się wewnątrz komórek w sposób nieciągły i z niejednakową intensywnością, bowiem białka są syntetyzowane w komórkach w miarę potrzeb. W każdej komórce ujawnia się tylko nieznaczna część wszystkich genów - różna w poszczególnych typach komórek, dlatego, że żadna komórka nigdy nie potrzebuje całej informacji genetycznej naraz. W różnych typach komórek danego organizmu są aktywowane różne geny: geny aktywne w określonym typie komórek mogą być nieaktywne w komórkach innego typu. Jednak istnieją geny konstytutywne (geny metabolizmu podstawowego, housekeeping genes) o nieregulowanej ekspresji, które są czynne - przynajmniej okresowo - we wszystkich lub w większości komórkach, bo ich produkty są niezbędne w każdej typowej komórce. Geny konstytutywne warunkują podstawowe funkcje komórki: kodują enzymy metabolizmu podstawowego, polimerazy RNA, enzymy naprawiające DNA, histony, rRNA, tRNA oraz elementy cytoszkieletu (mikrotubule i mikrofilamenty).

II. Ogólny schemat procesu biosyntezy białka

Biosynteza białka jest podstawowym procesem warunkującym istnienie wszystkich żywych organizmów. Ogólny schemat tego procesu jest taki sam dla każdej formy żywej i składa się z dwóch głównych etapów: transkrypcji i translacji.

Transkrypcja to proces przepisania (skopiowania na zasadzie komplementarności) informacji zawartej w sekwencji zasad w DNA na sekwencję zasad mRNA. W komórkach eukariotycznych transkrypcję przeprowadzają trzy polimerazy RNA: polimeraza I, która przepisuje w jąderku geny większości rRNA; polimeraza II, która przepisuje w nukleoplazmie geny wszystkich białek oraz geny niektórych snRNA i jest bardzo wrażliwa na -amanitynę (białkową toksynę wytwarzaną w muchomorze sromotnikowym Amanita phalloides - najsilniej trującym grzybie w Polsce, hamującą w wątrobie syntezę nowych białek, co doprowadza do nieodwracalnego uszkodzenia tego narządu) oraz polimeraza III, która przepisuje w nukleoplazmie geny tRNA, geny 5S rRNA i geny snRNA. W 2006 roku autora badań nad polimerazą II RNA, Amerykanina Rogera Kornberga, który wyjaśnił mechanizm działania tego enzymu, uhonorowano Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii.

Translacja to proces przełożenia (przetworzenia, przetłumaczenia) informacji zawartej w sekwencji zasad mRNA na uszeregowanie aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym: to proces syntezy polipeptydu. Translacja przekłada informację genetyczną z języka kwasów nukleinowych na język białek (łańcuchów polipeptydowych zbudowanych z aminokwasów).

W komórkach eukariotycznych występuje przestrzenny i czasowy rozdział transkrypcji od translacji.

Przełożenie informacji genetycznej z języka kwasów nukleinowych na język białek jest możliwe dzięki kodowi genetycznemu. Za rozszyfrowanie („złamanie”) kodu genetycznego amerykańscy biolodzy Har Gobind Khorana, Marshall Nirenberg i Robert W. Holley otrzymali w 1968 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny. Kod genetyczny to zestaw (system) reguł określających współzależność kodonów (tripletów nukleotydów w DNA lub RNA) z sekwencją aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Kod genetyczny dyktuje relacje między kodonami a aminokwasami: pozwala zapisać w cząsteczce DNA kolejność aminokwasów budujących kodowany polipeptyd. Kod genetyczny jest: trójkowy, bo każdy aminokwas jest kodowany w DNA przez trójkę nukleotydów - zdefiniowane trójki nukleotydów w DNA lub mRNA określają specyficzny aminokwas w łańcuchu polipeptydowym (trójka jest najmniejszą liczbą nukleotydów, których kombinacje umożliwiają kodowanie wszystkich aminokwasów występujących w białkach: 43 daje 64 kombinacji); uniwersalny, bo u wszystkich organizmów określony kodon koduje ten sam aminokwas (występują jednak pewne odstępstwa np. w mtDNA: kodon UGA oznacza tryptofan, a nie STOP; kodony AGA i AGG oznaczają STOP, a nie argininę; kodon AUA oznacza metioninę, a nie izoleucynę); zdegenerowany, bo jeden aminokwas może być kodowany przez więcej niż jeden kodon (występuje redundacja - nadmiar informacji); niezachodzący (nienakładający się), bo dany nukleotyd wchodzi w skład tylko jednego kodonu i może kodować tylko jeden aminokwas; bezprzecinkowy, bo każdy nukleotyd musi wchodzić w skład jakiegoś kodonu i kolinearny, bo kolejność kodonów w mRNA odpowiada dokładnie kolejności aminokwasów w polipeptydzie. W komórkach eukariotycznych kodon START (AUG) koduje metioninę, od której zawsze rozpoczyna się synteza polipeptydu. Trzy specjalne kodony STOP przerywają proces translacji: UAA, UAG i UGA. Są to tzw. kodony „nonsensowne”, bo nie kodują żadnego aminokwasu.

