Różne grupy antybiotyków

artykuł dr. n. med. Pawła Grzesiowskiego i dr. n. med. Jarosława Walorego z Centralnego Laboratorium Surowic i Szczepionek w Warszawie, Zakładu Immunologii i Profilaktyki Zakażeń

Antybiotyki to związki chemiczne wytwarzane naturalnie przez mikroorganizmy, które hamują rozmnażanie lub zabijają inne drobnoustroje (wirusy, bakterie, mykoplazmy, grzyby i pierwotniaki).

Dzięki nowym technologiom coraz częściej przemysł dostarcza na rynek nowe leki przeciwbakteryjne wytworzone syntetycznie, umownie nazywane chemioterapeutykami. Łącznie obecnie na rynku medycznym dostępnych jest około 100 substancji mających istotne zastosowanie w leczeniu zakażeń. W przedstawionym poniżej podziale uwzględniono budowę chemiczną oraz mechanizm działania antybiotyków.

Antybiotyki beta-laktamowe

W tej grupie do najważniejszych zaliczamy penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy. Antybiotyki te mają wiązanie beta-laktamowe, które ulega rozerwaniu pod wpływem enzymów, tzw. beta - laktamaz produkowanych przez niektóre bakterie. Wszystkie antybiotyki beta-laktamowe hamują biosyntezę ściany komórki bakteryjnej, co prowadzi do jej rozpadu.

 Penicyliny

Do obecnie otrzymywanych penicylin naturalnych zaliczamy benzylopenicylinę (penicylinę G) i fenoksymetylopenicylinę (penicylinę V). Otrzymuje się je z hodowli pleśni Penicyllium notatum i Penicillium chrysogenum. Na benzylopenicylinę jest opornych wiele gatunków bakterii wytwarzających enzym rozkładający, tzw. penicylinazę (gronkowce, pałeczki jelitowe). Niezmienną wrażliwość wykazują paciorkowce ropotwórcze odpowiedzialne za zapalenie migdałków, czyli popularną anginę.

Penicyliny półsyntetyczne zostały wprowadzone do lecznictwa pod koniec lat 50. Niektóre z nich mają wąski zakres działania, np. przeciwgronkowcowe (m.in. oksacylina, kloksacylina, metycylina, nafcylina), inne - szeroki (np. ampicylina, amoksycylina, piperacylina).

W ostatnich latach notuje się wzrost oporności gronkowców na penicyliny półsyntetyczne, szczególnie wśród gronkowców złocistych. Zakażenia wywoływane przez te szczepy dominują u chorych przebywających w szpitalach. Penicyliny półsyntetyczne o szerokim zakresie działania stanowią liczną i szeroko stosowaną grupę antybiotyków.

Najbardziej znany antybiotyk tej grupy to ampicylina, która jako pierwsza była wprowadzona do lecznictwa. Następcą ampicyliny jest amoksycylina, która wykazuje znacznie lepszą aktywność i korzystniejsze właściwości farmakokinetyczne. W ostatnich latach pojawiły się skuteczne preparaty łączące penicylinę półsyntetyczną z tzw. inhibitorem beta-laktamaz. Połączenie to rozszerza zakres działania penicylin na bakterie wytwarzające beta-laktamazy. Przykładami takich połączonych leków jest amoksycylina z kwasem klawulanowym, ampicylina z sulbaktamem czy piperacylina z tazobaktamem.

Ze względu na inny mechanizm działania nie należy bez wyraźnych wskazań podawać penicylin jednocześnie z chloramfenikolem, tetracyklinami, antybiotykami makrolidowymi i linkozamidami, ponieważ wykazują działanie antagonistyczne. Salicylany i nienarkotyczne leki przeciwbólowe o silnym działaniu przeciwzapalnym nasilają działanie penicylin.

Penicyliny są mało toksyczne, najczęściej występuje alergia na te leki (dotyczy około 5-10% chorych). Reakcja alergiczna na penicyliny może mieć charakter natychmiastowy lub opóźniony, sporadycznie może dojść do wstrząsu uczuleniowego. Szacuje się, że występuje on 1 na 1 000 000 wstrzyknięć penicylin.

 Cefalosporyny

W lecznictwie stosuje się ponad 30 cefalosporyn półsyntetycznych. Mechanizm ich działania jest analogiczny do penicylin. Poszczególne generacje cefalosporyn różnią się przenikalnością do ośrodkowego układu nerwowego i opornością w stosunku do beta-laktamaz. Najlepszą przenikalność, jak i oporność na beta-laktamazy wykazują cefalosporyny III generacji.

Obecnie najczęściej za pomocą tej grupy leków leczy się zarówno zakażenia układu oddechowego, jak również moczowe oraz nerwowe. Jednak coraz powszechniejsze stosowanie antybiotyków powoduje niestety ich mniejszą skuteczność i jest przyczyną narastającej oporności bakterii na te leki.

 Karbapenemy

Wytwarzane są naturalnie przez grzyby z gatunku Streptomyces cattleya. Najbardziej znany to imipenem i meropenem. Charakterystyczną cechą tych leków jest bardzo szeroki zakres działania bakteriobójczego. Działają zarówno na bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne tlenowe i beztlenowe. Duża aktywność bakteriobójcza wiąże się z dobrą przenikalnością przez ścianę bakteryjną. Inną zaletą jest oporność na działanie beta-laktamaz wielu gatunków bakterii. Natomiast wadą tych antybiotyków jest wysoka cena.

Makrolidy i linkozamidy

Te obie grupy antybiotyków zostaną omówione razem, gdyż mają podobny mechanizm działania.

Do antybiotyków makrolidowych zalicza się erytromycynę i jej pochodne, takie jak roksytromycyna, klarytromycyna, spiramycyna czy azytromycyna. Hamują one biosyntezę białek. Stosuje się je w zakażeniach gronkowcowych i paciorkowcowych oraz tzw. atypowych, czyli nietypowymi bakteriami układu oddechowego, takimi jak chlamydie czy mykoplazmy. Nie należy ich jednak podawać kobietom w ciąży. Niestety, oporność bakterii na te antybiotyki rozwija się dość szybko, co powoduje ich coraz mniejszą skuteczność w procesie leczenia.

Do antybiotyków linkozamidowych należy linkomycyna i klindamycyna. Hamują one biosyntezę białka w komórce bakteryjnej poprzez łączenie się z podjednostką rybosomu 50s. Wykazują działanie na bakterie dodatnie, a także na beztlenowce. Antybiotyki te dobrze przenikają do tkanek, płodu i kości z wyjątkiem płynu mózgowo-rdzeniowego. Lepsza przenikalność klindamycyny przez błony biologiczne oraz ściany komórkowe bakterii sprawia, że jest 3-4 razy skuteczniejsza od linkomycyny w stosunku do gronkowców, paciorkowców oraz beztlenowców. Ze względu na dobrą przenikalność klindamycyna jest stosowana w zakażeniach: szpiku kostnego (zwłaszcza przewlekłych), jamy brzusznej beztlenowcami Gram-ujemnymi, dróg rodnych, układu oddechowego.

