Wpływ czynników fizycznych na drobnoustroje

Ćwiczenia

Ćw. 5. Wpływ temperatury na wzrost bakterii
Wziąć 2 szalki Petriego. Podzielić denko każdej z nich na 4 równe części. W każdym sektorze posiać ezą inną bakterię (S. Marcescens, E. Coli, M. Luteus, B. Subtilis) - podpisać odpowiednie fragmenty dna. Jedną szalkę podpisać 4°C, drugą 65°C - to temperatury inkubacji.
wyniki: w 4°C rosną wszystkie bakterie, tylko B. Subtilis słabo; w 65°C nie rosną żadne bakterie;

Ćw. 6. Wpływ wysychania na przeżywalność drobnoustrojów
Wziąć 2 puste, sterylne szalki Petriego. Na każdą z nich wlać po 100μl jednej, dowolnie wybranej bakterii (Serratia Marcescens). Jedną szalkę wstawić do koszyka dnem do dołu- nie należy jej odwracać! Drugą zalać płynnym agarem (z aparatu Kocha).
wyniki: zalana - rosną;

TEORIA: Oddychanie beztlenowe

Pojęcia:
autotrofy - def. Organizmy, które mogą wykorzystywać CO₂ jako jedyne źródło węgla (czyli są samożywne); grupa organizmów, która pobiera w pokarmie jedynie utlenione związki węgla (kwas węglowy lub jego bezwodnik - CO₂) i przy przetwarzaniu musi je zredukować; taki proces redukcji wymaga nakładu energii z zewnątrz (świetlnej lub chemicznej);
heterotrofy - def. Organizmy, które wymagają choć jednego związku organicznego w pokarmie, który służy im jako główne źródło węgla (czyli są cudzożywne);
chemotrofy - organizmy, które wykorzystują energię chemiczną (uwalnianą np. przez utlenianie związków nieorganicznych lub nieorganicznych);
chemolitotrofy - bakterie, które korzystają z energii uwolnionej wskutek utlenienia związków nieorganicznych, np. zredukowanych soli azotu, siarki, żelaza;
chemoorganotrofy - organizmy, które mogą wykorzystywać jedynie energię ukrytą w związkach organicznych;
ektoenzymy - egzoenzymy (enzymy produkowane we wnętrzu komórki przez nią samą, a następnie wydzielane do środowiska zewnętrznego) stanowiące element błony komórkowej z centrum aktywnym zwróconym na zewnątrz komórki;
proteazy - enzymy rozkładające białka na krótkie peptydy lub aminokwasy;
esterazy (lipazy) - enzymy hydrolizujące tłuszcze;
poliozydazy - enzymy rozkładające wielocukry na dwucukry lub cukry;
nukleazy - enzymy rozkładające kwasy nukleinowe;
amylazy - enzymy hydrolizujące skrobię;
celulazy - enzymy hydrolizujące celulozę;
pektynazy - enzymy hydrolizujące pektyny;
oligotrofy - organizmy posiadające zdolność do odżywiania się nawet śladowymi ilościami pokarmu;
wiązanie azotu atmosferycznego,
nitrogenaza (co to jest, jak działa) - układ enzymatyczny zdolny do aktywacji N₂ i redukcji azotu do NH₃; jest złożony z dwóch białek żelazowo-siarkowych: nitrogenazy i reduktazy nitrogenazowej; właściwa nitrogenaza w obecności dawców elektronów redukuje N₂ do NH₃, a centrum katalityczne tej reakcji stanowi koenzym żelazowo-molibdenowy, stąd właściwa nitrogenaza nazywana jest też białkiem żelazowo-molibdenowym (Mo-Fe-białko). Po zredukowaniu N₂ do amoniaku utleniona nitrogenaza jest regenerowana do postaci zredukowanej przez reduktazę nitrogenazową, zwaną białkiem żelazowym (Fe-białko). Dawcą elektronów jest ferredoksyna (dość proste białko żelazowo-siarkowe zawierające żelazo związane nie hemowo, ale bezpośrednio z łańcuchem peptydowym - niesłychanie silny związek redukujący) lub flawodoksyna. Wiązanie azotu atmosferycznego jest bardzo kosztowne. Redukcja jednej cząsteczki N₂ wymaga hydrolizy co najmniej 16 cząsteczek ATP. Ubocznym produktem wiązania jest wodór cząsteczkowy. Nadmiar wodoru może powodować przesunięcie równowagi w lewo, hamując proces redukcji azotu. U wielu bakterii jest specjalna hydrogenaza umożliwiająca cykliczny obrót wodoru (H₂ <-> 2H⁺). Nitrogenaza jest hamowana przez tlen. W bakteriach tlenowych enzymy te są związane z błonami, w postaci specjalnych cząsteczek, co zmniejsza ich wrażliwość na tlen.