III. Proces dojrzewania pre-mRNA

Dojrzewanie pierwotnych transkryptów (pre-mRNA) - RNA processing obejmuje następujące procesy:

• Capping: to modyfikacja końca 5' - proces przyłączenia do końca 5' transkryptu tzw. „czapeczki” (7-metyl-guanozyny). Proces ten, odkryty w 1974 roku, chroni transkrypt przed degradacją i jest niezbędny dla związania mRNA z rybosomem. „Czapeczka” („kapturek”) nie jest kodowana przez gen, ale jest dołączana po transkrypcji.

• Poliadenylacja: to modyfikacja końca 3' - proces dołączenia do końca 3' transkryptu od 150 do 200 nukleotydów adeninowych (ogona poliA). Oznacza wybór miejsca terminacji transkrypcji.
  Modyfikacje obu końców transkryptu służą ich stabilizacji i umożliwiają ich transport z jądra do cytoplazmy.

• Składanie pre-mRNA (splicing RNA): to modyfikacja struktury pierwszorzędowej pierwotnego transkryptu obejmująca proces precyzyjnego usuwania (wycinania) sekwencji niekodujących (intronów) oraz równoczesnego łączenia fragmentów kodujących (eksonów). Zachodzi w spliceosomach (kompleksach rybonukleoproteinowych) przy udziale snRNA (małych jądrowych RNA bogatych w urydyny). Proces odkryty w 1977 roku.
  Długość dojrzałych cząsteczek mRNA stanowi często tylko jedną dziesiątą długości ich prekursorów (pre-mRNA). Prekursorowy mRNA, powstały w wyniku transkrypcji genu nieciągłego, nie może służyć od razu jako matryca do syntezy polipeptydu: musi ulec procesowi składania, by powstał dojrzały, gotowy do translacji mRNA.

• Redagowanie RNA (RNA editing): to modyfikacja struktury pierwszorzędowej pierwotnego transkryptu polegająca na chemicznych modyfikacjach zasad w mRNA (deaminacji cytozyny lub adeniny) albo na wstawianiu/wycinaniu reszt urydynowych. Występuje głównie w mitochondriach. Przebiega z udziałem guide RNA. Proces odkryty w 1985 roku.

IV. Poziomy regulacji ekspresji genów u Eukaryota

Biosynteza białka w komórkach eukariotycznych jest procesem wieloetapowym. Kontrola ekspresji genów może odbywać się na wszystkich etapach biosyntezy białka: działający w komórce system kontroli obejmuje wszystkie etapy ekspresji genów. Regulacja ekspresji genów może dotyczyć zarówno stabilności mRNA, jak i białka. Jednak najważniejszym i najskuteczniej (najwnikliwiej) kontrolowanym poziomem regulacji ekspresji naszych genów jest inicjacja transkrypcji, bowiem regulacja inicjacji transkrypcji jest najefektywniejsza dla komórki - zapobiega syntezie zbytecznych produktów pośrednich.

V. Regulacja funkcji genów na poziomie struktury chromatyny

Geny, które potencjalnie mogą ulec ekspresji, muszą być do niej pobudzone przez sygnał lub całą grupę sygnałów. Wstępnym procesem umożliwiającym ekspresję genu jest lokalna zmiana stopnia kondensacji chromatyny, która musi ulec dekondensacji (lokalnemu rozluźnieniu). Dobrym przykładem wpływu struktury chromatyny na funkcję genów jest lionizacja, czyli inaktywacja jednego z chromosomów X u samic ssaków. W ich wszystkich komórkach somatycznych jeden z chromosomów X ulega silnej kondensacji w tzw. ciałko Barra i dochodzi do wyciszenia ekspresji genów znajdujących się na tym chromosomie.

