Genetyka 5 – terapia genowa

Podstawowym założeniem terapii genowej chorób uwarunkowanych genetycznie jest leczenie przyczyn, a nie objawów, czyli usunięcie lub skorygowanie defektu genetycznego.

1. Mutacje recesywne

   1. Komplementacja defektu genetycznego

2. Mutacje dominujące

   1. Hamowanie ekspresji zmutowanego genu

   2. Korygowanie mutacji

Komplementacja defektu genetycznego

- wprowadzenie do komórki docelowej kopii prawidłowego genu

- mutacje recesywne

- wektory wirusowe (retro wirusy , lentiwirusy)

- metoda In vivo

- metoda ex vivo

Strategia In vivo (dostarczenie genów terapeutycznych wprost do organizmu pac jęta – domięśniowo , do guza, systemowo)

Strategia ex vivo (pobranie komórek pac jęta, namnożenie, modyfikacja genetyczna, wprowadzenie do organizmu pacjenta

Niedogodności komplementacji defektu genetycznego:

- ograniczona wielkość transgenu

- wydajność transferu genów do komórek docelowych

- losowa integracja transgenu do genomu gospodarza

- czas utrzymania się transgenu w komórce

Hamowanie ekspresji zmutowanego genu:

- tzw. antysensy

- 20 -30 nukleotydowe cząsteczki DNA , RNA

- komplementarne do mRNA, sekwencji DNA genu, jego promotora

Naprawa mutacji

- jest trwała

- nieznany mechanizm molekularny

a) naprawa błędnie sparowanych zasad

b) naprawa przez wycinanie nukleotydów

c) rekombinacja homologiczna

- homologiczne podstawienie małych fragmentów (DNA długości 400-800 nukleotydów)

Eliminacja komórek

1. Komórki nowotworowe

2. Komórki zainfekowane wirusami np. wirusem HIV

Strategie zabijania komórek

1. Bezpośrednia – wprowadzenie do komórki nowotworowej genu kodującego toksyczne białko, genu samobójczego lub proapoptotycznego

2. Pośrednia – pobudzenie układu immunologicznego do swoistego zabijania komórek nowotworowych

3. Zahamowanie unaczynienia nowotworu

promotory swoisto tkankowo

Promotor (gen)	Tkanka/komórka docelowa
Albumina	Wątroba
Mięśniowa kinaza Kreatyninowa	Mięśnie
tyrozynaza	Melanocyty
Enolaza specyficzna dla …	Neurony

Promotory nowotworowo-swoiste

promotor	Typ nowotworu
α – feto proteina (AFP)	Rak wątroby
ERB B2	Rak sutka i trzustki
Mucyna – 1 (MUC – 1)	Rak sutka
α – laktoalbumina (ALA)	Rak sutka
Elementy aktywowane hipoksją	Guzy lite
Inhibitor leukoproteinazy	Rak jajnika

Nowe cechy fenotypowe

1. Geny proangiogenne – leczenie chorób wywołanych niedotlenieniem

2. Inhibitory angiogenezy – choroby nowotworowe

3. Geny odporności wielolekowej – terapia cytostatykami

Nośnik trans genów

1. Wirusowe – TRANSDUKCJA

   1. Adenowirusy

   2. Retrowirusy

   3. Lentiwirusy

   4. Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV)

