1. Tytuł: Wpływ czynników zewnętrznych na różne grupy mikroorganizmów

2. Datę(y) odbycia ćwiczenia.16 i 23 maja 2007

4. Cel ćwiczenia :

"Określenie i porównanie wpływu różnych czynników na grzyby oraz bakterie: pałeczki i laseczki ”

5.Wstęp teoretyczny:

Na aktywność życiową mikroorganizmów decydujący wpływ wywierają czynniki środowiskowe, zarówno fizyczne jaki i chemiczne. Efekty tych oddziaływań zależą od ich natury i stężenia, jak również od właściwości organizmu, na który wpływają. Znajomość wpływu czynników fizycznych i chemicznych na życiową aktywność mikroorganizmów pozwala z jednej strony kierować wydajnością prowadzonych przez nie reakcji enzymatycznych, z drugiej - na zahamowanie ich wzrostu lub wręcz zabicie, o ile są niepożądane w danym środowisku. W praktyce do niszczenia mikroorganizmów wykorzystuje się najczęściej z czynników fizycznych: temperaturę i promieniowanie UV, natomiast z czynników chemicznych: środki utleniające, sole metali ciężkich, środki powierzchniowo czynne oraz antybiotyki.

Wpływ temperatury:

Wzrost, rozmnażanie komórek bakterii i procesy fizjologiczne katalizowane przez enzymy zależą w dużym stopniu od temperatury. Ze względu na białkowy charakter enzymów zakres temperatury jest ograniczony trzema temperaturami kardynalnymi: minimalną (poniżej której ustają procesy metaboliczne), optymalną (w niej następuje najszybszy rozwój komórek), maksymalną (powyżej której następuje śmierć komórki). Ze względu na wyróżnione wyżej zakresy temperaturowe wyróżniamy: bakterie psychrofilne, bakterie mezofilne, bakterie termofilne. Wysokie temperatury działają bakteriobójczo i wykorzystywane są w procesie pasteryzacji (proces, w którym niszczone są jedynie formy wegetatywne w temperaturze 65-90 ⁰C) oraz w procesie sterylizacji (proces, który prowadzi do zniszczenia wszystkich mikroorganizmów łącznie ze sporami w temperaturze powyżej 100 ⁰C). Do określenia wrażliwości bakterii na wysokie temperatury służy punkt śmierci cieplnej (najniższa temperatura, w której następuje zabicie komórek po 10 minutach) i czas śmierci cieplnej (czas potrzebny do zabicia wszystkich komórek w określonej temperaturze).

Działanie promieni UV:

Mechanizm pochłaniania promieni UV polega na silnym pochłanianiu promieni przez zasady purynowe i pirymidynowe. W naświetlonych komórkach bakterii w nici DNA cytozyna ulega hydratacji, tworzą się dimery cytozyny, tyminy i cytozynowo -tyminowe. Zmiany takie mogą uniemożliwić replikację DNA i spowodować śmierć komórki lub mogą prowadzić do powstania mutantów. Szkodliwe działanie UV można odwrócić przez zjawisko fotoreaktywacji. Niektóre bakterie chronią się przed fotooksydacją wytwarzaniem karotenoidów.

Promienie UV wykorzystuje się do sterylizacji.

Działanie metali ciężkich:

Niektóre metale ciężkie już w niskich stężeniach działają danaturująco na enzymy komórek mikroorganizmów (działanie oligodynamiczne). Nieorganiczne i organiczne sole metali ciężkich wiążą grupy tiolowe -SH enzymów i w ten sposób zmieniają strukturę trzecio- i czwartorzędową białek. Ponadto wywołują one zmianę ujemnych ładunków koloidów powodując ich wypadanie z roztworu. Toksyczne właściowości soli metali ciężkich są wykorzystywane w dezynfekcji.

Działanie antybiotyków:

W środowisku naturalnym mikroorganizmów występuje zjawisko antybiozy (niektóre mikroorganizmy wydzielają do podłoża substancje, które powodują śmierć innych). Antybiotyki możemy podzielić na naturalne i syntetyczne. Antybiotyki mogą uszkadzać struktury wrażliwych komórek, hamować syntezę ściany i błony komórkowej, interferować z reakcjami włączony, w procesy energetyczne lub syntezę białek bakterii opornych na działanie antybiotyków, substancje te są zatrzymywane przez ścianę komórkową, albo są rozkładane przez specyficzne enzymy.

