Laboratorium 11.

Wpływ czynników chemicznych na drobnoustroje

Wyniki z poprzednich laboratoriów: ani E. Coli ani B. Subtilis nie zostały zabite w żadnej z badanych temperatur w ciagu 10 minut, choć ich wzrost został ograniczony.
Geobacillus stearothermophilus (?) – kontrola procesu sterylizacji;
sporal (polski produkt) – mała saszetka ze sporami Geobacillusa; nie przeżywa ona przez 15 minut; jeśli sterylizacja przebiegła prawidłowo, to one nie przeżyją; a jeśli nieprawidłowo (np. przez spadek napięcia spadnie temperatura choć na chwilę), to pojedyncze przetrwalniki wykiełkują po zalaniu agarem;
b. oporne na wysoką temperaturę są bakterie gramujemne;
S. Marscescens mogłaby nie przeżyć;
E. Coli zginęły po 40 minutach, B. Subtilis nawet po 40 min nadal żyły.
UV: E. Coli zginęło po 90s;
zjawisko: gdy się krótko naświetla, to giną, a gdy dłużej to mogą przeżyć, możliwe, że kiedy krótko naświetlamy, to bakteria nie zdąży uruchomić swoich mechanizmów ochronnych, a gdy czas naświetlania wydłużymy, to mogą zdążyć je uruchomić i przeżyć;
antybiotyki – naświetla się bakterie, tworząc mutanty, które produkują antybiotyki, ale gdy są „zbyt zmutowane” to mogą po kilku posiewach zginąć, więc lepiej mieć mniej zmutowane (produkujące mniejsze ilości), ale żyjące dłużej.
Bacillus i Luteus nie wysychają, Marscescens wysycha.

Ćwiczenia:

Ćw. 1 Wpływ pH
Rozlać do 5 probówek po 5 ml bulionów o pH 3, 5, 7, 9 i 10 i zasiać (100 μl) dowolnie wybraną bakterię (P. Fluorescens). Zostawić do inkubacji.
Bakterie najlepiej rosną w pH obojętnym, ale mogą też rosnąć w skrajnych (ekstremofile); zwykle bakterie wolą mocno alkaliczne niż mocno kwaśne pH.
wyniki: W pH 3 nie urosły, w pozostałych tak.

Ćw. 2. wpływ barwników (fioletu krystalicznego)
Wylać po 1 ml rozcieńczeń 1:100 i 1:500 fioletu na czyste, puste szalki Petriego. (można jednym tipsem, najpierw 1:500, potem 1:100) Zalać gorącym, upłynnionym agarem (z aparatu Kocha). Delikatnie poruszać płytką w celu dokładniejszego rozprowadzenia. Zostawić do zastygnięcia. Podzielić denko na 4 części, w każdej zasiać inną bakterię (S. Marscescens, E. Coli, P. Fluorescens, M. Luteus). Tak samo zrobić na drugiej płytce. Ezą siać bardzo delikatnie (świeżo zastygnięty agar z barwnikiem może się łatwo uszkodzić).
fiolet krystaliczny (pioctamina) – bdb środek przeciwbakteryjny, kiedyś stosowany na rany, chore gardło czy dziąsła;
wyniki: 1:500 urosły wszystkie, ale niektóre słabo (E. Coli), 1:100 słabo rosły; rozcieńczenie fioletu na płytce było 10x większe niż podane wcześniej.

Ćw. 3. Sporządzanie antybiotygramu
Wylać 1 ml dowolnie wybranej bakterii (P. Fluorescens) na podłoże Műllera – Hintona (NH). Rozlać dokładnie po całej płytce, potem położyć ją pod skosem, żeby nadmiar bakterii spłynął, poczekać 3 minuty. Pęsetę do spirytusu i w ogień. Nałożyć w odstępach 4 antybiotyki:
1) Streptomycyna;
2) Erytromycyna;
3) Bacytracyna;
4) Nitrofurantroina;
Jeśli antybiotyk zabija dane bakterie, to pojawi się przy nim strefa zahamowania wzrostu (gdy bakteria jest wrażliwa). Nie odwracać płytki!
wyniki: Pseudomonas są oporne na antybiotyki. M. Luteus był wrażliwy na 3 z nich.

Ćw. 4. Wpływ czynników dezynfekcyjnych na E. Coli
Wybrać 1 z czynników:
1) etanol 70% i 96%
2) jodyna 1% i 2%
3) fenol 1%, 2% i 5%
Wlać po 5ml do probówki, włożyć na 3-5 minut do łaźni , potem wlać 0,5 ml E. Coli, starannie wymieszać i wstawić do łaźni na 30 minut. Pobrać po 100μl próbki i zaszczepić do podłoża laktozowego (do fermentacji cukrów).
Jest zielone (inny barwnik niż wcześniej). Jeśli E. Coli przeżyje, to sfermentuje laktozę.
wyniki: Etanol 70% ma lepsze właściwości dezynfekcyjne niż 96% - w 96% przeżyły, w 70% nie.
Fenol – 1% przeżyły, w reszcie nie.