oddychanie - (utlenianie biologiczne) proces biologiczny, w którym energia chemiczna utlenianego substratu organicznego jest przez organizm wykorzystywana do przeprowadzenia endoergicznych reakcji albo przekształcana w energię cieplną, mechaniczną, świetlną lub elektryczną;
fermentacja - forma beztlenowego procesu biologicznego utleniania, w której część cząsteczki substratu oddechowego jest utleniana, a część - odbierająca od niej elektrony - redukowana;
oddychanie tlenowe - proces biologicznego utleniania, w którym ostatecznym biorcą elektronów jest tlen cząsteczkowy; do fermentacji zdolne są, obok licznych bakterii, wyjątkowo niektóre grzyby mogące żyć beztlenowo, np. drożdże;
oddychanie beztlenowe - proces biologicznego utleniania, w którym ostatecznym biorcą elektronów jest pochodzący z zewnątrz związek organiczny (np. fumaran) lub utleniony związek nieorganiczny (np. azotan, siarczan, węglan); substrat oddechowy zostaje rozbity i przekształcony, po czym jeden produkt ulega utlenieniu, a drugi redukcji; w przebiegu fermentacji brak etapów pośrednich przenoszenia elektronów, a NAD przenosi elektrony i protony oderwane przez dehyrogenazę od związku utlenianego, wprost na związek organiczny, odgrywający rolę ostatecznego akceptora wodoru;
redukcja azotanów - bakterie najczęściej wykorzystują azotany, które są przekształcane do bardziej zredukowanych związków (tlenku azotu, podtlenku azotu, azotu cząsteczkowego); elektrony odłączane od substratu oddechowego po przejściu przez łańcuch oddechowy są przyłączane za pośrednictwem dysymilacyjnej reduktazy azotanowej do azotanów, które są przez to redukowane do azotynów; denitryfikacja - proces utraty azotu jeśli produkty redukcji azotanów są gazami, w środowisku, gdzie azotany są wykorzystywane jako ostateczne akceptory; oddychanie z jednoczesną redukcją azotanów jest jedynym typem oddychania poza fermentacją u niektórych beztlenowców;

redukcja siarczanów - siarczany są wykorzystywane jako akceptory elektronów tylko przez bezwzględnie beztlenowe Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfolobus (w osadach dennych zbiorników wodnych i wodach podziemnych, zwł. w sąsiedztwie ropy naftowej oraz w przewodzie pokarmowym zwierząt; substratem oddechowym są dla nich kwasy organiczne, etanol, indol, benzoesan; większość tych bakterii utlenia substraty tylko do octanu; w wyniku redukcji siarczanów powstają duże ilości siarkowodoru; kataboliczna redukcja zużywa duże ilości energii (1 cz. ATP na 1 cz. H₂SO₄), zysk energetyczny jest więc ograniczony do około 150kJ/mol;
redukcja węglanów i CO₂ - powstaje z nich metan; bakterie metanogenne - bakterie zdolne do wytwarzania metanu, tworzą odrębną grupę Prokaryota, Archaeobacteria, nie zawierającą mureiny, o innej budowie błony i nieco odmiennych chromosomach; utleniają one wodór do H⁺, redukując dwutlenek węgla do metanu; zysk energetyczny jest niewielki, wystarcza do wytworzenia jednej cząsteczki ATP na 1 cząsteczkę powstającego metanu; redukcja CO₂ to proces wieloetapowy; wiele bakterii metanogennych odżywia się autotroficznie, inne ok. 60% węgla czerpią z octanów; bakterie metanogenne nie są zdolne do wykorzystywania siarczanów jako źródła siarki, ale muszą korzystać z H₂S; bakterie homoacetogenne - również przeprowadzają utlenianie wodoru z jednoczesną redukcją węglanów; są to, podobnie jak liczne bakterie tworzące metan, autotrofy, ale procesy produkcji węglanów i wiązania CO₂ przebiegają u nich całkowicie odmiennie;
mikroaerofile

