Sprawozdanie z laboratorium z mikrobiologii ogólnej

Temat: Wpływ czynników zewnętrznych na mikroorganizmy.

Data wykonania ćwiczenia: 16 i 23 maja 2007

I. Wstęp teoretyczny.

Na aktywność życiową mikroorganizmów decydujący wpływ wywierają czynniki środowiskowe, zarówno fizyczne jaki i chemiczne. Efekty tych oddziaływań zależą od ich natury i stężenia, jak również od właściwości organizmu, na który wpływają. Znajomość wpływu czynników fizycznych i chemicznych na życiową aktywność mikroorganizmów pozwala z jednej strony kierować wydajnością prowadzonych przez nie reakcji enzymatycznych, z drugiej - na zahamowanie ich wzrostu lub wręcz zabicie, o ile są niepożądane w danym środowisku.

Działanie promieni UV:

Mechanizm pochłaniania promieni UV polega na silnym pochłanianiu promieni przez zasady purynowe i pirymidynowe. W naświetlonych komórkach bakterii w nici DNA cytozyna ulega hydratacji, tworzą się dimery cytozyny, tyminy i cytozynowo -tyminowe. Zmiany takie mogą uniemożliwić replikację DNA i spowodować śmierć komórki lub mogą prowadzić do powstania mutantów. Szkodliwe działanie UV można odwrócić przez zjawisko fotoreaktywacji. Niektóre bakterie chronią się przed fotooksydacją wytwarzaniem karotenoidów.

Promienie UV wykorzystuje się także do sterylizacji.

Działanie metali ciężkich:

Niektóre metale ciężkie już w niskich stężeniach działają denaturująco na enzymy komórek mikroorganizmów (działanie oligodynamiczne). Nieorganiczne i organiczne sole metali ciężkich wiążą grupy tiolowe -SH enzymów i w ten sposób zmieniają strukturę trzecio- i czwartorzędową białek. Ponadto wywołują one zmianę ujemnych ładunków koloidów powodując ich wypadanie z roztworu. Toksyczne właściowości soli metali ciężkich są wykorzystywane w dezynfekcji.

Działanie antybiotyków:

W środowisku naturalnym mikroorganizmów występuje zjawisko antybiozy (niektóre mikroorganizmy wydzielają do podłoża substancje, które powodują śmierć innych). Antybiotyki możemy podzielić na naturalne i syntetyczne. Antybiotyki mogą uszkadzać struktury wrażliwych komórek, hamować syntezę ściany i błony komórkowej, interferować z reakcjami włączony, w procesy energetyczne lub syntezę białek bakterii opornych na działanie antybiotyków, substancje te są zatrzymywane przez ścianę komórkową, albo są rozkładane przez specyficzne enzymy.

II. Przebieg doświadczenia.

a) Wpływ naświetlania promieniami UV na mikroorganizmy:

- materiały:

• hodowla pałeczek, laseczek i grzybów

- pożywki:

• agar odżywczy, podłoże Czapka dla grzybów

- Wykonanie:

• Nasz szczep wysialiśmy metodą powierzchniową na cztery płytki Petriego z agarem odżywczym. Bakterie rozprowadziliśmy równomiernie na podłożu za pomocą głaszczki. Następnie poddaliśmy działaniu promieniowania UV trzy z wykonanych posiewów (odpowiednio na 5, 10 i 15 min) Ostatnia płytka stanowiła próbę kontrolną. Następnie bakterie pozostawiono do inkubacji na 7 dni.

b) Oddziaływanie różnych ANTYBIOTYKÓW na mikroorganizmy:

- materiały:

• hodowla pałeczek, laseczek i grzybów

- pożywki:

• agar odżywczy, podłoże Czapka dla grzybów

- odczynniki:

• krążki z antybiotykami: Neomycinem(N30), Polimixina B(Pb300), Chloramphenical(C30), Penicillin G(P10) i S10

- Wykonanie:

• Płytkę Petriego podzieliliśmy na 5 części. Następnie wykonaliśmy posiew powierzchniowy na płytkę z agarem odżywczym. Przy użyciu jałowej pęsety rozłożyliśmy krążki z antybiotykami na każdą część płytki. Następnie płytkę pozostawiliśmy do inkubacji na 7 dni.

c) Oddziaływanie METALI CIĘŻKICH na mikroorganizmy:

- materiały:

• hodowla pałeczek, laseczek i grzybów

- pożywki:

• agar odżywczy, podłoże Czapka dla grzybów

- odczynniki:

• sole metali ciężkich: CrCl₂, K₂Cr₂O₇, CdCl₂, CuSO₄ i związek srebra (skład jest tajemnicą producenta)

- Wykonanie:

• Płytkę Petriego podzieliliśmy na 4 części. Następnie wykonaliśmy posiew metodą powierzchniową wysiewając 0,1 cm3 na płytkę z agarem odżywczym. Na płytkach z badanym szczepem ułożyliśmy krążki bibułowe, które wcześniej zanurzyliśmy w roztworach odpowiednich soli metali ciężkich. Osobną płytkę przeznaczamy na badanie wpływu srebra umieszczając na jej środku nasączony krążek. Płytki pozostawiliśmy do inkubacji na 7 dni.