Najpoważniejszym powikłaniem związanym z przyjmowaniem antybiotyków linkozamidowych jest rzekomobłoniaste zapalenie jelit. Objawia się silnymi bólami brzucha i biegunką. Uważa się, że jest ono wywołane toksyną beztlenowca Clostridium difficile opornego na działanie linkozamidów. Rzekomobłoniaste zapalenie jelit może wystąpić również jako powikłanie leczenia innymi antybiotykami: tetracyklinami, chloramfenikolem, erytromycyną, a nawet penicylinami.

Aminoglikozydy

Mechanizm działania tych antybiotyków polega na upośledzeniu syntezy białek bakteryjnych (powstają białka o nieprawidłowej budowie) oraz uszkodzeniu błony cytoplazmatycznej. W porównaniu z antybiotykami beta - laktamowymi aminoglikozydy mają znacznie węższy zakres działania. Źle wchłaniają się z przewodu pokarmowego, wpływają toksycznie na narządy słuchu oraz na nerki. Nie działają na beztlenowce, a ich zaletą jest to, że oporność bakterii na te antybiotyki powstaje powoli, co zwiększa ich skuteczność. Stosuje się je w ciężkich zakażeniach wywołanych przez bakterie Gram-ujemne. Leki z tej grupy są wydalane przez nerki w postaci nie zmetabolizowanej (nie zmienionej) i osiągają duże stężenie w moczu, co ma korzystne znaczenie w terapii zakażeń układu moczowego. Aminoglikozydy I generacji to streptomycyna, kanamycyna, neomycyna, zaś II generacji to: gentamycyna, tobramycyna, amikacyna i netylmycyna. Zastosowanie leków I generacji jest już minimalne ze względu na ich większą toksyczność.

Amikacyna, najnowszy lek z tej grupy, jest wrażliwa tylko na dwa enzymy bakteryjne rozkładające te leki, dzięki czemu leczy się nią zakażenia wywołane przez bakterie lekooporne.

Antybiotyki aminoglikozydowe są wykorzystywane w zakażeniach układu moczowego, zakażeniach ran pooparzeniowych, zapaleniu opon mózgowo - rdzeniowych, zapaleniu gruczołu krokowego, zapaleniu wsierdzia. W zakażeniach beztlenowcami aminoglikozydy kojarzy się z metronidazolem.

Aminoglikozydy mogą uszkadzać narząd słuchu i równowagę w uchu wewnętrznym, a po długim podawaniu może nawet wystąpić upośledzenie słuchu. Jeśli nie jest to konieczne, nie należy podawać tych antybiotyków dzieciom poniżej 3. roku życia i osobom powyżej 65 lat, a także przy niewydolności nerek i wątroby, upośledzeniu słuchu, niedrożności jelit w ciąży. Antybiotyków tej grupy również nie należy stosować z lekami toksycznymi dla nerek i narządu słuchu (np. furosemid). Leki te zwiększają stężenie antybiotyków we krwi, a więc i ich toksyczność.

Tetracykliny

Mechanizm działania tych antybiotyków polega na hamowaniu biosyntezy białka i procesów energetycznych (przyłączania fosforu) w komórkach bakteryjnych. Największe znaczenie odgrywają w leczeniu zakażeń wywołanych przez bakterie atypowe, czyli Chlamydiae, Rikettsiae, Mycoplasma.

Z tetracyklin naturalnych otrzymywanych z pleśni Streptomyces stosuje się obecnie tetracyklinę. W około 50% wchłania się z przewodu pokarmowego, łatwo przenika do tkanek i przez barierę łożyskową do płodu. Pokarm znacznie zmniejsza wchłanianie się tych antybiotyków, dlatego powinny być podawane godzinę przed lub 2 godziny po posiłku. Nie należy ich łączyć z pokarmami mlecznymi. Tetracykliny stosuje się również miejscowo w postaci maści. Do tetracyklin zmodyfikowanych zaliczamy doksycyklinę, dostępną na polskim rynku. Pokarm nie wpływa na jej wchłanianie, ma ona także przedłużone działanie.

Podczas leczenia tetracyklinami może wystąpić podrażnienie błony śluzowej przewodu pokarmowego objawiające się nudnościami, wymiotami, biegunką, bólami w nadbrzuszu.

Do objawów niepożądanych należy również rzekomobłoniaste zapalenie jelit, odczyny alergiczne, nefro- i hepatotoksyczność. Sporadycznie po stosowaniu tetracyklin występuje nadwrażliwość na światło słoneczne. Tetracyklin nie wolno stosować u kobiet w ciąży, podczas karmienia piersią oraz u dzieci poniżej 16. roku życia. Podawanie tych leków u dzieci powoduje odkładanie się w kościach i zębach, co zwiększa podatność na próchnicę zębów i upośledza rozwój kości.

Inne ważne leki przeciwbakteryjne

Chloramfenikol - jeden z pierwszych antybiotyków - odkryty w 1947 r., od 1950 r. jest otrzymywany syntetycznie. Mechanizm jego funkcjonowania polega na hamowaniu biosyntezy białek i lipidów w komórkach bakteryjnych. Ma szeroki zakres działania. Obecnie jest stosowany rzadko ze względu na dużą toksyczność. Nie wolno podawać go chorym ze schorzeniami układu krwiotwórczego, wątroby, kobietom w ciąży oraz noworodkom. Objawy uszkodzenia szpiku po chloramfenikolu mogą wystąpić nawet kilka tygodni lub miesięcy po zakończeniu leczenia. Chloramfenikol hamuje działanie penicylin, cefalosporyn, makrolidów, potęguje działanie depresyjne wielu często stosowanych leków, np. fenylobutazonu, kotrimoksazolu.

Wankomycyna, teikoplanina - antybiotyki polipeptydowe - hamują syntezę ściany komórkowej. Stosuje się je w leczeniu najcięższych zakażeń gronkowcowych opornych na antybiotyki beta-laktamowe.

Ryfampicyna to antybiotyk hamujący syntezę kwasów nukleinowych o szerokim zakresie działania. W Polsce jest stosowana jako jeden z podstawowych leków przecigruźliczyc.

Leki przeciwbakteryjne

1. ANTYBIOTYKI BETA-LAKTAMOWE
penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy

2. MAKROLIDY
erytromycyna i jej pochodne (roksytromycyna, klarytromycyna, spiramycyna czy azytromycyna)

3. LINKOZAMIDY
linkomycyna, klindamycyna

4. AMINOGLIKOZYDY
I generacja - streptomycyna, kanamycyna, neomycyna
II generacja - gentamycyna, tobramycyna, amikacyna, netylmycyna

5. TETRACYKLINY
Tetracyklina naturalna
Tetracyklina zmodyfikowana - doksycyklina

6. INNE
Chloramfenikol
Wankomycyna, teikoplanina - antybiotyki polipeptydowe
Ryfampicyna

Oporność na antybiotyki

[edytuj]

Z Wikipedii

Skocz do: nawigacji, szukaj

Oporność na antybiotyki to cecha bakterii, która czyni je prawie zupełnie bądź zupełnie niepodatnymi na działanie antybiotyków.