fermentacja glikolityczna - glikoliza (jakie nazwy, szczepy je prowadzące, produkty), opracować!!

fermentacja bez glikolizy (jw. Przykłady, produkty, drobnoustroje), opracować!!

zależność rozwoju bakterii od warunków środowiska (377-393 Kunicki); (ogólne zahamowanie metabolizmu poprzez głód, denaturację, uszkodzenie osłon komórkowych, zahamowanie syntezy białka [działanie antybiotyków]);

Laboratorium 10. 14.05.2013r.

Wpływ czynników fizycznych na drobnoustroje cd.

Punkt śmierci cieplnej - najniższa temperatura, w której dana bakteria ginie po 10 minutach;
Czas śmierci cieplnej - czas potrzebny do zabicia bakterii w danej temperaturze;

Ćwiczenia:

Ćw. 1. próba wykrycia kwasy masłowego
Pobrać 2-3 ml z probówki z ćwiczenia 3 z poprzednich laboratoriów do sterylnej probówki. Dodać kroplę FeCl₃, podgrzać w płomieniu palnika. Ciemnobrunatne/ zielonkawe zabarwienie świadczy o obecności kwasu masłowego.
Wynik: kwas masłowy obecny.

Ćw. 2. wykrywanie jonów amonowych - amonifikacja
Pobrać po 2-3 ml z próbek A i B z ćwiczenia 2 z laboratorium 8. Wkroplić do dołka na płytkę porcelanową i dodac po kropli odczynnika Nesslera (wykrywa jony amonowe). Ceglasty/ brązowy kolor świadczy o obecności jonów amonowych, intensywność zależy od ilości jonów.
Wynik: jony amonowe obecne w obu próbkach.

Ćw. 3. wykrywanie kazeiny
Na płytkę z agarem-ml z laboratorium 8, ćwiczenia 3 wlać 5% kwas trójchlorooctowy (TCA) [bardzo silnie denaturujący]. Jeśli na płytce jest jeszcze kazeina, to będzie się ona wytrącać w postaci mlecznego ścięcia białka (mętne, białe plamy). To pozwala na wykrycie właściwości proteolitycznych wobec kazeiny (albo innego konkretnego białka).

Ćw. 4. Wykrywanie skrobii
Płytkę ze skrobią z ćwiczenia 4, laboratorium 8, zalać płynem Lugola. Jeśli jest tam jeszcze skrobia, to stworzy ona fioletowy kompleks z płynem Lugola (bądź brązowe/bordowe zabarwienie, jeśli jest częściowo zhydrolizowana - z dekstrynami (wiązania 1,6-glikozydowe)).

Ćw.5. Wpływ wysychania
Na płytkę z wyschniętymi bakteriami z poprzedniego laboratorium wylać płynny agar-agar.