VI. Regulacja transkrypcji u Eukaryota

U Eukaryota dominuje pozytywna regulacja transkrypcji, polegająca na aktywacji tego procesu. Kluczową rolę w tym procesie odgrywają białka pełniące funkcje aktywatorów. Regulacja inicjacji transkrypcji polega na interakcji swoistych białek z określonymi regionami DNA. Do regionów regulatorowych genu przyłączają się odpowiednie białkowe czynniki transkrypcyjne, czyli „włączniki genów” („genowe włączniki”). Regulacja transkrypcji wymaga zatem obecności regionów regulatorowych w DNA oraz białkowych czynników transkrypcyjnych, które rozpoznają sekwencje regulatorowe DNA i wiążą się z nimi, kontrolując gdzie, kiedy i jakie geny ulegną ekspresji.

Regiony regulatorowe genów u Eukaryota to:

• Promotory: wyznaczają początek transkrypcji. Są to regiony regulatorowe genów przylegające bezpośrednio do miejsca startu transkrypcji (końca 5' genu, czyli końca z wolną grupą fosforanową przy piątym atomie węgla deoksyrybozy). Po związaniu z podstawowymi czynnikami transkrypcyjnymi promotor specyficznie wiąże polimerazę RNA, określając miejsce startu transkrypcji. Każdy nasz gen jest pod kontrolą swojego własnego promotora (geny eukariotyczne podlegają niezależnej kontroli tworząc własne jednostki transkrypcyjne ze swoim własnym promotorem i terminatorem transkrypcji - geny u Eukaryota są regulowane w sposób indywidualny). Promotory naszych genów mają wiele miejsc wiążących czynniki transkrypcyjne, z których każdy może wpłynąć na wydajność transkrypcji. To właśnie czynniki transkrypcyjne pomagają polimerazie RNA rozpoznać początek genu. W obrębie promotorów występują sekwencje bogate w pary AT (tzw. TATA-box) oraz sekwencje CAAT (tzw. CAAT-box).

• Sekwencje wzmacniające transkrypcję - wzmacniacze (enhancers): regulują wydajność transkrypcji, modulując jej tempo niezależnie od swojego położenia i orientacji względem danego genu. Kontrolują ekspresję oddalonych genów: są to sekwencje „dalekiego zasięgu” o długości 100-200 nukleotydów, mogące znajdować się w odległości tysięcy nukleotydów od miejsca inicjacji transkrypcji genu, którego ekspresję regulują.

• Sekwencje wyciszające transkrypcję (silencers): ograniczają transkrypcję w określonych typach komórek.

Klasy czynników transkrypcyjnych (czyli „genowych włączników”):

• Czynniki podstawowe: wiążą się z promotorami, są niezbędne do inicjacji transkrypcji wszystkich naszych genów.

• Aktywatory: wiążą się z sekwencjami wzmacniającymi transkrypcję, modulują tempo transkrypcji stymulując ten proces. Ten mechanizm wzmacniania tempa transkrypcji występuje w naszych komórkach znacznie częściej niż spowalnianie tempa transkrypcji.

• Represory: wiążą się z sekwencjami wyciszającymi transkrypcję, spowalniając (hamując) tempo transkrypcji - ograniczają transkrypcję w określonych typach komórek.

Zarówno aktywatory, jak i represory regulują wydajność transkrypcji.

Wszystkie czynniki transkrypcyjne mają budowę modułową i składają się z trzech typów domen białkowych pełniących określone funkcje:

• domen wiążących DNA posiadających charakterystyczne motywy strukturalne typu palców cynkowych (zinc fingers) odkryte w 1985 roku lub typu helisa-zwrot-helisa (helix-turn-helix) odkryte w 1981 roku i występujące np. w homeodomenach,

• domen odpowiedzialnych za dimeryzację posiadających charakterystyczne motywy strukturalne typu suwaka leucytowego (leucine zipper) lub typu helisa-pętla-helisa (helix-loop-helix),

• domen trans-aktywujących wchodzących w interakcje z innymi czynnikami transkrypcyjnymi.

Oddziaływania DNA-białko należą do najsilniejszych i najbardziej swoistych interakcji cząsteczkowych poznanych w biologii.

Funkcję regulatorów transkrypcji u Eukaryota pełnią także hormony steroidowe, które odgrywają znaczącą rolę w regulacji ekspresji specyficznej grupy genów. Steroidy działają swoiście na dany narząd lub tkankę, których komórki wytwarzają określone receptory. Steroidy działają jako aktywatory transkrypcji określonych genów w pewnych typach komórek. Nie wszystkie komórki mają w cytoplazmie cały komplet receptorów hormonów steroidowych: na pojawienie się we krwi określonego hormonu odpowiedzą tylko te komórki, które mają odpowiedni receptor zdolny do wiązania tego właśnie hormonu.

