Wykonał:

Mateusz Jankowski

Towaroznawstwo, Rok III. Gr. I

Nowoczesne metody analizy żywności

Temat: OCENA AKTYWNOŚCI ANTYOKSYDACYJNEJ PRZY UŻYCIU TESTÓW KOLORYMETRYCZNYCH LUB FLUORYMETRYCZNYCH.

Rozdział 1
Przeciwutleniacze (pojęcia)

Przeciwutleniacze (antyoksydanty, antyutleniacze) – grupa związków chemicznych, które same występując w małych stężeniach (w porównaniu z substancją podlegającą utlenianiu), wstrzymują lub opóźniają proces utleniania tej substancji^, usuwają z organizmu człowieka nadmiar wolnych rodników, każdy przeciwutleniacz może występować w roli prooksydanta.

Antyoksydanty występują często w suplementach diety i są powszechnie uważane za środek prewencyjny w zapobieganiu licznym chorobom takim jak nowotwory, chorobie niedokrwiennej serca a nawet chorobie wysokościowej, spowalniają procesy starzenia organizmu oraz zapobiegają rozwojowi chorób określanych jako cywilizacyjne.

Przeciwutleniacze stosowane są w zapobieganiu niepożądanym procesom utleniania, przez co przedłużają czas trwałości żywności.

Dozwolone przeciwutleniacze stosowane w przemyśle spożywczym:

• E270 – kwas mlekowy (regulator kwasowości)

• E330 – kwas cytrynowy (regulator kwasowości i stabilizator)

• E300 – kwas askorbinowy (witamina C; substancja klarująca, regulator kwasowości i stabilizator)

• E301 – askorbinian sodu (regulator kwasowości i stabilizator)

• E302 – askorbinian wapnia (pełni funkcję regulator( kwasowości i stabilizator)

• E335 – wodorowinian sodu i winian sodu

• E337 – winian sodowo-potasowy

W głównej mierze przeciwutleniacze to naturalne substancje roślinne, które wspierają naturalne mechanizmy obronne komórek człowieka, ale przeciwutleniaczami mogą być także jony metali przejściowych (manganu, cynku, selenu). Do antyoksydantów zaliczmy witaminę A, E i C, karotenoidy (na przykład beta-karoten, zeaksantyna), bioflawonoidy, niektóre składniki mineralne, na przykład cynk i selen, a także związki, takie jak koenzym Q.

Przeciwutleniacze w żywności występują m.in. w:

• pomidorach- wit. A, C, likopen

• jagodach- wit. C, antocjany, kwercetyna

• morelach- wit. A, C, luteina

• śliwkach- beta-karoten, wit. C, kw. chlorogenowy

• papryce- wit. A, C, E

• szpinaku- beta-karoten, luteina, zeaksantyna

Rozdział 2
Metody i ich omówienie

Jak dotąd nie ma jednej, pełnej klasyfikacji stosowanych technik pomiarowych. Większość badań opiera się na ocenie aktywności czy tzw. pojemności antyoksydacyjnej, będącej sumą właściwości poszczególnych związków zawartych w badanym materiale. Inne metody oceniają przeciwutleniacze ilościowo i jakościowo, nie uwzględniając ich aktywności.

Wszystkie metody służące do oceny przeciwutleniaczy, zarówno ich ilości, jak i aktywności, można podzielić na:

• chromatograficzne:

• na płaszczyznach - chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa (TLC),

• na kolumnach - chromatografia cieczowa (HPLC) i gazowa (GC),

• spektrofotometryczne,

• kolorymetryczne,

• elektrochemiczne:

• woltamperometria cykliczna (CV),

• spektroelektrochemia,

• elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR).