Ćw. 6. Punkt śmierci cieplnej
Do 4 sterylnych probówek wlać po 2 ml bulionu odżywczego. Wstawić probówki po jednej do łaźni wodnej o danych temperaturach: 45°C, 55°C, 65°C i 75°C na około 3 minuty (żeby się zagrzała zawartość). Dodać po 0,5 ml bakterii (E. Coli) do każdej probówki i ponownie wstawić do odpowiedniej łaźni wodnej na 10 minut. Podzielić denko płytki na 5 części i zrobić posiew ezą:

K- punkt kontrolny - hodowla wyjściowa;
45 - posiew bakterii z 45°C
55 - posiew bakterii z 55°C
65 - posiew bakterii z 65°C
75 - posiew bakterii z 75°C

Ćw. 7. Czas śmierci cieplnej
Do 4 sterylnych probówek wlać po 2 ml bulionu i wstawić wszystkie do łaźni wodnej 70°C na 3 minuty. Dodać po 0,5 ml bakterii (E. Coli) i wstawić z powrotem do łaźni. Co 10 minut wyciągać kolejną probówkę i robić posiew na płytce według wzoru:
K - kontrolny; hodowla wyjściowa
10' - probówka wyjęta po 10 minutach
20' - probówka wyjęta po 20 minutach
30' - probówka wyjęta po 30 minutach
40' - probówka wyjęta po 40 minutach

Ćw. 8. Wpływ UV
Z dowolnie wybranej bakterii (E. Coli) zrobić rozcieńczenie 10^-4: 1) 10^-1 (9 ml płynu fizj. + 1 ml bakterii); 2) 10^-3 (9,9 ml płynu fizj. + 100 μl bakterii z rozcieńczenia 10^-1); 3) 10^-4 (9 ml płynu fizj. + 1 ml bakterii z rozcieńczenia 10^-3;
Rozcieńczenie 10^-4 wylać na pustą szalkę Petriego i naświetlać pod lampą UV. (Wziąć ze sobą 3 probówki, pipetę automatyczną!) Po 20 s wziąć pierwszą próbkę do probówki. Po 40 s drugą, po 90 s trzecią. Zrobić posiew ezą na płytce:
K - hodowla wyjściowa po rozcieńczeniu 10^-4, próba kontrolna
20s- po 20 sekundach naświetlania
40s- po 40 sekundach naświetlania
90s- po 90 sekundach naświetlania

TEORIA wpływ czynników fizycznych

Temperatura
Bakterie mogą przeżyć pewien czas w bardzo szerokim zakresie temperatury (-250°C do 120°C), ale zakres, w którym wykazują aktywność życiową jest węższy i leży w granicach -9°C a 98°C. Dla poszczególnych gatunków zakres ten jest różny i dla każdego gatunku można wyróżnić 3 temperatury kardynalne: minimalną, optymalną i maksymalną.
Temperatura minimalna - najniższa temperatura, w której organizm może rosnąć.
Temperatura optymalna - rozmnaża się najszybciej; w niej zachodzi najszybciej wzrost bakterii; często jednak temp optymalna dla podziałów komórkowych różni się od temp optymalnej dla różnych procesów metabolicznych.
Temperatura maksymalna - najwyższa, w której może zachodzić wzrost.
Ze względu na różnice w optimum, minimum i maksimum bakterie dzieli się na:
a) psychrofilne - zimnolubne (optimum 15-20°C); saprofity i bakterie chorobotwórcze dla ryb; bezwzględne psychrofile - giną po kilku minutach w temp nieco wyższej niż 20°C (w zimnych morzach);
b) mezofilne - w średnich temperaturach (20-40°C); najbardziej rozpowszechnione w naturze; większość saprofitów występujących w środowisku naturalnym i wszystkie bakterie chorobotwórcze posiadające optimum zbliżone do temp ciała gospodarza;
c) termofilne - ciepłolubne (45-60°C); w nawozie, fermentujących resztach, jelitach niektórych zwierząt, gorących źródłach; gł. należą do rodzaju Bacillus;
Punkt śmierci cieplnej - najniższa temperatura, w której dana bakteria ginie po 10 minutach;
Czas śmierci cieplnej - czas potrzebny do zabicia wszystkich drobnoustrojów w danej temperaturze;
Niskie temperatury działają bakteriostatycznie, tylko niektóre gatunki (meningokoki, gonokoki…) giną szybciej w niskich temperaturach;
Młode komórki bakteryjne są wrażliwe na gwałtowne zmiany temperatury („szok zimna”), np. gwałtowna zmiana od -45°C do 10°C. W przypadku szybkiego obniżenia temperatury poniżej 0°C nie obserwujemy śmierci bakterii, ważne jest, by przy chłodzeniu woda zawarta w komórkach nie przeszła w stan krystaliczny, lecz aby zestaliła się jako substancja amorficzna, nie niszcząc ultrastruktur cytoplazmatycznyc.

