Wojciech Kluźniak Szczecin, dnia 18-01-10

Grupa 2b/ rok IV/ Biotechnologia

Ćwiczenie laboratoryjne nr 3

Konspekt

Temat: Amplifikacja DNA badanych materiałów roślinnych przy zastosowaniu techniki ISSR-PCR.

Cel ćwiczeń: Identyfikacja zmian w obrębie sekwencji mikrosatelitarnych metodą PCR-ISSR.

Istota zastosowanej metody badawczej: ISSR-PCR jest to prosta i szybka metoda, która łączy większość zalet SSR , ALFP i powszechnie stosowanego RAPD. Markery ISSR są wysoce polimorficzne i użyteczne w badaniach nad różnorodnością genetyczną, znakowaniem i mapowaniem genów. ISSR jest techniką, która polega na amplifikacji fragmentów DNA położonych pomiędzy dwoma mikrosatelitarnymi, powtórzonymi regionami, zorientowanymi w przeciwległych kierunkach. Technika ta wykorzystuje mikrosatelity, głównie o długości 16-25 bp, jako primery. Primery te mogą być di-, tri-, tetra-, albo pentanukleotydami. ISSR ma dużą zdolność powielania, być może z powodu używania dłuższych primerów (16-25 zasad) w porównaniu z RAPD wykorzystującym primery 10cio zasadowe, co pozwala w późniejszym etapie na użycie wyższych temperatur annilingu (45-60 ºC).

Amplifikacje PCR badanych materiałów przeprowadzono w oparciu o niżej zamieszczony protokół - skład mieszaniny reakcyjnej.

W badaniach wykorzystaliśmy 2 startery. Reakcje każdorazowo prowadziliśmy w mieszaninie reakcyjnej o objętości 25 μl, która zawierała:

starter ISSR	2,5 μl
bufor do PCR	2,5 μl
MgCl2	2 μl
dNTPmix	2,5 μl
Taq polimerazy	0,7μl
matrycowego DNA	1,5 μl
H2O	13,3μl

Każda z 6 matryc została poddana amplifikacji z każdym z 2 różnych starterów.

Elektroforeza produktów PCR i krótkie omówienie wyników analiz:

2% żel agarozowy, 1X TBE, czas trwania elektroforezy - 1:45 h

Na załączonych elektroforegramach obecne są produkty monomorficzne oraz polimorficzne.

Podsumowanie/Wnioski

Dzięki tej metodzie możemy wykryć markery molekularne w sekwencjach mikrosatelitarnych, markery ISSR cechują się wysokim polimorfizmem i są użyteczne w badanich nad różnorodnością genetyczną i mapowaniem genów.

---