Metodami kolorymetrycznymi można oceniać zawartość lub aktywność flawonoidów w ekstraktach po wstępnym oczyszczeniu. Do tej grupy należą m.in. metody:

• Christa-Műllera, w której zawartość flawonoidów oznacza się poprzez pomiar natężenia zabarwienia powstałego w wyniku reakcji flawonoidu z trójchlorkiem antymonu, tlenochlorkiem cyrkonu, octanem uranylowym, azotanem berylu, kwasem borowym lub chlorkiem glinowym,

• Folina-Ciocalteu'a, gdzie flawonoidy tworzą barwny kompleks z odczynnikiem Folina-Ciocalteu'a (mieszanina wolframianu sodowego, molibdenianu sodowego i siarczanu litu w środowisku kwasu fosforowego i solnego) dając zielono-niebieską barwę; po utlenieniu kompleks oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali od 750 nm do 784 nm. Molibdenian Mo(VI) przyjmuje elektron, a następnie jest redukowany do Mo(V). Reakcja między odczynnikiem Folina-Ciocalteu’a a związkami fenolowymi jest możliwa tylko w środowisku alkalicznym. Na podstawie krzywej kalibracyjnej przedstawiającej zależność absorbancji etanolowego roztworu kwasu galusowego od jego stężenia w roztworze oznacza się ogólną zawartość związków fenolowych w żywności.

• opierające się na reakcjach wygaszania syntetycznych wolnych rodników (ABTS, DPPH, DMPD); barwny aktywny rodnik ulega redukcji przez antyoksydanty obecne w badanej próbce, do bezbarwnych związków, co ilościowo mierzy się spektrofotometrem przy długości fali 734, 515 i 505 nm odpowiednio dla w/w rodników,

• FRAP, polegająca na pomiarze zdolności do redukcji jonu żelazowego 2,4,6-tripirydylo-s-triazyny (TPTZ); związek żelaza (III) w reakcji z antyoksydantem daje barwny produktu, który oznacza się przy długości fali 593 nm,

• TRAP, w której przeciwutleniacz redukuje rodnik ABAP,

• CUPRAC, w której jony miedzi (II) ulegają pod wpływem antyoksydantów redukcji do jonów miedzi (I); analizę spektrofotometryczną wykonuje się przy długości fali 450 nm,

• ORAC, oceniająca zdolność antyutleniacza do opóźniania fluorescencji
  R-fikoerytryny, indukowanej przez AAPH, długość fali wzbudzającej to 540 nm, a emisji 570 nm.

Do technik oceniających zawartość związków przeciwutleniających należy zaliczyć również wszystkie oznaczenia poszczególnych antyoksydantów, a więc metody analizy witaminy C, tokoferoli, antocyjanin itd.

Wyżej wymienione metody służą do analizy ilościowej lub jakościowej przeciwutleniaczy oraz oceny ich aktywności.

• Skróty:

• ORAC - Oxygen radical absorption capacity TRAP - Total reactive antioxidant potential

• FRAP - Ferric reducing ability of plasma albo Ferric reducing antioxidant power

• CUPRAC - Cupric reducing antioxidant capacity

• TEAC - Trolox equivalent antioxidant capacity

• VCEAC - Vitamin C equivalent antioxidant capacity

• AAPH - 2,2'-azo-bis-2-amidinopropane dihydrochloride

• ABAP - 2,2'-azo-bis-2-amidinopropane

• ABTS+ - 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)

• DMPD – N,N-dimethyl-p-phenylenediamine

• DPPH - 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl

Rozdział 3
Przykład zastosowania metod

Zaczerpnięte z magazynu Bromatologia i Chemia Toksykologiczna (BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XLIV, 2011, 3, str. 355-360 ) z artykułu pt. „WŁAŚCIWOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCE NAPOJÓW ENERGETYZUJĄCYCH”, autorstwa Anny Witkowskiej, Małgorzaty E. Zujko, Iwony Mirończuk-Chodakowskiej

W pracy tej oznaczono potencjał antyoksydacyjny napojów energetyzujących. Stwierdzono, że napoje energetyzujące charakteryzują się niższą aktywnością antyoksydacyjną niż napoje produkowane z surowców naturalnych, takie jak soki i wina owocowe, kawa, herbata, napary ziołowe. Uzyskane wyniki wskazują na mało istotne znaczenie napojów energetyzujących jako źródeł pokarmowych substancji przeciwutleniających.

Napoje energetyzujące pochodzące od różnych producentów zakupiono w sieci handlowej na terenie Białegostoku. Do momentu wykonania analizy były one przechowywane w oryginalnych, zamkniętych opakowaniach. Przed wykonaniem oznaczeń napoje były odgazowywane przez 0,5 godz. przy pomocy płuczki ultradźwiękowej Bransonic 1510, Branson. (przygotowanie próbki)

Całkowite stężenie polifenoli oznaczono kolorymetrycznie metodą Singletona i Rossiego przy użyciu odczynnika fosforowo-molibdenowego. Absorbancję barwnych roztworów odczytano na spektrofotometrze Spekol 10, Niemcy, przy długości fali 765 nm. Stężenie podano w przeliczeniu na ekwiwalenty kwasu galusowego.