   5. Wirusy opryszczki

2. Niewirusowe – TRANSFEKCJA

Uzyskiwanie zrekombinowanych wirusów

1. Wektor wirusowych – pozbawiony genów replikacji i /lub otoczki białkowej

2. Komórki pakujące

Wektory adenowirusowi

1. Zalety

   1. Wysokie miano

   2. Duża wydajność transdukcji In vivo ex vivo

   3. Transdukcja dzielących się i nie

   4. Wysoki poziom ekspresji trans genu

2. Wady

   1. Silna odpowiedz immunologiczna na białka wirusa

   2. Niemożność wielokrotnego podania

   3. Cytotoksyczność

   4. Krótkotrwała ekspresja transgenu

Wektory retrowirusowe

1. Zalety

   1. Długotrwała ekspresja transgenu (integracja z genomem)

2. Wady

   1. Tylko komórki dzielące się

   2. Możliwość mutacji inercyjnej

   3. Zastosowanie w transdukcji ex vivo

Lentiwirusy

1. Zalety

   1. Transdukcja komórek dzielących się i nie

   2. Długotrwała ekspresja transgenu

2. Wady

   1. Możliwość mutacji insercyjnych

   2. Trudna konstrukcja i kontrola jakości

AAV

1. Zalety

   1. Mała immunogenność

   2. Wydajna transdukcja komórek dzielących się i nie

   3. Długotrwała ekspresja transgenu

2. Wady

   1. Możliwość mutacji insercyjnych

   2. Trudna konstrukcja i kontrola jakości

   3. Możliwe zanieczyszczenie adenowirusami

Wirus opryszczki

1.Zalety

1. Transdukcja komórek nie dzielących się

2. Duże trans geny – 15kpz

3. Neurotripizm

2.Wady

a. Krótkotrwała ekspresja transgenu

b. niskie miano

Techniki niewirusowe

Metody wprowadzania plazmidowego DNA

1. Fizyczne- bezpośrednia iniekcja plazmidowego DNA, elektroporacja, użycie strzelby genowej

2. Endocytoza DNA połączonego z nośnikiem ( związkiem chemicznym)

Nośniki niewirusowe

1. Precypitat z fosforanem wapnia

2. Lipidy i liposomy kationowe

3. Kationowe polipeptydy

4. Polimery i kopolimery kationowe

5. Dendrymery- wysoko cząsteczkowe rozgałęzione struktury

Etapy transfekcji

1. Osadzenie plazmidowego DNA na nośniku

2. Podanie do komórki na drodze endocytozy

3. Endosomoliza- uwolnienie z pęcherzyka endocytarnego

4. Ewentualna dysocjacja kompleksu

5. Wniknięcie do jądra komórkowego

Mukowiscydoza

1. Choroba autosomalna recesywna

2. Mutacja genu CFTR (Cystis Fibrosis Transmembrane Regulator)- błonowy kanał chlorkowy

3. Locus 7q31.2

4. Najczęstsze objawy dotyczą:

- układy oddechowego

- układu pokarmowego

- niepłodności

Terapia genowa mukowiscytozy

1. Wektor

- adenowirusy, wirusy AAV

- lentiwirusy

2. Transgen

- gen CTFR

3. Sposób podania

- aerozol

Problemy terapii genowej mukowiscydozy

- utrudnione dostarczenie wektora do komórek docelowych

- konieczność regularnego powtarzania terapii

Nadzieje:

- ekspresji genu CFTR na poziomie 10% wartości prawidłowej

Hipercholesterolemia rodzinna

1. Choroba autosomalna dominująca

2. Mutacje genu LDLR- białko receptora dla LDL

3. Locus 19p13.1-13.3

4. Objawy:

- zwiększony poziom cholesterolu

- zmiany miażdżycowe

- żółtaki

Terapia genowa hipercholesterolemii rodzinnej

1. Wektor

- retrowirus

2. Transgen

- gen LDLR

3. Sposób podania

- do żylnie

Choroba Huntingtona

1. Choroba autosomalna dominująca

2. Mutacje genu HD-białko Huntingtona

3. Locus 4p16.3

4. Objawy:

- zaniku komórek nerwowych w jądrach podkorowych i korze mózgowej

- pląsawicze ruchy mimo wolne

- zaburzenia pamięci

- zmiany osobowości

Terpia genowa choroby Huntingtona

1. Wektor

- polimerowa kapsuła utworzona z pół przepuszczalnej błony

2. Transgen

- gen rzęskowego czynnika neurotroficznego (Ciliary Neuro Trophic Factor- CNTF)

3. Sposób podania

- wstrzyknięcie śród operacyjne do prawej… komory mózgu

Choroba niedokrwienna mięśnia sercowego i kończyn

1. Wektor

- adenowirusy, plazmidy

2. Transgen

- naczyniowe czynniki wzrostu wśród błonka (Vascular Endotelial Growth Factor- VEGF)

- czynnik wzrostu fibroblastów 4 ( Fibroblast Growth Factor 4- FGF-4)

-sposób podania- wstrzyknięcie wektora w obszar nie dokrwienia

Zachamowanie procesu restenozy

1. Wektor

- antysensowne oligonukleotydy, rybozyny

2. Cel

- gen jądrowego czynnika komórek proliferujących (proliferatin cell nuclear antigen- PCNA)

- gen kinazy cyklinozależnej CDK1

3. Sposób podania

- wprowadzenie wektora w obszar przeprowadzonej angioplastyki

Choroba zarostowa naczyń obwodowych

1. Przeszczep żyły odpiszczelowej przepłukanej pod ciśnieniem roztworem oligonukleotydów blokujących czynnik transkrypcyjny E2F

2. Zwiększenie drożności naczyń krwionośnych, redukcji stenozy do 40%

Choroba Alzheimera

1. Najczęściej diagnozowana choroba neurodegeneracyjna u ludzi

2. Blaszki amyloidowe i wewnątrz komórkowe sploty neurofibrylarne- zanik tkanki nerwowej, głównie w okolicach skroniowo-potylicznych oraz czołowych.

3. Utrata pamięci, uczenia się zmiany sytuacji i myślenia abstrakcyjnego

Terapia genowa w chorobie Alzheimera

1. Wektor

- retrowirus

2. Transgen

- gen czynnika wzrostu nerwów (Nerve Growth Factor- NGF)

3. Sposób podania

- implantacja zmodyfikowanych komórek (fibroblastów) do jądra podstawnego

Terapia genowa w chorobie Alzheimera

1. Wektor

- retrowirus

2. Transgen

- gen czynnika wzrostu nerwów (Nerve Growth Factor- NGF)