III. Wyniki analiz

a) Promieniowanie UV

	kontrola	5minut	10minut	15minut
Pałeczki	Duży wzrost, nie można rozróżnić pojedynczych koloni	+ + + + Pojawiają Się pierwsze pojedyncze kolonie ale wzrost jest nadal bardzo obfity	+ + Wzrost obfity	+ Kolonie nieliczne ale bardzo rozrośnięte
Laseczki	Podobnie jak w wypadku pałeczek	+ Duża redukcja liczebności mikroorganizmów Już na tym etapie pojawiają się pojedyncze kolonie, co jest spowodowane specyfiką bakterii z tego rodzaju	+ Duża redukcja liczebności mikroorganizmów	+ Duża redukcja liczebności mikroorganizmów. W miejscu w którym padał cień szkła i mikroorganizmy były osłonięte przed działaniem UV obserwujemy duży wzrost na powierzchni którą pokrywał cień. Jest to potwierdzenie założenia iż szkło nie przepuszcza promieni UV.
Grzyby	Duży płatowaty wzrost	+ + + + Bardzo duży wzrost	+ + + Duży wzrost, lecz widoczna jest niewielka różnica	+ + Mikroflora ulega widocznej redukcji dopiero po 15 minutach naświetlania. Występuje przerzedzenie kolonii

b) wpływ antybiotyków (badamy strefę zahamowania wzrostu)

antybiotyk	Pałeczki	Laseczki
N30	25mm	15mm
C30	15mm	17mm
P10	20mm	16mm
Pb300	12mm	9mm
S10	20mm	16mm

Antybiotyki nie wykazały działania na grzyby

c) wpływ metali:

	Grzyby	Pałeczki	Laseczki
Pb	brak reakcji	brak reakcji	4mm
Cr	23mm	10mm	19mm
Cu	brak reakcji	5mm	2mm
Ag	1mm	+	3mm
Cd	brak reakcji	15mm	12mm

IV. Wnioski:

Na podstawie wyników przeprowadzonych przez nas badań można jednoznacznie stwierdzić iż najbardziej odpornym szczepem są grzyby. Antybiotyki nie miały żadnego wpływu na wzrost kolonii a widoczny był on nawet na samych krążkach. Jest to cechą gatunkową. Także promieniowanie UV nie zmniejsza wzrostu w tak widoczny sposób jak w przypadku bakterii. Widoczne przerzedzenie występowało dopiero na płytce eksponowanej przez 15 min. W przypadku metali widoczny wpływ na rozrost kolonii miała jedynie sól chromu. Jeśli chodzi o bakterie widoczny wpływ promieni UV można zaobserwować na kolonii laseczek, gdyż już krótka ekspozycja spowodowała ograniczenie wzrostu i powstanie pojedynczych kolonii. Tworzenie takich pojedynczych kolonii jest cechą charakterystyczną tego typu bakterii. W przypadku pałeczek wpływ promieniowania wykazuje regularność. Im dłużej płytki były eksponowane, tym wzrost był mniejszy, aż do powstania nielicznych lecz bardzo rozrośniętych kolonii. Potwierdził się fakt, iż szkło jest nieprzepuszczalne dla promieni UV czego skutkiem jest bardzo duży wzrost na próbach kontrolnych w przypadku wszystkich szczepów oraz półksiężycowata kolonia, która zachowała się na płytce z laseczkami w wyniku cienia padającego od jej brzegów. Badając wpływ antybiotyków obie kolonie bakterii wykazują podobną wrażliwość, przy czym najmniejszy wpływ wywiera na nie antybiotyk Pb_300. Natomiast badając wpływ metali największy wpływ na obie kolonie miały sole kadmu i chromu, który łatwiej przenika do komórki ze względu na swoje podobieństwo molekularne do siarczanów i fosforanów. W obydwu przypadkach strefy zahamowania wzrostu są znaczne. Ołów nie wywiera wpływu na kolonie pałeczek, a w przypadku laseczek wpływ ten jest również niewielki. Jest on najmniej mobilny z badanych metali. Srebro wykazuje działanie zarówno grzybo- jak i bakteriobójcze jednak strefy zahamowania są niewielkie. Miedź nie wywołała wyraźnego zahamowania wzrostu bakterii, być może jest to spowodowane faktem iż w małych ilościach jest ważnym mikroelementem a jej stężenie w użytym roztworze zawierało się w granicach tolerancji dla badanych szczepów.

---