TEORIA

Czynnik bakteriobójczy – środek, który zabija bakterie, ale nie niszczy endospor;
Środek dezynfekcyjny – środek, który zabija bakterie chorobotwórcze i saprofityczne, a nie zabija endospor;
Środki antyseptyczne – środki lecznicze stosowane zewnętrznie;
Postępowanie antyseptyczne – działanie w celu zabicia bakterii;
Postępowanie aseptyczne – działanie „bezbakteryjne”, jałowe;

Jony wodorowe
Dla każdego organizmu istnieje optymalne stężenie jonów wodorowych. Wartości pH poniżej i powyżej których organizmy już nie rosną to maksimum i minimum stężenia jonów wodorowych dla danego organizmu. Najwięcej drobnoustrojów rośnie w pobliżu pH obojętnego.
Odczyn (pH) wpływa na stan koloidalny plazmy, przepuszczalność ściany komórkowej i błony cytoplazmatycznej, funkcjonowanie enzymów.
Bakterie fermentujące cukry zmieniają pH do tak niskiego, że wstrzymuje ono ich dalszy rozwój.
W odczynie kwaśnym lepiej rosną bakterie fermentacji octowej, mlekowej, niektóre gatunki Thiobacillus (optimum pH 2-2,8). W alkalicznym bakterie nitryfikacyjne, Azotobacter…

Barwniki
Barwniki anilinowe (kwaśne i zasadowe) hamują wzrost bakterii przez hamowanie podziałów komórkowych. Bakterie gramdodatnie są bardziej wrażliwe niż gramujemne (wyjątek – bakterie kwasooporne). Bakteriostatyczne działanie barwników jest wykorzystywane do sporządzania pożywek wybiórczych.

Środki dezynfekcyjne:
1. Kwasy – mocne kwasy są bardziej bakteriobójcze;
2. Alkalia (zasady) – działanie zależy od stopnia dysocjacji, specjalnie toksyczne są KOH, NaOH, LiOH, NH4OH;
3. Sole – w małym stężeniu stymulują wzrost bakterii, w dużym działają hamująco, a nawet toksycznie. Dwuwartościowe kationy są bardziej toksyczne niż jednowartościowe i sole metali ciężkich są bardziej toksyczne niż lekkich.
na podstawie toksyczności kationów:
- kationy pierwszej grupy – dają sole często występujące w protoplazmie bakterii, nietoksyczne, np. K, Na, Mg, Ca, Li, Sr)
- kationy drugiej grupy – są bardziej toksyczne (Ni, Zn, Cu, Fe, Pb, Al., Hg)
Wrażliwość różnych gatunków jest różna na różne sole – wykorzystano to do sporządzania podłoży wybiórczych i do klasyfikacji bakterii.
Znane są przypadki antagonistycznego działania soli i znoszenia szkodliwego działania jednej soli przez drugą (CaCl2 znosi szkodliwe działanie LiCl), a nieraz kombinacja dwóch soli daje silniejszy efekt (np. FeCl2 + FeCl3).

Środki utleniające
dostarczające wolny tlen / uwalniające go z innych związków są silnie bakteriobójcze (woda utleniona, nadmanganian potasu, połączenia chloru [najczęściej stosowane podchloryny i chloraminy], bromu, jodu [najczęściej stosowane 2-7% r-r jodu w alkoholu (jodyna), jodoform (CHI3), trójchlorek jodu (ICL3)]).

Środki redukujące
najbardziej znany: formaldehyd, który zabija formy wegetatywne i przetrwalniki.

Fenole i krezole
stosowane jako środki bakteriobójcze. Większość związków z tej grupy jest słabo rozpuszczalnych w wodzie i dlatego są stosowane w postaci emulsji (lizol – roztwór orto, meta i para krezolu w mydle).

Detergenty
substancje powierzchniowo czynne, działają przez zmiany napięcia powierzchniowego. W zależności od rodzaju części hydrofilowej:
- anionowe – mało toksyczne (stosowane w przemyśle i gospodarstwie domowym);
- kationowe – detergenty kationowe silnie bakteriobójcze, np. sterinol;
- niezdysocjowane – nie wykazują działania bakteriobójczego, stosowane są do obniżania napięcia powierzchniowego;

Alkohole
alkohol absolutny jest słabo bakteriobójczy, ale wraz z dodaniem wody wzrasta jego aktywność antybakteryjna (max. 77% stężenia). Zabójcze działanie alkoholi alifatycznych wzrasta wraz z ciężarem cząsteczkowym do alkoholi C5, a następnie spada do C11. Alkohole wyższe nie są używane jako środki bakteriobójcze (słabo rozpuszczalne).

Chemoterapeutyki i antybiotyki:
Sulfonamidy
środki wykazujące działanie bakteriostatyczne in vitro, a bakteriobójcze in vivo. Podstawowy związek: amid kwasu sulfanilowego (sulfonamid). Mechanizm działania sulfonamidów opiera się na strukturalnym podobieństwie tych związków do kwasu p-aminobenzoesowego (PABA), który jet pobierany przez liczne bakterie do syntezy kwasu foliowego. Sulfonamidy hamują więc wzrost tych komórek, które same syntetyzują kwas foliowy.
Z punktu widzenia efektu sulfonamidu można podzielić bakterie na 3 grupy:
- gramujemne bakterie, które nie mogą pobierać gotowego kwasu foliowego wskutek czego ich wzrost jest zahamowany przez sulfonamid; proces jest odwracalny przez dodanie kwasu foliowego;
- gramdodatnie bakterie, które nie pobierają gotowego kwasu foliowego (hamowanie ich wzrostu przez sulfonamidy jest odwracalne przez dodanie kwasu foliowego);
- gramdodatnie bakterie, które pobierają gotowy kwas foliowy i nie są wrażliwe na sulfonamidy;
W wielu przypadkach kombinacja sulfonamidów i antybiotyków daje lepsze efekty niż stosowanie ich oddzielnie.

Antybiotyki
substancje swoiste wytwarzane przez drobnoustroje, działające bakteriobójczo lub bakteriostatycznie. Są to substancje bardzo różne pod względem budowy chemicznej i różny jest też ich mechanizm działania i swoistość.