Podział [edytuj]

Oporność dzielimy na pierwotną, mutacyjną i nabytą.

Oporność pierwotna to oporność determinowana przez zaprogramowaną genetycznie strukturę bakterii. Na przykład pałeczka ropy błękitnej jest oporna na większość antybiotyków, ze względu na nieprzepuszczalną ścianę komórkową.

Oporność mutacyjna wynika z mutacji, zmieniającej budowę struktur bakteryjnych (np. białek bakteryjnych) będących celem działania antybiotyku (jego punktem uchwytu). Taka zmiana uniemożliwia interakcję drobnoustroju z danym lekiem. Przykładem jest tu oporność paciorkowców kałowych na streptomycynę spowodowana przez zmianę budowy jednego z białek rybosomu.

Oporność nabyta - to skutek nabycie genów oporności od innych bakterii. Wymiana genów zachodzi najczęściej za pośrednictwem plazmidów.

Mechanizmy

Jest wiele możliwych mechanizmów oporności na antybiotyki:

• oporność wynikająca z wytwarzania przez bakterie nowych enzymów

• wytwarzanie enzymów rozkładających i dezaktywujących antybiotyk (np. wytwarzanie β-laktamaz)

Zobacz więcej w osobnym artykule: beta-laktamazy.

• wytwarzanie enzymów modyfikujących i w ten sposób dezaktywujących antybiotyk (taki jest np. mechanizm oporności na aminoglikozydy)

• wytwarzanie innego enzymu katalizującego blokowaną przez lek reakcję

• oporność wynikająca z modyfikacji struktur bakteryjnych

• modyfikacja budowy enzymu na który działa lek, tak żeby nadal spełniał swoją funkcję biologiczną, ale był mniej podatny na antybiotyk. Przykładem tego mechanizmu oporności są szczepy Staphylococcus aureus oporne na metycylinę, określane skrótem MRSA, od angielskiego terminu: methicillin resistant S.aureus. Bakterie należące do tych szczepów wytwarzają zmienione białko PBP, będące w normalnych komórkach bakteryjnych punktem uchwytu antybiotyków beta-laktamowych. Lek, zaprojektowany do łączenia się z normalnym białkiem i blokowania go, nie rozpoznaje białka zmienionego - nie może więc wywierać na niego działania. Szczepy zdolne do wytwarzania takich zmienionych białek PBP są więc oporne na działanie wszystkich leków, których bójcza aktywność polega na rozpoznawaniu i dezaktywacji właśnie tych białek, a więc są oporne na wszystkie antybiotyki z grupy beta-laktamów, jak penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy i karbapenemy.

• modyfikacja niektórych białek rybosomalnych. Uniemożliwia to wiązanie się antybiotyków hamujących syntezę białka takich jak gentamycyna, erytromycyna, chloramfenikol z ich punktem uchwytu w rybosomie i czyni je nieaktywnymi

• zmiana struktury błony komórkowej lub ściany komórkowej, tak żeby była ona mniej przepuszczalna dla antybiotyku

• oporność wynikająca z uzyskania przez bakterie możliwości aktywnego pozbywania się cząsteczek antybiotyku z wnętrza komórki

• oporność wynikająca z braku w danym gatunku drobnoustroju struktur, na które działa lek. Np. oporność mykoplazm na antybiotyki hamujące syntezę ściany komórkowej polega na tym, że ten rodzaj bakterii nie posiada w ogóle ściany komórkowej.

Poza tym komórka bakteryjna w odpowiedzi na działanie antybiotyku może:

• produkować więcej blokowanego enzymu

• produkować więcej substratu blokowanej reakcji

Bakterie są organizmami posiadającymi dużą zdolność adaptacji do nowych warunków. Powszechnie obserwuje się nabywanie przez nie oporności na stosowane leki. Szczególnie oporne na antybiotykoterapię są szczepy bakterii, żyjące w środowisku szpitalnym. Są one poddawane ciągłemu działaniu substancji biobójczych, co prowadzi do ich selekcji - przeżywają tylko bakterie oporne na stosowane środki dezynfekujące. Dlatego zakażenia szpitalne są z reguły trudniejsze do leczenia

β-laktamazy to bakteryjne enzymy rozrywające (dokładnie hydrolizujące) wiązanie β-laktamowe w cząsteczce antybiotyku β-laktamowego. Ich obecność w komórkach bakteryjnych jest źródłem oporności bakterii na ten rodzaj antybiotyków.

β-laktamazy mają budowę zbliżoną do transpeptydaz - bakteryjnych enzymów uczestniczących w budowie ściany komórkowej, odpowiedzialnych za tworzenie mostków łączących podjednostki peptydoglikanu (mureiny) w integralną całość. Transpeptydazy są jednocześnie białkami, z którymi w normalnej komórce bakteryjnej łączą się antybiotyki β-laktamowe, aby je zablokować (transpeptydazy są punktem uchwytu β-laktamów). Ze względu na to podobieństwo budowy β-laktamazy mogą łatwo wiązać się z cząsteczkami antybiotyku i dezaktywować je (uniemożliwiając im blokowanie transpeptydaz).

β-laktamazy są wydzielane przez bakterie Gram-dodatnie na zewnątrz komórki, a przez bakterie Gram-ujemne do przestrzeni periplazmatycznej.

W zależności od tego gdzie, w komórce bakteryjnej, znajduje się gen kodujący wytwarzanie β-laktamazy wyróżniamy:

• β-laktamazy chromosomalne (chromosomalne cefalosporynazy - nazwa pochodzi od zdolności tych enzymów do rozkładu cefalosporyn) wytwarzane przez szczepy bakterii gram-ujemnych oprócz Salmonelli. Gen odpowiadający za produkcję tych enzymów znajduje się w chromosomie bakteryjnym. Ten rodzaj β-laktamaz rozkłada wszystkie β-laktamy z wyjątkiem karbapenemów. Cefalosporynazy mogą być:

• konstytuowane (wrodzone) - wtedy bakteria wytwarza je stale, w stałej ilości, niezależnie od obecności antybiotyku

• indukowane - bakteria uruchamia wytwarzanie enzymu tylko w obecności antybiotyku

• plazmidowe β-laktamazy wytwarzane przez szczepy bakterii Gram-ujemnych; gen jest zlokalizowany w plazmidzie.Wyróżniamy:

• β-laktamazy klasyczne (typu TEM i SHV) - Wytwarzane przez pałeczki Gram-ujemne; Rozkładają penicyliny i cefalosporyny I generacji; Nie rozkładają cefalosporyn II, III i IV generacji, monobaktamów i karbapenemów; Są wrażliwe na inhibitory β-laktamaz; Ich obecność w komórkach bakteryjnych wykrywa się testem z cefinazą

• β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (typu ESβL) - Wytwarzane przeważnie przez szczepy żyjące w środowisku szpitalnym; Rozkładają penicyliny i dodatkowo cefalosporyny II, III i IV generacji oraz monobaktamy; Nie rozkładają karbapenemów ; Są wrażliwe na inhibitory β-laktamaz. Ich obecność w komórkach można wykryć:

• testem dwóch krążków: Na płytce z podłożem wzrostowym i posianym szczepem badanym, układa sie w niewelkiej odległości dwa krążki: z cefalosporyną III generacji (np. ceftazydymem), a obok krążek z ampicyliną z dodatkiem kwasu klawulanowego (inhibitorem β-laktamaz). Większa strefa zahamowania wzrostu bakterii od strony krążka z dodatkiem inhibitora i jednocześnie mała strefa wzrostu od drugiej strony krążka z cefalosporyną III generacji, świadczy o obecności w szczepie β-laktamaz ESβL.

• testem wykorzystującym różnicę strefy zahamowania wzrostu między krążkiem z cefalosporyną III generacji, a krążkiem z cefalosporyną z dodatkiem inhibitora β-laktamaz. Oba krążki układa się na płytce z podłożem wzrostowym i posianym szczepem bakterii. Po 24 godzinnej inkubacji, mierzy się średnicę zahamowania wzrostu bakterii wokół obu krążków. Jeśli różnica średnic wynosi więcej niż 5 mm, można wywnioskować, że badany szczep wytwarza β-laktamazy typu ESβL.

Inhibitory β-laktamaz to naturalne lub syntetyczne związki chemiczne, stosowane w celu zapobiegania oporności na antybiotyki wynikającej z obecności w komórce bakteryjnej β-laktamaz. Związki te są zbliżone budową chemiczną do antybiotyków β-laktamowych, mogą zatem łączyć sie z β-laktamazami i dezaktywować je.

Naturalnym inhibitorem jest kwas klawulanowy. Uzyskano też związki syntetyczne o podobnym działaniu: sulbaktam i tazobaktam.

Antybiotyki

       Antybiotyki są to substancje działające hamująco na procesy ważne dla życia drobnoustrojów. Poznano już około dwóch tysięcy substancji antybiotycznych wytwarzanych przez bakterie, pleśnie, grzyby, poro­sty, glony, rośliny wyższe i zwierzęta. Większość antybiotyków jest wytwarzana przez drobnoustroje zaliczane do promieniowców, pleśni i laseczek. Niektóre antybiotyki udało się otrzymać całkowicie synte­tycznie (chloramfenikol), inne zaś półsyntetycznie (ampicylina, kloksacylina, dikloksacylina).

       Antybiotyki obejmują niemal wszystkie struktury chemiczne. Zasto­sowanie kliniczne znalazło dotychczas około 150 antybiotyków o róż­nym zakresie działania. Podział produkowanych antybiotyków według ich praktycznego działania przedstawiono w tabeli 2. Spośród antybiotyków wyróżniamy takie, których zakres działania jest duży, to znaczy działają na drobnoustroje należące do różnych ro­dzajów i rodzin, lub też antybiotyki działające tylko na nieliczne ga­tunki lub grupy drobnoustrojów. Szczepy należące do tego samego ga­tunku mogą być w różnym stopniu podatne na działanie antybiotyku.

       Szczepy, na które antybiotyk działa, w stężeniach łatwo osiągalnych w surowicy krwi i w tkankach, nazywamy wrażliwymi, w przeci­wieństwie do szczepów opornych, niewrażliwych na działanie anty­biotyku. Szczepy wrażliwe mogą w pewnych warunkach nabywać opor­ność. Zdolność do nabywania oporności należy do zjawisk niepożąda­nych i stanowi jeden z najpoważniejszych problemów leczenia anty­biotykami. Rozwój oporności zachodzi z różną łatwością u rozmaitych drobnoustrojów, np. bardzo łatwo u gronkowców i pałeczek ropy błę­kitnej, trudno u dwoinek rzeżączki i niektórych paciorkowców. Szyb­kość powstawania oporności na różne antybiotyki nie jest jednakowa.

Tabela 2 Podział produkowanych antybiotyków według praktycznego zakresu ich działania (wg Kuryłowicza i Kowszyk-Gindifer)

	Antybiotyk
Szeroki zakres działania	Aktynospektacyna, aminozydyna, cefalosporyna, cefalorydyna, cefalotyna, chloramfenikol, streptomycyna, dwuhydrostreptomycyna; Grupa neomycyn: neomycyna, kanamycyna, glutamycyna, higromycyna; Makrolidy: erytromycyna, oleandomycyna, spiramycyny, leukomycyna, linkomycyna; Penicyliny: penicylina G, penicylina V, ampicylina, kloksacylina, metycylina, dikloksacylina, nafcylina, oksacylina, fenetycylina; Peptolidy: etamycyna (gryzeowirydyna, wirydogryzeina), mikamycyny, ostreogrycyny, prystynamycyna, stafilomycyny, streptograminy, wernamycyny; Ryfamycyna SV, nizyna; Tetracykliny: tetracyklina, oksytetracyklina, chlorotetracyklina, deklomycyna, tiolutyna, tiostrepton
Gram- -dodatnie	Amfomycyna, fucydyna (kwas fusydowy), gramicydyna S, nowo-tiocyna, termorubina, tyrotrycyna, wankomycyna
Prątki	Cykloseryna, wiomycyna, kapreomycyna
Gram- -ujemne	Kolistyna, polimiksyna B
Grzyby	Polieny makrolidowe: amfoterycyna B, kandycydyna B, filipina, hamycyna, leworyna, nystatyna, trychomycyna; Polieny niemakrolidowe: wanotyna, fumagilina; Niepolieny: antelmycyna, boromycyna, cykloheksimid (aktydion), gryzeofulwina, pirolonitryna, wenturycydyna
Nowotwory	Aktynomycyny, rubomycyna (daunomycyna, rubidomycyna), mitomycyna, bruneomycyna (streptonigryna, rufomycyna), oliwomycy­ny (chromomycyny, mitramycyna)

Mechanizm działania antybiotyków

       Silne działanie przeciwdrobnoustrojowe antybiotyków stało się przy­czyną badania mechanizmów tego zjawiska. Poznane mechanizmy dzia­łania okazały się zróżnicowane. Procesy fizykochemiczne mogą być ha­mowane lub zaburzane aż do zakłócania ciągów metabolicznych. Uszka­dzane mogą być procesy swoiste dla drobnoustrojów lub" wspólne dla bakterii i makroustrojów. W pierwszym przypadku antybiotyk jest nie­toksyczny, w drugim mniej lub bardziej toksyczny. Są antybiotyki inter-ferujące z syntezą białek, puryn, kwasów nukleinowych, przemianami aminokwasów lub peptydów. Miejscem działania może być ściana ko­mórkowa, na którą działają penicyliny, cefalosporyny, cykloseryna, bacytra cyna i wankomycyna (ryć. 8). Strukturę błony cytoplazmatycznej zaburzają: polimiksyna B, kolistyna i gramicydyna. Na syntezę białka zachodzącą w strukturach plazmatycznych wpływają tetracykliny, chlo-ramfenikol, streptomycyna, gentamycyna, neomycyna i erytromycyna. Na syntezę DNA i RNA działają: kwas nalidyksowy i aktynomycyna.