6. Metody badań:

a) Wpływ naświetlania promieniami UV na mikroorganizmy:

- materiały:

• hodowla pałeczek, laseczek i grzybów

- pożywki:

• agar odżywczy podłoże Czapka dla grzybów

- Wykonanie:

• Nasz szczep wysialiśmy metodą powierzchniową na dwie płytki Petriego z agarem odżywczy. Bakterie rozprowadziliśmy równomiernie na podłożu za pomocą głaszczki. Następnie jedną z naszych prób poddaliśmy działaniu promieniowania UV. Bakterie z dwóch prób hodowaliśmy w temperaturze 22 ⁰C przez siedem dni.

b) Oddziaływanie różnych ANTYBIOTYKÓW na mikroorganizmy:

- materiały:

• hodowla pałeczek, laseczek i grzybów

- pożywki:

• agar odżywczy podłoże Czapka dla grzybów

- odczynniki:

• krążki z antybiotykami: Neomycinem(N30), Polimixina B(Pb300), Chloramphenical(C30), Penicillin G(P10) i S10

- Wykonanie:

• Płytkę Petriego podzieliliśmy na 5 części. Następnie wykonaliśmy posiew powierzchniowy na płytkę z agarem odżywczym. Przy użyciu jałowej pęsety rozłożyliśmy krążki z antybiotykami na każdą część płytki. Posianą płytkę z krążkami wstawiliśmy do termostatu. Inkubowaliśmy ją w temperaturze 37 ⁰C przez siedem dni.

c) Oddziaływanie METALI CIĘŻKICH na mikroorganizmy:

- materiały:

• hodowla pałeczek, laseczek i grzybów

- pożywki:

• agar odżywczy i podłoże Czapka dla grzybów

- odczynniki:

• sole metali ciężkich: CrCl₂, K₂Cr₂O₇, CdCl₂, CuSO₄ i związek srebra (skład jest tajemnicą producenta)

- Wykonanie:

• Płytkę Petriego podzieliliśmy na 4 części. Następnie wykonaliśmy posiew metodą powierzchniową wysiewając 0,1 cm3 na płytkę z agarem odżywczym. Na płytkach z badanym szczepem ułożyliśmy krążki bibułowe, które wcześniej zanurzyliśmy w roztworach odpowiednich soli metali ciężkich. Osobna płytke przeznaczamy na badanie wpływu srebra umieszczając na jej środku nasączony krążek. Płytki inkubowaliśmy w temperaturze 37 ⁰C przez siedem dni.

7. Wyniki analiz

a) Promieniowanie UV

	kontrola	5minut	10minut	15minut
Laseczki	Duży wzrost nie można rozróżnić pojedynczych koloni	+ + + + Pojawiają Się pierwsze pojedyncze kolonie ale wzrost jest nadal bardzo obfity	+ + Wzrost obfity	+ Kolonie nieliczne ale bardzo rozrośnięte
Pałeczki	Jak wyżej	+ Duża redukcja liczebności mikroorganizmów	+ Duża redukcja liczebności mikroorganizmów	+ Duża redukcja liczebności mikroorganizmów. W miejscu w którym padał cień szkła i mikroorganizmy były osłonięte przed działaniem UV obserwujemy wzrost w na powierzchni którą pokrywał cień. Udowadnia to doświadczalnie, że Szkło jest nieprzepuszczalne dla promieni UV.
Grzyby	Duży płatowaty wzrost	+ + + + Bardzo duży wzrost	+ + +	+ + Mikroflora ulega widocznej redukcji dopiero po 15 minutach naswietlania

b) ANTYBIOTYKI (badamy strefę zahamowania wzrostu)

antybiotyk	Laseczki	Pałeczki
N30	25mm	15mm
C30	15mm	17mm
P10	20mm	16mm
Pb300	12mm	9mm
S10	20mm	16mm

Antybiotyki nie wykazały działania na grzyby

c)METALE

	Grzyby	Laseczki	Pałeczki
Pb	------------	-----------	4mm
Cr	23mm	10mm	19mm
Cu	------------	5mm	2mm
Ag	1mm	+	3mm
Cd	------------	15mm	12mm

8.Wnioski:

Największą odporność na działanie promieni UV wykazały grzyby a wśród badanych bakterii - laseczki. Laseczki wytwarzają endospory, które po ustaniu działania szkodliwego czynnika mogą odtworzyć szczep (przetrwalniki mają bardzo grube ściany komórkowe oraz zawierają kwas pikolinowy który wchodząc w kompleks z wapniem dodatkowo chroni spory).

Większą odpornością na antybiotyki wykazały się pałeczki (mniejsza strefa zahamowania wzrostu w stosunku do laseczek). Antybiotyki nie wywarły zaś zauważalnego wpływu na grzyby. Odporność na antybiotyki jest cechą gatunkową

Wśród metali ciężkich najbardziej szkodliwy wpływ miał sześciowartościowy chrom który łatwiej przenika do komórki ze względu na swoje podobieństwo molekularne do siarczanów i fosforanów. Najmniej szkodliwy okazał się ołów ponieważ jest najmniej mobilny wśród badanych metali.

---