Promieniowanie UV
Najbardziej efektywne są promienie o długości 230 nm - 275 nm, bo one są absorbowane przez kwasy nukleinowe i białka, co powoduje ich uszkodzenie. Szkodliwy wpływ UV nie jest nieodwracalny. Wiele bakterii poddanych działaniu UV w dawkach letalnych, a następnie wystawionych na światło widzialne, przeżywa naświetlanie. To zjawisko to fotoreaktywacja. Widzialna część światła nie szkodzi bakteriom, ale jeśli do hodowli doda się barwniki, np. błękit toluidynowy, safraninę itp., w stężeniu nietoksycznym, barwniki te uczulają bakterie tak bardzo, że te wystawione na światło słoneczne giną lub powstają mutanty. Ten efekt to uczulanie fotodynamiczne. W przypadku działania UV następują też zmiany w podłożu (np. tworzą się nadtlenki wodoru i wolne rodniki OH, które utleniają inne składniki, a te z kolei działają toksycznie na bakterie). Formy wegetatywne sa bardziej wrażliwe niż formy przetrwalnikowe.

Ciśnienie osmotyczne
W roztworze hipertonicznym (o stężeniu wyższym niż wewnątrz komórki) zachodzi zjawisko plazmolizy - kurczenie się protoplazmy na skutek wypływania na zewnątrz wody z komórki.
Oporne na wysokie ciśnienie osmotyczne są bakterie osmofilne lub halofilne (żyjące w morzach lub solankach). Większość bakterii jest jednak mało wrażliwa na zmiany ciśnienia osmotycznego, choć dla wielu jego wzrost jest czynnikiem hamującym wzrost. Usunięcie ściany komórkowej powoduje zwiększenie podatności na zmiany ciśnienia. Jeśli protoplast umieści się w roztworze hipotonicznym (o niższym ciśnieniu), np. w wodzie lub normalnym bulionie, ulega on plazmoptyzie - gwałtownie pęka na skutek wnikania wody do wnętrza zgodnie z gradientem stężeń, a treść protoplastu wydostaje się na zewnątrz.

Napięcie powierzchniowe
Napięcie powierzchniowe zwykłych podłoży waha się między 57, a 63 dyn (czysta woda ma 73 dyn). Niektóre substancje, np. CaCl₂ podnoszą napięcie, a niektóre je obniżają, np. C₂H₅OH, żółć, mydło, glicerol, Tween 80. Przy obniżeniu napięcie bakterie rosną nietypowo: bakterie rosnące w postaci kożuszka dają wzrost dyfuzyjny, powstają formy wydłużone, nieraz rozgałęzione po nierozłączeniu po podziale. Poniżej pewnej granicy następuje zahamowanie wzrostu.

Wysychanie
Śmierć bakterii spowodowana wysychaniem zachodzi na skutek denaturacji białek. Powolne wysychanie zabija szybciej niż szybkie. Uważa się, że białka znajdujące się w podłożu chronią bakterie, działając jako ochronny koloid, który łagodzi suszenie, stąd bakterie hodowane na podłożu zawierającym np. mleko, znoszą wysuszanie lepiej. Endospory są bardziej odporne na wysychanie niż formy wegetatywne i bakterie otoczkowe są odporniejsze od bezotoczkowych.

---