Ryć. 8. Podział antybiotyków według ich mechanizmu działania: 1 — antybiotyki wpływające na replikacje informacji genetycznych: kwas nalidy-ksowy, gry zeof lawina; 2 — antybiotyki zaburzające przekazywanie informacji genetycznych w biosyntezie: chloramfenikol, erytromycyna, kanamycyna, streptomycyna, tetracykliny, linnomycy-na, neomycyna-, 3 — antybiotyki uszkadzające strukturą i czynność bakteryjnej ściany komórkowej: penicyliny, cykloseryna, rystocetyna, cefalosporyny, wankomycyna, bacytracyna-, 4 — antybiotyki powodujące zaburzenia czynności błony komórkowej: gramicydyna, polimiksyna B, amfoterycyna B, tyrotrycyna, kolistyna, nystatyna.

Oporność drobnoustrojów na antybiotyki

       W roku 1939 MacLean, Rogers i Fleming zaobserwowali rozwój szczepu gronkowca opornego na sulfonamidy u pacjenta leczonego sulfapirydy-ną. W roku 1941 Abraham i wsp. otrzymali szczepy gronkowców opor­ne na penicylinę in vitro. W ciągu następnych kilku lat opisano powsta­wanie szczepów opornych na streptomycynę, chloramfenikol i antybio­tyki tetracyklinowe. Obecnie znaczny procent szczepów jest oporny na sulfonamidy i antybiotyki stosowane w lecznictwie. Stwierdzono również, że prawie wszystkie gatunki drobnoustrojów mogą dawać szczepy oporne na antybiotyki i sulfonamidy. W miarę wzrostu zużycia antybiotyków i sulfonamidów w lecznictwie wzrastała liczba szczepów opornych.
       Mueller, porównując wyniki leczenia rzeżączki w Stanach Zjedno­czonych stwierdził, że w latach 1940—1941 przy użyciu sulfonamidów można było wyleczyć około 70% pacjentów w porównaniu z 30% w la­tach 1944—1945. Kryński i wsp. stwierdzili w roku 1957, że ponad 95% gronkowców wyizolowanych z materiałów klinicznych i pozaklinicznych było opornych na sulfonamidy. W tym samym okresie w mate­riałach klinicznych szpitali woj. gdańskiego zaobserwowano około 73% szczepów gronkowców opornych na penicylinę, 35% na streptomycynę, 24% na chloramfenikol i około 12% gronkowców opornych na aureomy-cynę. W latach sześćdziesiątych nastąpiło szybkie zwiększenie oporno­ści wśród pałeczek Gram-ujemnych. Obecnie izolowane ze środowiska szpitalnego szczepy Pseudomonas aeruginosa są niemal wszystkie opor­ne na dostępne antybiotyki. Wzrósł odsetek szczepów opornych Kleb-siella pneumoniue, Escherichia coli, Flayobacterium, Enterobacter i innych pałeczek Gram-ujemnych.
       Problem oporności szczepów drobnoustrojów zaczyna nabierać coraz większego znaczenia, zmuszając służbę zdrowia do intensywnego poszu­kiwania środków zaradczych. Starając się zapobiec dalszemu przyrosto­wi szczepów opornych, ogranicza się stosowanie antybiotyków do przy­padków koniecznych i tylko pod kontrolą lekarza. Ogranicza-się rów­nież wolną sprzedaż antybiotyków, stosowanie ich w kosmetyce i w ży­wieniu zwierząt. W USA i w Anglii ogranicza się liczbę stosowanych antybiotyków. Po pewnym czasie zarzuca się stosowane dotychczas antybiotyki, wprowadzając na ich miejsce nowe, dotąd nie stosowane. Innym rozwiązaniem jest wykorzystywanie uzupełniającego się działanią antybiotyków. Polega to na podawaniu np. dwóch antybiotyków równocześnie, przy czym każdy z nich działa na inne procesy komórko­we drobnoustrojów. Tego rodzaju działanie ma na celu utrudnienie roz­woju szczepów opornych. Na ograniczenie przyrostu szczepów opor­nych istotny wpływ ma stosowanie antybiotyków z jednoczesnym kon­trolowaniem wrażliwości drobnoustrojów in vitio. Szczepy wyizolowa­ne od chorego są poddawane oznaczeniu oporności na antybiotyki sto­sowane w leczeniu. Poznanie oporności szczepu pozwala zastosować antybiotyki, które powinny dać najlepszy skutek leczniczy i określa zarazem dawkę antybiotyku.
       Wzrastająca częstość występowania szczepów opornych uniemożliwia lekarzowi wybór właściwego antybiotyku bez oparcia na wynikach ba­dań laboratoryjnych. Oznaczenia wrażliwości drobnoustrojów przepro­wadza się in vitro, posługując się zwykle metodami rozcieńczeniowymi lub dyfuzyjnymi.
       Metody rozcieńczeniowe są dokładniejsze niż metody dyfuzyjne — umożliwiają wyrażenie stopnia wrażliwości w wartościach tzw. MIC i MBC.
MIC (minimal inhibitory concentration) — jest to najmniejsze stę­żenie antybiotyku hamujące wzrost drobnoustrojów.
MBC (minimal bactericidal concentration) — odpowiada najmniej­szemu stężeniu antybiotyku działającemu bakteriobójczo. Do najczęściej stosowanych metod rozcieńczeniowych zaliczamy metodę probówkową i płytkową. W metodzie probówkowej antybiotyk rozcieńcza się w do­wolnym stosunku — podłożem bulionowym o specjalnym składzie, pod­czas gdy w metodzie płytkowej używa się do tego celu upłynnionego podłoża agarowego lub innego. Badane szczepy posiewa się do odpo­wiedniego podłoża bulionowego. Wyrosłą hodowlę rozcieńcza się 1:1000 i w określonych ilościach dodaje do każdej probówki lub posiewa na powierzchni serii płytek z agarem, zawierających malejące stężenia antybiotyku. Posiane próbki są inkubowane przez 18 godzin w temp. 37°C (nie dla wszystkich drobnoustrojów), po czym dokonuje się odczy­tu. Zmętnienie lub osad w bulionie świadczy o wzroście bakterii, bu­lion przejrzysty oznacza zahamowanie rozwoju drobnoustrojów. Naj­wyższe rozcieńczenie antybiotyku, w którym nie wystąpił wzrost, przyj­mujemy za wartość MIC. Określona wartość jest tym bardziej zbliżona do rzeczywistej, im stosunek rozcieńczeń jest mniejszy. W metodzie płytkowej wartości MIC ustalamy analogicznie na podstawie określenia najmniejszego stężenia hamującego rozwój drobnoustrojów na agarze. Metoda płytkowa ma pewne zalety. Posługując się tą samą serią płytek, można oznaczyć jednocześnie wrażliwość kilkunastu szczepów, a do­danie krwi (drobnoustroje bardziej wymagające) nie utrudnia odczytu.
Metody rozcieńczeniowe nie należą jednak do metod najczęściej sto­sowanych. Przyczyną jest brak standardów antybiotyków, znaczna pra­cochłonność, konieczność posiadania dokładnych wag i sporej ilości szkła.
       Dlatego w laboratoriach bakteriologicznych powszechnie stosuje się metody dyfuzyjne, w których używa się głównie krążków bibuło­wych wysyconych znaną ilością antybiotyku. Rzadko używane są w tym celu cylinderki. Zasada metody krążkowej polega na dyfuzji anty­biotyku z krążka do żelu agarowego i działaniu na komórki wysianego szczepu. Dyfundujący antybiotyk powoduje powstanie dookoła krążka strefy zahamowania wzrostu proporcjonalnej do stopnia wrażliwości szczepu (rys. 2).

