Anna Gołofit 09.01.2013r.
Projekt
Transformacji bakterii i klonowania DNA w komórce Escherichia coli
Wprowadzenie
Klonowanie DNA w organizmach polega na powieleniu materiału genetycznego, a właściwie odcinków DNA, które następnie używane są do dalszych badań. Klonować można zarówno losowo pocięte fragmenty DNA, jak i ściśle określone odcinki. Powielanie fragmentów DNA odbywa się przy wykorzystaniu wektorów, czyli elementów genetycznych, które mają zdolności do namnażania się po wprowadzeniu do komórek biorcy. Takimi wektorami mogą być np. wirusy czy plazmidy. Celem projektu jest uzyskanie DNA w odpowiedniej ilości kopii służących do produkcji insuliny, która następnie będzie wykorzystywana do produkcji leków na cukrzycę.
Przygotowanie insertu DNA
Rozcieńczyć insert DNA do stężenia 200ng/μl.Do probówki Eppendorfa dodać 11μl wody destylowanej, 2μl buforu do trawienia, 5μl przygotowanego DNA oraz po 1μl każdego enzymu restrykcyjnego (SacI i BamHI). Reakcję trawienia prowadzić przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Po zakończeniu trawienia DNA próbki poddać inkubacji przez 10 minut w temperaturze 65°C w celu inaktywacji enzymów restrykcyjnych.
Przygotowanie plazmidu pUC19
Rozcieńczyć insert DNA do stężenia 500ng/μl. Do probówki Eppendorfa dodać 14μl wody destylowanej, 2μl przygotowanego DNA oraz po 1μl enzymów restrykcyjnych (SacI i BamHI). Reakcję trawienia prowadzić prze 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po zakończeniu trawienia DNA próbki poddać inkubacji przez 10 minut w temperaturze 65°C w celu inaktywacji enzymów restrykcyjnych.
Ligacja
Do probówki Eppendorfa zawierającej przecięty enzymami restrykcyjnymi wektor do klonowania DNA dodać mieszaninę z przygotowanym insertem DNA. Dodać 5μl ligazy DNA faga T4. Mieszaninę ligacyjną delikatnie wymieszać przez pipetowanie i inkubować 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji mieszaninę umieścić na lodzie.
Transformacja kompetentnych komórek
Rozmnożyć jedną probówkę kompetentnych komórek DH5α na lodzie. Dodać 5μl mieszaniny ligacyjnej do rozmnożonej probówki kompetentnych komórek. Zawartość probówki delikatnie wymieszać. Powstałą mieszaninę inkubować na lodzie przez 20 minut. Przygotować SOC medium (nośnik) ogrzewając do 42°C. Zastosować szok cieplny powstałej mieszaninie transformacyjnej w temperaturze 42°C przez 45 sekund. Następnie inkubować mieszaninę transformacyjną na lodzie przez 2 minuty i dodać 250μl ogrzanego SOC medium. Po tym etapie przez 1 godzinę regenerować w 37°C w łaźni wodnej z wytrząsaniem. Przygotować szalki Petriego z pożywką LB z dodatkiem ampicyliny. Na szalki nanieść 40μl 2% roztworu X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozydazyd) i rozprowadzić na całej powierzchni płytki za pomocą głaszczki. Następnie do każdej szalki dodać 100μl mieszaniny transformacyjnej. Inkubować przez noc w 37°C. Skład pożywki LB przedstawia tabelka:
| Składnik | Ilość |
|---|---|
| Woda destylowana | 950ml |
| Trypton | 10g |
| Ekstrakt drożdżowy | 5g |
| NaCl | 10g |
| 5N NaOH | Ilość niezbędna do uzyskania przez pożywkę pH 7,0 |
Analiza transformacji
Po inkubacji z wysianych płytek wybrać kolonie koloru białego, zawierają one zrekombinowany plazmid. Kolonie te przeznaczyć do dalszych badań. Kolonie koloru niebieskiego odrzucić. Z wybranych kolonii sporządzić mini preparat DNA używając standardowych protokołów.
Podsumowanie
Do wektora zostanie wprowadzony gen kodujący insulinę niezbędną do leczenia osób cierpiących na cukrzycę, u których występuje częściowe lub całkowite zatrzymanie produkcji insuliny przez organizm. Zadaniem insuliny jest przenoszenie glukozy z krwi do komórek ciała. U osób zdrowych poziom glukozy podnosi się i obniża naturalnie, natomiast osoby chore na cukrzycę potrzebują dostarczania insuliny z zewnątrz, ponieważ w innym przypadku glukoza gromadzi się we krwioobiegu.