Laboratorium Biotechnologii

Uwalnianie produktów wewnątrzkomórkowych

Biotechnologia gr.1

Poniedziałek 8:15-12:00

Ewa Świegocka

Lilianna Ożga

Martyna Kozłowska

1. Wstęp teoretyczny

Ze względu na problemy z wydzielaniem lipaz wewnątrzkomórkowych poza komórkę, nie są one dokładnie zbadane. Aby wydzielić je poza komórkę stosuje się liczne metody:

• Mechaniczne (bezpośrednie rozrywanie komórek)

- rozcieranie biomasy

- homogenizacja biomasy

• Chemiczne (czynnik chemiczny nie może działać negatywnie na nasz produkt)

- ekstrakcja detergentami

- rozpuszczalniki organiczne (np. aceton)

- antybiotyki ( w celu zahamowania syntezy ściany komórkowej)

• Fizyczne - zamrażanie i rozmrażanie

- szok osmotyczny

- sonifikacja

- ultradźwięki

• Enzymatyczne - lizozymy

- peptydoglikany

- drożdże

- glukanaza

W praktyce najczęściej stosowanymi metodami uwalniania składników wewnątrzkomórkowych są:

• ultradźwięki ( dobrze rozrywają bakterie „gram-”, ścinanie pod wpływem drgań)

  • mielenie w specjalnych młynkach ( z dodatkiem materiałów ściernych)

  • działanie wysokich ciśnień w stanie zamrożenia, stosuje się tzw. X-prasy ( przetłaczanie zamrożonej „pasty” przez małe otwory pod ciśnieniem 1000-6000 atm i gwałtowna dekompresja, co powoduje pękanie ścian komórkowych)

  • enzymatyczna liza ściany komórkowej, jest to dosyć kosztowna metoda ( najstarszym sposobem jest stosowanie enzymów litycznych ze ślimaka winniczka Helix pomatia lub lizozymu z białka kurzego)

Lipazy są enzymami z klasy hydrolaz, które rozkładają wiązania estrowe w tłuszczach. Końcowym produktem ich aktywności są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol, a produktami pośrednimi - diglicerydy i monoglicerydy. W organizmie człowieka występują: lipaza żołądkowa i trzustkowa. Lipazy występują również u roślin i drobnoustrojów.

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest porównanie skuteczności metod dezintegracji komórek w procesie wydzielania wewnątrzkomórkowej lipazy.

1. Materiały i metody.

1. Materiał biologiczny.

Szczep grzybów nitkowatych Mucor circinelloides kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej hodowano na wstrząsarce w czasie 72 godzin w temp. 30^oC na podłożu zawierającym namok kukurydziany i olej oliwkowy. Do kolby o pojemności 1000 cm³ wprowadzono 300 cm³ podłoża hodowlanego i szczepiono kulturą mateczną za pomocą ezy. Nagromadzoną w wyniku hodowli biomasę sączono na przegrodzie celulozowej i przemywano wodą destylowaną.

2. Wykonanie ćwiczenia

2.1 Wydzielanie lipazy Mucor circinelloides z komórki:

2.1.1 Metoda I

Odważyć 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczynia i zalać 5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Inkubować w temperaturze 37^oC w czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.2 Metoda II

Odważyć 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczynia i zalać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,5 cm3 roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.3 Metoda III

Odważyć 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do moździerza, dosypać bezołowiowych kulek szklanych i zalać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Rozcierać w czasie 10 minut. Całość przenieść do naczynia szklanego, dodać 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.4 Metoda IV

Odważyć 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczynia i zalać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Homogenizować w czasie 2 minut zanurzając naczynie homogenizera w łaźni lodowej. Całość przenieść do naczynia szklanego, dodać 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.5 Metoda V

Odważyć 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczyńka wykonanego z folii aluminiowej, dodać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0 i dwukrotnie zamrozić do temperatury -20^oC i rozmrozić. Całość przenieść do naczynia szklanego, dodać 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.6 Metoda VI

Odważyć 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczynia szklanego i zalać 5 cm³ acetonu. Mieszać w czasie 5 minut i odsączyć dobrze odciskając na przegrodzie ceramicznej. Operację przemywania acetonem powtórzyć 3 razy. Odwodnioną grzybnię rozłożyć pod wyciągiem na bibule i suszyć w czasie 15 minut. Całość przenieść do naczynie szklanego, dodać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.2 Oznaczenie aktywności esterazowej lipazy

Substratem do oznaczenia aktywności jest octan p-nitrofenolu, który pod działaniem esteraz i lipaz ulega hydrolizie z wydzieleniem p-nitrofenolu. Maksimum pochłaniania światła dla tego związku występuje przy długości fali 399nm. Sam octan p-nitrofenolu nie wykazuje pochłaniania przy tej długości światła. Bezpośrednio przed użyciem substrat o stężeniu 50 μmoli/cm³ w acetonitrylu rozcieńczyć bezpośrednio przed użyciem pięciokrotnie wodą destylowaną.

2.2.1 Wykonanie oznaczenia

Do probówki wprowadzamy: 0,1 cm3 rozcieńczonego roztworu p-nitrofenoly, 0,8 cm3 buforu fosforanowego 0,05 M o pH 7,0 i 0,1 cm3 ekstraktu lipazy. Inkubujemy w temperaturze pokojowej w czasie 15 minut. Szybkość uwalniania p-nitrofenolu mierzymy za pomocą fotokolorymetru przy długości fali 399 nm. Stężenie uwolnionego p-nitrofenolu odczytać z krzywej kalibracyjnej.

III. Opracowanie wyników

Grupa Metoda	I	II	III	IV	V	VI	Wartości średnie A399
I bufor	0,019	0,059	0,235	0,12	0,1	0,09	0,104
II cholan	0,206	0,123	0,624	0,154	0,046	0,24	0,232
III rozcieranie	0,338	1,867	0,807	0,208	0,575	1	0,482
IV homogenizer	1,929	1,400	1,952	1,595	1,482	1	1,560
V wymrażanie	0,003	0,058	0,186	0,031	0,148	0,525	0,286
VI aceton	0,113	0,117	0,440	0,514	0,280	1,03	1,03

Stężenie p- nitrofenolu obliczam ze wzoru:

0,0757 – współczynnik kierunkowy odczytany z krzywej wzorcowej

A₃₉₉ – absorbancja próby z danej metody

Przykład obliczeniowy:

c[p- nitrofenol] = A₃₉₉ / 0,0757

c[p- nitrofenol]_metoda1= 0,104/0,0757 = 1,373 [µmol/ml]

Aktywność lipazy obliczam ze wzoru:

V_p – objętość próby [1 ml]

V_e – objętość enzymu [0,1 ml]

τ – czas reakcji [15 min]

Przykład obliczeniowy:

Aktywność dla metody II = 0,232*1/0,1*15 = 0,155 [µmol/ml*min] = 0,155*10^-6 [mol/ml*min]

Zestawienie wyników aktywności lipazy dla wszystkich VI metod:

Metoda	I	II	III	IV	V	VI
Aktywność lipazy [µmol/min*ml]	0,069	0,155	0,321	1,04	0,191	0,687

1. Wnioski