Rys. 2. Oznaczenie wrażliwości szczepów na antybiotyki metodą dyfuzyjną za pomocą krążków bibułowych

       Oznaczenia powinno się prowadzić według propozycji Komitetu Ekspertów Światowej Organizacji Zdrowia na podłożu Muellera-Hinto-na (B—12). Jałowe podłoża rozlewa się na płytki Petriego o średnicy 100 mm. Grubość agaru na płytce powinna wynosić 4 mm ± l mm. W razie potrzeby określenia wrażliwości drobnoustrojów o zwiększo­nych wymaganiach odżywczych opisane podłoże można wzbogacić przez dodanie krwi baraniej lub końskiej albo też 0,5 g glukozy, 0,5% Bacto tryptose ,,Difco" i 0,5% wyciągu drożdżowego (B—13). Płytki przed posianiem należy podsuszyć przez 30 minut w temp. 37°C. Na­stępnie przygotowuje się rozcieńczenia 18—24-godzinnej hodowli bu­lionowej badanego szczepu. Dobrze rosnące pałeczki Gram-ujemne i większość ziarniaków rozcieńcza się 1:1000. Hodowle paciorkowców, dwoinek zapalenia płuc, drożdżaków należy rozcieńczyć 1:20. Jeden ml tak przygotowanej zawiesiny przenosi się na powierzchnię podsu­szonego podłoża, zbierając nadmiar płynu pipetką. Jeżeli płyn z powie­rzchni podłoża został dokładnie usunięty, krążki układa się po 4 lub 5 na każdej płytce i po 30 minutach wstawia do cieplarki o temp. 37°C. Wstępny okres 30 minut preinkubacji w temperaturze pokojowej jest zbyt krótki dla antybiotyków wolno dyfundujących. Dlatego przy ozna­czaniu tą metodą wrażliwości na polimiksynę B i kolimycynę okres preinkubacji prowadzonej w temperaturze 4°C powinien trwać 18 godzin. Czas inkubacji w cieplarce zazwyczaj wynosi 18—24 godziny. Wyjątek stanowią drobnoustroje rosnące powoli, dla których koniecz­na jest dłuższa inkubacja. Po zakończeniu inkubacji mierzy się średnicą stref zahamowania (np. za pomocą cyrkla) i podaje w milimetrach. Rów­nolegle należy zawsze prowadzić oznaczenie wrażliwości szczepu wzor­cowego.
       Pomimo prostoty oznaczania wrażliwości metodą krążkową wymaga ona bardzo starannego wykonania i przestrzegania przepisów.
       Użycie niewłaściwego podłoża, zmiana wielkości posiewu, pominięcie okresu preinkubacji, inne pH, pominięcie kontroli ze szczepem wzorco­wym są często przyczynami zmiany wielkości strefy i tym samym mogą być powodem fałszywego określenia wrażliwości. Ważny element uzyskania właściwego wyniku w metodzie krążko­wej stanowi odpowiednia zawartość antybiotyków w krążkach. Komi­tet Ekspertów postuluje użycie standardowych krążków o średnicy 6 mm i optymalnej zawartości antybiotyków.

       Ustalona ilość antybiotyków zapewnia możliwie największą zgodność wyników uzy­skiwanych w metodzie krążkowej z wartościami MIC otrzymywanymi w metodzie rozcieńczeniowej, probówkowej lub płytkowej. To z kolei umożliwia odnoszenie wyników do średniego poziomu antybiotyku przy normalnym dawkowaniu. Na podstawie wyników badania wrażliwości szczepy można zróżnicować na cztery grupy. Do grupy pierwszej są za­liczane szczepy o bardzo dużym stopniu wrażliwości. Zakażenia wywo­łane przez takie szczepy mogą być wyleczone przy normalnym dawkowaniu antybiotyku. Szczepy grupy II są mniej wrażliwe i wyleczenie można uzyskać stosując duże dawki antybiotyku, natomiast do grupy III zalicza się szczepy, na które antybiotyk będzie działał skutecznie tylko w niezwykle dużych stężeniach, jakie można uzyskać np. w le­czeniu miejscowym, lub też jeżeli zachodzi fizjologiczne zagęszczenie antybiotyku, np. w moczu. Grupę IV stanowią szczepy oporne. Określenie wrażliwości szczepów na antybiotyki pozwala zatem na przewidywanie skuteczności antybiotykoterapii.

Mikrobiologiczne metody określania aktywności antybiotyków

       Zdolność hamowania przez antybiotyki wzrostu wrażliwych drobno­ustrojów została wykorzystana do ich ilościowego określania. Do naj­częściej stosowanych metod biologicznych należą: metoda cylinderkowa i metoda seryjnych rozcieńczeń. Metodami tymi można określić aktywność antybiotyku (tj. liczbę mikrogramów czynnej substancji w l ml roztworu) i obliczyć moc preparatu (tj. liczbę mikrogramów aktywnego antybiotyku w l mg substancji).

Metoda cylinderkowa.

       Metoda cylinderkowa jest metodą dyfuzyjną. Do oznaczeń używa się metalowych, szklanych lub porcelanowych cylinderków (bez dna) wykonanych ze srebrnej stali, szkła pyreksowego lub porcelany glazurowanej.