VII. Regulacja potranslacyjna u Eukaryota

Ustalenie ostatecznej struktury i funkcji białka nie kończy się w procesie translacji, bowiem większość produktów translacji (łańcuchów polipeptydowych) nie jest gotowa do podjęcia swojej biologicznej funkcji. Regulacja potranslacyjna polega przede wszystkim na wytworzeniu odpowiedniej struktury przestrzennej białka (III lub IV-rzędowej), czyli jego trójwymiarowego stanu konformacyjnego.

Główną modyfikacją potranslacyjną jest skracanie prekursorowych białek, polegające na specyficznej proteolizie: np. preinsulina złożona z 104 aminokwasów ulega skróceniu do proinsuliny zbudowanej z 81 aminokwasów, a następnie do insuliny składającej się z 51 aminokwasów. Innym przykładem skracania białek jest synteza różnych hormonów oligopeptydowych (w tym endorfin i ACTH) z jednego prekursorowego polipeptydu złożonego z 91 aminokwasów.

Regulacja potranslacyjna polega także na chemicznych modyfikacjach białka wpływających na jego stabilność: okres życia białek jest bardzo różny. Najważniejsze modyfikacje potranslacyjne to: N-glikozylacja, czyli przyłączanie łańcuchów węglowodanowych (np. do antygenów powierzchniowych HLA w błonach komórkowych, należących do tzw. głównego układu zgodności tkankowej MHC); fosforylacja, czyli przyłączanie grupy fosforanowej (np. do histonów, czynników transkrypcyjnych, polimerazy RNA II) oraz hydroksylacja, metylacja, S-nitrozylacja, kompleksowanie z atomami metali (np. hemoglobiny z żelazem) i dołączanie lipidów.

W organizmach stałocieplnych (np. w temperaturze +37^oC) białka - szczególnie te enzymatyczne - dość szybko tracą swoją aktywność i muszą zostać wymienione na nowe. Dlatego też do bardzo ważnych modyfikacji potranslacyjnych należy ubikwitynyzacja polegająca na przyłączeniu kompleksu ubikwityn (małych, konserwatywnych białek zbudowanych z 76 aminokwasów), umożliwiających degradację białek o nieprawidłowej budowie lub białek już zbędnych. Ubikwitynyzacja naznacza białka uszkodzone lub już niepotrzebne i przeznacza je do zniszczenia: rozłożenia przez proteasomy. Cząsteczki ubikwityny niszczą wadliwe białka i usuwają te już niepotrzebne, bo w komórce dane białko musi się pojawić w odpowiedniej ilości i w ściśle określonym czasie - punkcie cyklu komórkowego. Ubikwitynacja jest procesem bardzo selektywnym (degradacji ulegają tylko określone białka) i musi być procesem wystarczająco szybkim by nadążać za zmianami, jakim podlega komórka. Ubikwitynę ze względu na jej niezwykłą rolę w komórkowych „morderstwach” nazwano „pocałunkiem śmierci”. Odkrycia mechanizmu pozbywania się białek z komórki, czyli procesu ich niszczenia z udziałem ubikwityny, dokonali na początku lat 80. XX w. Aaron Ciechanover, Avram Hershko i Irwin A. Rose - w 2004 roku otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Niepotrzebne białka w komórce są niszczone i jest to ostatni możliwy poziom regulacji ekspresji naszych genów - degradacja białek w komórkach podlega precyzyjnej kontroli.

Podsumowanie

1. Ekspresja genów prowadzi do powstania odpowiednich cech komórek i organizmu
   jako całości.

2. Mechanizmy regulacyjne ekspresji naszych genów są jeszcze niecałkowicie poznane.

3. Ekspresja genów u Eukaryota może być kontrolowana na wszystkich etapach szlaku wiodącego od DNA przez RNA do białka, jednak najważniejsza kontrola odbywa się
   na poziomie inicjacji transkrypcji.

4. U Eukaryota dominuje pozytywna regulacja transkrypcji, polegająca na aktywacji tego procesu.

5. Transkrypcję kontrolują białka - tzw. czynniki transkrypcyjne - wiążące się z sekwencjami regulatorowymi DNA.

6. Główną modyfikacją potranslacyjną jest proteolityczne skracanie białek.

7. Komórka może zmieniać ekspresję swoich genów w odpowiedzi na sygnały (bodźce) zewnątrzkomórkowe - np. hormony.

8. Jedno białko może koordynować ekspresję różnych genów.

9. Poszczególne typy komórek w danym organizmie różnią się wzorem ekspresji genów
   i dlatego wytwarzają odmienne zestawy białek.

10. Degradacja białek w komórkach podlega precyzyjnej kontroli.

17

---