Aktywność antyoksydacyjną FRAP (Ferric reducing antioxidant potential) oznaczono wg Benzie i Strain przy użyciu reagenta Fe3+ (TPTZ). Absorbancję roztworów badanych i ślepych odczytywano po 4 minutach na spektrofotometrze Spekol 10 przy długości fali 593 nm.

Metoda ta (Benzie i Strain), polega na ocenie zdolności redukcji kompleksu żelaza Fe3+-TPTZ (kompleks żelazowo-2,4,6-tripirydylo-s-traizyny) do kompleksu Fe2+-TPTZ przez badaną substancję o właściwościach przeciwutleniających. Redukcji tej towarzyszy zmiana absorbancji mieszaniny reakcyjnej. Spadek absorbancji kompleksu Fe3+-TPTZ mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali 593 nm.

Wyniki i ich omówienie

Na podstawie analizy składu deklarowanego przez producentów stwierdzono, że we wszystkich badanych napojach energetyzujących występowała woda, sacharoza, regulatory kwasowości (kwas cytrynowy lub/i cytrynian sodu), dwutlenek węgla, aromaty oraz kofeina w ilości ok. 0,03%. Większość napojów zawierała barwniki takie jak karmel i jego pochodne, a także ryboflawinę. W składzie zdecydowanej większości występowały substancje wzbogacające w postaci witamin z grupy B: niacyna, kwas pantotenowy, witamina B6 i witamina B12. W ośmiu napojach występowała tauryna, w siedmiu – ekstrakt guarany, w pięciu - inozytol, w czterech – glukuronolakton. Niektóre napoje (od pięciu producentów) konserwowane były chemicznie sorbinianem potasu i/lub benzoesanem sodu.

Rozdział 4

Wady i zalety

• Zaletami metod kolorymetrycznych jest:

• duża szybkość wykonywania oznaczeń

• możliwość oznaczania bardzo małych ilości substancji

• stosunkowo dużą dokładność

• nie wymagają żadnych dodatkowych odczynników

• Wady tych metod:

• pomimo tego, że większość z nich jest prosta, interpretacja wyników bywa skomplikowana, np. kiedy analizowane próbki mają pokrywające się widma

• dużą wadą też jest mieszanie się substancji, szczególnie cukrów, aromatycznych amin, dwutlenku siarki, kwasu askorbinowego i kwasów organicznych. Dlatego należy wprowadzać korekty

• Nie wszystkimi metodami można oznaczyć te same przeciwutleniacze. Metoda FRAP nie mierzy np. glutationu.

Podsumowanie

Duże zróżnicowanie w budowie i reaktywności rodników oraz mechanizmów ich inaktywacji wymusiło opracowanie wielu metod oznaczania i identyfikacji związków o charakterze przeciwutleniającym. Do najczęściej stosowanych zalicza się techniki spektrofotometryczne, oceniające sumaryczny potencjał antyoksydacyjny substancji. Można tutaj wymienić metody wygaszania rodników ABTS, DPPH oraz CUPRAC i ORAC. Do ilościowego oznaczania polifenoli wykorzystuje się metodę Folina-Ciocalteau, a w celu identyfikacji – techniki chromatograficzne (głownie HPLC).

Źródła:

• Materiały Katedry Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie, praca pt.: Wpływ czynników fizyko-chemicznych oraz warunków przechowywania na właściwości przeciwutleniające wybranych produktów żywnościowych

• Pachołek B., Sielicka M., Zagórska A., WŁAŚCIWOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCE WYBRANYCH HERBATEK BĘDĄCYCH SUPLEMENTAMI DIETY, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2010, 5 (72), 112 – 122

• Witkowska A., Zujko M., Mirończuk-Chodakowska I., WŁAŚCIWOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCE NAPOJÓW ENERGETYZUJĄCYCH, BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XLIV, 2011, 3, str. 355-360