Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Laboratorium biologii molekularnej

Sprawozdanie 3

z ćwiczeń laboratoryjnych z przedmiotu

Biologia molekularna

Reakcja Real-time PCR z wysokorozdzielczą krzywą topnienia na mikrosatelitę D163096

oraz elektroforeza DNA w żelu poliakrylamidowym.

Imię i nazwisko	Paulina Kopczyńska
Numer indeksu	091121

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest określenie homo/heterozygotyczności w mikrosatelicie chromosomu 16 (D16S3096) w określonych liniach komórkowych przy użyciu metody Real-time PCR z wysokorozdzielczym meltingiem oraz porównanie wyników elektroforezy produktów Real-time PCR z rozdziałem elektroforetycznym.

Przebieg ćwiczenia

Reakcja Real-time PCR z wysokorozdzielczą krzywą topnienia na mikrosatelitę D16S3096.

1. Przygotowaliśmy mastermiks na 9 próbek (każde DNA z linii komórkowej w dwóch powtórzeniach, próbka negatywna z wodą, próbka kontrola PCR–łożyskowe DNA).

	1x	(liczba prób [8] +1) x
H2O	15,25 μl	137,25 μl
Bufor 10x	2,5 μl	22,5 μl
MgCl2 25 mM	2,0 μl	18 μl
Eva Green 20x	1,25 μl	11,25 μl
dNTPs 10 mM	0,5 μl	4,5 μl
Primer For 10 nM	0,5 μl	4,5 μl
Primer Rev 10 nM	0,5 μl	4,5 μl
Polimeraza 5 U/μl	0,5 μl	4,5 μl
SUMA:	23 μl MIX 2 μl DNA	207 μl 18 μl

Obliczenia:

H2O:

1X: 23-(2,5+2+1,25+0,5+0,5+0,5+0,5)=15,25

9X: 15,25*9=137,25

Bufor:

9*2,5= 22,5

MgCl2:

9*2= 18

Eva Green:

9*1,25=11,25

dNTPs:

9*0,5= 4,5

Primer For:

9*0,5= 4,5

Primer Rev:

9*0,5=4,5

Polimeraza:

9*0,5= 4,5

2. Każdy z mastermixów rozdzieliliśmy następnie na 9 próbek (łącznie dla dwóch mixów na 18

próbek) po 23μl. Następnie do 2 probówek dodaliśmy po 2μl wody, a do reszty- po 2μl DNA z

badanych linii komórkowych (MDA, T98G, HT29, SW480)

	MIX NR 1	MIX NR 2
1	MDA	MDA
2	T98G	T98G
3	HT29	HT29
4	HT29	HT29
5	SW480	SW480
6	T98G	T98G
7	SW480	SW480
8	H20	H20

3. Nastawiliśmy reakcje Real-time PCR i zaprogramowaliśmy następujące warunki amplifikacji:

-95°C-10min

-94°C-30s 50

-56°C-30s cykli

-72°C-60s * odczyt

-wysokorozdzielczy melting:wzrost temperatury od 50°C do 95°C, ciągły pomiar fluorescencji, 40 odczytów na 1°C. WYNIKI Wyniki reakcji Real-time PCR zostały zanalizowane podczas ćwiczeń, z tego powodu nie posiadamy wykresów krzywych topnienia. Przykładowe wykresy krzywych topnienia wyglądają następująco: Utrata heterozygotyczności (LOH) Heterozygota (brak LOH) Z analizy naszych krzywych wynika, że: MDA to heterozygota, nie występuje LoH. T98- występuje LoH, czyli utrata heterozygotyczności, to homozygota, HT29- występuje LoH, czyli utrata heterozygotyczności, to homozygota, SW480-to heterozygota, nie występuje LoH. Przeprowadzenie elektroforezy produktów reakcji Real-time PCR z wysokorozdzielczą krzywą topnienia na mikrosatelitę D16S3096 produktów reakcji Real-time PCR. Celem ćwiczenia jest porównanie wyników elektroforezy produktów Real-time PCR z rozdziałem elektroforetycznych. Przebieg ćwiczenia 1. Przygotowaliśmy żel poliakrylamidowy wg przepisu (2,5ml poliakrylamidu 40%+ 0,2 ml buforu TAE(50x) + uzupełnienie wodą do 10 ml). Nastepnie dodaliśmy szczyptę nadsiarczanu amonu i 5µl TEMEDu, szybko wymieszaliśmy, wylaliśmy między szyby i włożyliśmy grzebień formujący studzienki. 2. Poczekaliśmy, aż żel spolimeryzuje, włożyliśmy szyby do aparatu do elektroforezy, zalaliśmy buforem 1xTAE i wyjęliśmy grzebień. 3. Do prób dodaliśmy po 1 μl buforu obciążającego i nanieśliśmy po 10 μl próby na dołek. 4. Przeprowadziliśmy elektroforezę przy napięciu 100 V. 5. Wyjęliśmy żel z aparatu, wybarwiliśmy bromkiem etydyny i obejrzeliśmy pod lampą UV. ANALIZA ŻELU: Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym nie potwierdziła wyników PCR, ponieważ na zdjęciu żelu nie zostały uwidocznione prążki. Powodem nieudanej elektroforezy mogły być: Za krótki czas polimeryzacji, Powstałe niespecyficzne produkty, Brak produktów właściwych o długości 242 pz. Stężenie produktów powstałych w PCR jest zbyt niskie, żeby wyniki były widoczne po przeprowadzeniu elektroforezy. WNIOSKI Na podstawie wykresów krzywej topnienia reakcji Real-time PCR określono homo i heterozygotyczność w mikrosatelicie chromosomu 16 dla linii komórkowych badanych w każdej z grup. Wyniki te nie zostały jednak potwierdzone w elektroforezie na żelu poliakrylamidowym ze względu na brak wiarygodnych wyników uzyskanych w tym badaniu. Zgodnie z wynikami reakcji Real-time PCR linia komórkowa raka jelita grubego SW480, z której na pierwszych zajęciach wyizolowałam DNA, jest heterozygotą w mikrosatelicie chromosomu 16. Wynik ten jednak nie jest wiarygodny ze względu na zanieczyszczenie mastermixu.