3. Sposób podania

- bezpośrednia iniekcja

Terapia genowa w AIDS

1. Modyfikacja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych

2. Wektor

- retro wirus, lentiwirus

3. uniewrażliwienie zróżnicowanych komórek potomnych na infekcje wirusową

4. modyfikacja ex vivo limfocyty T CD4 i CD8

5. Obniżenie ekspresji genów

- białek receptorowych na powierzchni Komorek gospodarza np. CD4, CXCR4, CCR5

- białek kofaktorowych

- czynników transkrypcyjnych

6. zwiększenie ekspresji genów

- naturalnych czynników przeciwwirusowych, interferonu

Terapia genowa chorób nowotworowych

1. Terapia genowa nowotworów

1. Zmiana złośliwego fenotypu

2. Chemio protekcja komórek prawidłowych

3. Eliminacja komórek nowotworowych

Zmiana złośliwego fenotypu

gen	strategia	wektor	Typ guza
p53	Komplementacja	Adenowirus	Rak niedrobnokomórkowy płuca, rak sutka, rak prostaty, przerzuty do wątroby raka jelita grubego
RB	Komplementacja	Adenowirus	Rak pęcherza
BYRCA-1	Komplementacja	Retrowirus	Rak jajnika
K-Ras	Antysens	Retrowirus	Rak niedrobnokomórkowy płuca
c-myc c-fos	Antysens	Retrowirus	Rak sutka, rak prostaty
IGF-1	Antysens	Kationowe liposomy	glejaki

Chemioprotekcja komórek prawidłowych

1. Geny oporności wielolekowej (multi drug resistant-MDR)

Transportery błonowe zależne od ATP

Obniżenie poziomu cytostatyków w komórce

Eliminacja komórek nowotworowych

1. Geny samobójcze

2. Geny proapoptotyczne

3. Wirusy onkolityczne

4. Immunoterapia

5. Hamowanie angiogenezy

Geny samobójcze (sutcidal genes)

1. Kodują białka przekształcające podany do krwiobiegu nietoksyczny substrat (prolek) do toksycznych metabolitów

2. Efekt sąsiedztwa (bystander effect)

Geny samobójcze

1. Gen kinazytymidynowej Herpes Simplex (HSVtk) Varicella zoster (VZVtk)- wrażliwość na acyklowir, glancyklowir, walacyklowir

2. Gen deaminazy cytozynowej

- wrażliwość na 5-fluorocytozynę----- 5fluoruuracyl

3. gen cytochromu P4502B (CYP2B)

- cyklofosfamid- 4-chydroksycyklofosfamid

Przykłady terapii z zastosowaniej genów samobójczych

1. 1991- rak jajnika (III stopień zaawansowanych nowotworu)

-gen HSVtk

- stratego ex vivo

2. 1993- glejaki

- gen HSVtk

- iniekcja modyfikowanych fibroblastów

Geny proapoptotyczne

Nie powodzenia radioterapii i chemioterapii

1. Mutacje genów supresorowych np. p53, BRCA1, Rb, PTEN

2. Mutacje genów kodujących kaspazy

3. Mutacje genów proapoptotycznych np. bax, bak

4. Częsta nadekspresja genów antyapoptotycznych np. białka BCL-2, surwiwin

Wirusy onkolityczne- (tabelka)

Immunoterapia

Stymulowanie układu odpornościowego do rozpoznawania i niszczenia komórek nowotworowych

1. Modyfikowanie komórek nowotworowych genami kodującymi

1. Cytokiny np. TNF α, INF α

2. Cząsteczki kostymulujace np. CD40

Szczepionki genetyczne

1. Ich zadaniem jest wywołanie odpowiedzi immunologicznej na anty geny nowotworowe

2. Nie SA to szczepionki profilaktyczne

3. Skuteczne we wczesnym stadium choroby nowotworowej

Szczepionki komórkowe

1. Komórki TIL (tumor infiltrating lymphocytes)- limfocyty naciekające guz

- bezpośredni efekt cytotoksyczny.

- wprowadzenie genów dla TNF α, IL-2

2. komórki z wprowadzonym genem cząsteczek ko stymulujących np. B7 (CD80, CD86)

3. Komórki prezentujące antygen MHC, komórki dendrytyczne preinkubowane z antygenami nowotworowymi.

Cele terapeutyczne

1. Choroby nowotworowe 64,5% (n=1019)

2. Choroby infekcyjne 8% (n=127)

3. Choroby neurologiczne 1,9% (n=30)

4. Inne 2,2% (n=35)

5. Zdrowi wolontariusze 2,7% (n=37)

6. Choroby sercowo-naczyniowe 8,7% (n=127)

7. Choroby monogenowe 7.9% (n=126)

8. Choroby oczu 1,1% (n=18)

9. Oznaczanie genu 2,7%

Wektory stosowane w terapii genowej

1. Adenowirusy 23,9% (n=387)

2. Nagie plazmidowe DNA 17,7% (n=297)

3. … 6,7% (n=100)

4. AAV 4,4% (n=71)

5. Transfer RNA 1,4% (n=23)

6. … 3,2% (n=51)

7. Retrowirusy 20,8%

8. Wirus krowianki

9. Wirus ospy 5.7%

10. Wirus HS

11. Inne 4,..%