Oznaczenie stężeń antybiotyków za pomocą metody płytek z cylinderkami
       Cylinderki mają znormalizo­wane wymiary: 10 mm wysokości, 8 mm średnicy. Do oznaczania mocy antybiotyku używa się podłoża agarowego o specjalnym składzie (B— 14). Badania przeprowadza się na płytkach Petriego, zazwyczaj o śred­nicy 100 mm i wysokości 20 mm. Do płytek nalewa się najpierw po 21 ml upłynnionego podłoża agarowego, a po zestaleniu nawarstwia się po 4 ml podłoża agarowego, do którego dodano odpowiednią ilość ko­mórek szczepu wzorcowego. Po zestaleniu drugiej warstwy agaru, na każdej płytce ustawia się pięć cylinderków, które napełnia się roztwo­rami antybiotyku o znanych odpowiednich stężeniach i właściwie roz­cieńczone roztwory badanego antybiotyku. Następnie płytki z cylinderkami inkubuje się w odpowiedniej temperaturze. Antybiotyk, dyfundując poprzez żel agarowy, powoduje zahamowanie wzrostu wzorcowego drobnoustroju dookoła cylinderków. Wielkość strefy zahamowania wzrostu jest zależna od stężenia antybiotyku w próbce. Porównanie średnicy stref zahamowania wzrostu dookoła cylinderków, zawierają­cych roztwory antybiotyku o znanych stężeniach, ze strefami zahamo­wania wzrostu próbek badanych pozwala obliczyć (z krzywej wzorco­wej) zawartość antybiotyku w próbce. Zależnie od rodzaju badanego antybiotyku do tych oznaczeń używać należy różnych drobnoustrojów wzorcowych. Na przykład do miarecz­kowania penicyliny, wankomycyny, rystocetyny używa się szczepu Staphylococcus aureus ATCC 6538, do oznaczania mocy antybiotyku przeciwgrzybowego kandycydyny należy posługiwać się szczepem Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, a dla streptomycyny — szczepem Bacillus subtilis ATCC 6333.

       Czas i temperatura inkubacji płytek z cylinderkami zależą od właści­wości antybiotyku i intensywności wzrostu szczepów. Oznaczając moc antybiotyków szybko dyfundujących, można płytki umieścić w cieplarce natychmiast po napełnieniu cylinderków. Jeżeli antybiotyk dyfunduje powoli, to próbki przed wstawieniem do cieplarki powinny po­zostać przez określony czas w temperaturze niskiej. W przypadku dro­bnoustrojów szybko rosnących wystarcza 18-godzinny czas inkubacji, podczas gdy wolniej rosnące, np. grzyby, należy inkubować odpowie­dnio dłużej.
       Metoda seryjnych rozcieńczeń. W tej metodzie w dwóch szeregach pro­bówek sporządza się wzrastające rozcieńczenia antybiotyku wzorcowe­go i badanego. Jako rozcieńczalnika używa się specjalnego podłoża bulionowego, umożliwiającego wzrost używanego w badaniach szczepu wskaźnikowego (wzorcowego). Schemat przygotowania seryjnych roz­cieńczeń przedstawiono na rycinie 11. Do wszystkich probówek z wy­jątkiem kontroli dodaje się zawiesiny wrażliwego szczepu wzorcowego i próbki inkubuje przez odpowiedni czas. W probówkach, w których stężenie antybiotyku jest odpowiednio małe, występuje wzrost drobno­ustrojów, natomiast tam gdzie stężenie antybiotyku było odpowiednio duże, następuje zahamowanie wzrostu. Przykład interpretacji i zapisu wyników przedstawiono w tabeli 4. Po wstępnym badaniu, dla obu roz­tworów przeprowadza się oznaczenia dokładniejsze, zawężając rozcień­czenia do np. 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12 ........ Takie postępowanie zmniejsza błąd metody.

Schemat wykonywania rozcieńczenia seryjnego antybiotyku

       Znając najmniejsze stężenie hamujące wzrost szczepu wskaźnikowe­go przez antybiotyk wzorcowy możemy określić, ile antybiotyku znaj­dowało się w l ml badanej próbki. Substancje inaktywujące antybiotyki i wywołujące zjawisko interakcji oraz sposoby ich oznaczania Znamy wiele substancji, które w zetknięciu z antybiotykami zmniejsza­ją siłę ich działania. Do znanych substancji inaktywujących penicylinę należą: penicylinaza, cysteina, kwas merkaptooctowy, chlorowodorek hydroksylaminy, sole niektórych metali ciężkich, pirydoksyna i hydro­lizat kazeiny. Substancjami, które wpływają na obniżenie działania streptomycyny są: cysteina, beta-merkaptoetyloamina i inne związki tiolowe, KOCN, chlorowodorek hydroksylaminy, hydrazyna i jej pochodne, semikarba-zydy, większość witamin rozpuszczalnych w wodzie, fenyloalanina i związki zawierające kation Mg2+. Działanie inaktywujące streptomycynę wykazuje ponadto liposytol i przesączę hodowli niektórych dro­bnoustrojów.
       Antybiotyki tetracyklinowe są inaktywowane przez jony Mn2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+. Jony Mg2+ inaktywują również neomycynę. Zdolność inakty-wacji neomycyny wykazują poza tym pewne substancje wytwarzane przez komórki Pseudomonas aeruginosa.
Zdaniem niektórych autorów kwas pantotenowy, beta-alanina i L-kar-nozyna wpływają na osłabienie stopnia aktywności erytromycyny. Polimiksyny są inaktywowane przez jony Mg2+, Ca2+, mydło, liposytol oraz przez oksysteroidy. Pokrewny antybiotyk — bacylina — jest inaktywowany przez substancję tzw. antybacylinę, wytwarzaną przez niektóre drobnoustroje.
       Znajomość substancji wchodzących w tzw. interakcje z antybio­tykami ma duże znaczenie dla lecznictwa, ponieważ działanie tych sub­stancji prowadzi do dezaktywacji lub zmniejszenia siły działania anty­biotyku.
       Zjawisko interakcji występuje w przypadku zmieszania Chloromyce-tinum succinatum i Mephenytoinum, Erythromycinum glucoheptonatum, Hydroxyzinum hydrochloricum, Oxytetracyclinum, Tetracyclinum hy-drochloricum oraz z Yancomycinum hydrochloricum.
       Erytromycyna w postaci Erythromycinum glucoheptonatum powoduje zjawisko interakcji z Chloromycetinum succinatum, Hydantoinalum, Heparinum, Luminalum Natrium, Streptomycinum sulfuricum, Tetracy­clinum hydrochloricum. Siarczan kanamycyny (Kanamycinum sulfuri­cum) wykazuje interakcję w roztworach zawierających Glucosum, Me­phenytoinum, Heparinum, Hydrocortisonum succinatum, Luminalum Na­trium i Amidoxal.
       Nitrofurantoina daje interakcję z Polocainum hydrochloricum, Stre­ptomycinum sulfuricum i Yancomycinum hydrochloricum.
       Interakcja zachodzi pomiędzy oksytetracykliną i lekami: Chloromyce­tinum succinatum, Benadryl, Hydrocortisonum succinatum, Luminalum Natrium, Amidoxal.
       Zjawisko interakcji występuje pomiędzy penicyliną G i lekami: Me­phenytoinum, Hydroxyzinum hydrochloricum, Tetracyclinum hydrochlo­ricum, Thiopental.
       Siarczan streptomycyny inaktywuje leki: Calcium gluconatoglucohe-ptonatum, Chlorothiazidum, Mephenytoinum, Erythromycinum glucohe­ptonatum, Heparinum, Nitrofurantoinum, Luminalum Natrium, Natrium hydrocarbonicum, Amidoxal.
       Szczególnie wiele niezgodności występuje pomiędzy chlorowodorkiem wankomycyny i innymi lekami
       W interakcji z chlorowodorkiem kanamycyny pozostają: Aminophyl-linum, Chloromycetinum succinatum, Chlorothiazidum, Mephenytoinum, Heparinum, Hydrocortisonum succinatum, Meticillinum, Nitrofuranto­inum, Penicillinum G, Luminalum Natrium, Natrium hydrochloricum, Tetracyclinum hydrochloricum, Yitaminum B complex z Yitaminum C, Yitaminum K1.
       Do wykrywania substancji o działaniu inaktywującym antybiotyki stosuje się metody biologiczne, używane do oznaczania mocy antybio­tyków. Należą do nich (patrz str. 54—57): metoda cylinderkowa, meto­da krążków bibułowych, rozcieńczeń seryjnych, podwójnie stopniowa­nych płytek agarowych i turbidymetryczna.
Metoda cylinderkowa

       Do wykrywania substancji inaktywujących antybiotyki i oznaczania inaktywacji konieczna jest modyfikacja tej metody. Przygotowanie pły­tek i ustawianie cylinderków nie różni się od stosowanego w metodzie miareczkowania antybiotyków. Przygotowuje się roztwory o różnych stężeniach substancji badanej i antybiotyku. Ze względu na to, że ewen­tualne przereagowanie substancji badanej z antybiotykiem wymaga czasu, pozostawiamy kolbki w temperaturze 37°C na 6 godzin. Nastę­pnie napełniamy tymi roztworami cylinderki. Do każdego badania do­łączamy kontrolę, którą stanowią wzorcowe roztwory antybiotyku oraz roztwory badanej substancji. Porównanie stref zahamowania dla roztwo­ru z samym antybiotykiem i analogicznego roztworu z substancją ba­daną pozwala wywnioskować, czy zachodzi proces inaktywacji anty­biotyku. W przypadku inaktywacji antybiotyku strefy zahamowania są tym mniejsze, im silniejsze działanie inaktywujące wywiera badana substancja. Przy bardzo silnych inaktywatorach strefy zahamowania mogą w ogóle nie wystąpić. Należy wtedy powtórzyć badania, zwięk­szając ilość antybiotyku w probówce lub zmniejszając stężenie substan­cji inaktywującej. Po odczytaniu wielkości stref zahamowania przez roztwór antybiotyku o znanym stężeniu i antybiotyku z substancją ba­daną możemy określić, jaki procent antybiotyku został zinaktywowany.

Przykład obliczania stopnia inaktywacji:

Strefa zahamowania wzrostu przez antybiotyk o mocy l j./ml = = 24 mm. Strefa zahamowania wzrostu przez antybiotyk i substancję badaną = = 19,0 mm. Z krzywej wzorcowej odczytujemy, jakiej ilości antybiotyku odpo­wiada strefa zahamowania równa 19 mm. Po odjęciu obu wartości otrzy­mujemy ilość antybiotyku, która została zinaktywowana.

Metoda krążków bibułowych

       Płytki przygotowuje się tak, jak przy oznaczaniu mocy antybiotyków, z tą jednak różnicą, że dodaje się do podłoża odpowiednią ilość anty­biotyku. Po posianiu drobnoustrojów na płytkach, na ich powierzchni układa się w równych odstępach krążki bibułowe wysycone roztworem badanej substancji i jeden krążek nasycony roztworem fizjologicznym chlorku sodowego, stanowiący kontrolę. Płytki należy następnie inkubować przez 24 godziny. W przypadku braku działania inaktywującego, wzrost dookoła krążka nie wystąpi. Działanie inaktywujące spowoduje powstanie strefy wzrostu drobnoustrojów. Z wielkości strefy wzrostu możemy się zorientować o sile działania badanej substancji.

Metoda rozcieńczeń seryjnych

       W metodzie rozcieńczeń seryjnych postępuje się podobnie jak przy oznaczaniu mocy antybiotyku. Przygotowuje się dwa równoległe szere­gi rozcieńczeń — jeden z antybiotykiem, drugi — z antybiotykiem i ba­daną substancją. W przypadku braku działania inaktywującego, w obu rzędach probówek zahamowanie wzrostu nastąpi w tym samym rozcień­czeniu. Jeżeli natomiast badany związek wykazuje działanie inaktywujące, to zahamowanie wzrostu w szeregu rozcieńczeń zawierającym antybiotyki i substancję badaną wystąpi w rozcieńczeniu mniejszym niż w rzędzie wzorcowym. Z wielkości przesunięcia zahamowania mo­żemy obliczyć, jaka ilość antybiotyku została zinaktywowana.

Metoda płytek podwójnie stopniowanych

       W tej metodzie dodajemy do dolnego skosu agarowego substancję inaktywującą, a do górnego — antybiotyk. Na płytkę nalewa się najpierw 10 ml podłoża agarowego z badaną substancją, którą sprawdzamy, czy wykazuje właściwości inaktywujące dany antybiotyk. Podłoże na płytce pozostawia się do zestalenia w po­zycji skośnej (ryc. 12). Następnie ustawia się płytkę w pozycji poziomej i nalewa 10 ml podłoża z antybiotykiem.

Przygotowanie podwójnie stopniowanych płytek agarowych

W ten sposób na powie­rzchni płytki otrzymuje się stopniowo zmieniające się stężenia substan­cji badanej, zależnie od grubości dolnej warstwy. Po posianiu szczepu wzorcowego, wrażliwego na antybiotyk, i odpowiednim okresie inkuba­cji otrzymuje się strefę wzrostu i strefę zahamowania wzrostu. Znając wielkość strefy zahamowania wzrostu dla płytki z antybiotykiem, ale bez „inaktywatora” stwierdzamy, czy badana substancja wpływa na osłabienie aktywności antybiotyku. Jeśli substancja działa inaktywująco na antybiotyki, to strefa zahamowania wzrostu jest mniejsza niż na płytce kontrolnej.

---