SPRAWOZDANIE Z BIOLOGII KOMÓRKI I INŻYNIERII GENETYCZNEJ

Tematy:

1. „Izolacja jąder komórkowych i ekstraktów jądrowych.”

2. „Izolacja białek wiążących DNA metodą chromatografii powinowactwa.”
3. „Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym.”

Wydział: CHEMICZNY

Kierunek: Biotechnologia

Grupa: wtorkowa (tygodnie parzyste)

SERAFIMOWICZ Weronika

1) Opis wykonywanych czynności

1. Otrzymane komórki rozmrożono w lodzie, zawieszono w 500 µl PBS 1x i zmierzono objętość v₀=510μl.

2. Obliczono objętość samych komórek: 510μl - 500μl = 10μl komórek

3. Odpipetowano 10 µl do osobnej probówki, którą podpisano jako „komórki”, pozostałe

500μl odwirowywano 10 minut, 180xg.

4. Ściągnięto i odrzucono supernatant, osad komórek zawieszono w 5-krotnej objętości buforu
do izolacji EC, czyli 10μl x 5 = 50μl, gdzie 50μl to dodana objętość buforu, a 10μl to

objętość komórek.

5. Probówkę inkubowano 10 minut w lodzie kilkukrotnie mieszając.

6. Po inkubacji komórki lekko wytrząsano i odwirowywano 10 minut, 300xg.

7. Zebrano cały supernatant do osobnej probówki, zmierzono jego objętość = 40μl. Probówkę

podpisano: EC (ekstrakt cytoplazmatyczny).

8. Osad zawieszono w trzech objętościach buforu niskosolnego, czyli w 10μl x 3 = 30μl

9. Zmierzono objętość = 32μl, odpipetowano 10 µl zawiesiny do osobnej probówki, którą podpisano „jądra”.

10. Do pozostałego osadu z buforem niskosolnym dodano równą objętość buforu

wysokosolnego „high 0.8”, czyli 32μl - 10μl = 22μl, gdzie 22μl to ilość dodanego buforu

11. Mieszaninę osadu z buforami wytrząsano 30 minut w , a następnie odwirowywano na

maksymalnych obrotach przez 30 minut.

12. W czasie inkubacji odpipetowane wcześniej komórki i jądra obejrzano pod mikroskopem.

Preparaty mikroskopowe przygotowano w następujący sposób: do 10μl „komórek” oraz

10μl „jąder” dodano po 10μl fioletu krystalicznego, następnie zawartość probówek

wymieszano i nałożono na szkiełka podstawowe po 10μl z każdej probówki i przykryto je

szkiełkiem nakrywkowym.

13. Po zakończonym wirowaniu wyjęto probówki, ściągnięto supernatant i przeniesiono do

nowej probówki, którą podpisano: „EJ 0.4 M”. Zmierzono objętość preparatu = 18μl.

14. Przygotowano 3 probówki, do dwóch z nich odpipetowano po 798 l H₂O. Odpipetowano

po 2 l ekstraktów białkowych: do probówki 1 – EC, do probówki 2 – EJ . Do 3

probówki (próba ślepa) dodano 800μl wody. Dodano po 200 l odczynnika Bradford do

każdej probówki, wymieszano i po ok. 5 minutach zmierzono stężenie białek przy użyciu

spektrofotometru.

13. Ekstrakty cytoplazmatyczne i jądrowe przeniesiono do zamrażarki.

2) Obliczenia

Stężenie białka liczono korzystając ze wzoru C [µg/µl] = A₅₉₅ x b : c, gdzie

b =16,2 (współczynnik wyznaczany z krzywej wzorcowej)

c =2μl (ilość białka pobranego do pomiaru)

A₅₉₅ =0,674 (dla ekstraktu cytoplazmatycznego)

A₅₉₅ =0,069 (dla ekstraktu jądrowego)

Stężenie białka w ekstrakcie cytoplazmatycznym:

C_EC = 0,674 x 16,2 : 2μl = 5,46μg/μl

Stężenie białka w ekstrakcie jądrowym:

C_EJ = 0,069 x 16,2 : 2μl = 0,56μg/μl

Całkowita ilość białka w ekstrakcie cytoplazmatycznym

5,46μl/μg x 40μl = 218,4μg

Całkowita ilość białka w ekstrakcie cytoplazmatycznym

0,56μg/μl x 18μl = 10,08μg

Obliczenia wydajności dla ekstraktu cytoplazmatycznego:

Jeśli ze 100 μl komórek uzyskuje się 2000 μg białka,
to z 10 μl uzyskuje się D μg białka.
D = $\frac{10\text{μl}\ x\ 2000\text{μg}}{100\text{μl}}\ $= 200μg

Jeśli 200 μg białka to 100%,
to 218,4μg białka jest równe W_D%

W_D = 109,2%

Obliczenia wydajności dla ekstraktu jądrowego:

Jeśli ze 100 μl komórek uzyskuje się 600 μg białka,
to z 10 μl uzyskuje się H μg białka.
H = $\ \frac{10\text{μl}\ x\ 600\text{μg}}{100\text{μl}}\ $= 60 μg

Jeśli 60 μg białka to 100%,
to 10,08μg białka jest równe W_H%

W_H = 16,8%

3) Obrazy mikroskopowe

Pod mikroskopem w pierwszym przygotowanym preparacie komórki zaobserwowano, jednak w drugim preparacie nie pojawiły się żadne jądra komórkowe.

4) Wnioski

Na podstawie obliczonych wydajności można stwierdzić, że wydajność izolacji ekstraktu
cytoplazmatycznego wyszła bardzo dobra. Fakt, że wynosi ponad 100% (109,2%) można wytłumaczyć tym, że dane podane dla porównania są wartościami średnimi, a nie maksymalnymi. Natomiast wydajność izolacji ekstraktu jądrowego niestety wyszła bardzo niska – 16,8%, co mogło być spowodowane nieprawidłowym pobraniem nadsączu w trakcie izolacji.

1) Opis wykonywanych czynności

1. Ekstrakty EC i EJ otrzymane na poprzednich ćwiczeniach rozmrożono w lodzie, a następnie delikatnie zamieszano i odwirowano (4°C; 5 min; maksymalne obroty).
2. Otrzymany po wirowaniu supernatant z EC przeniesiono do nowej probówki podpisanej EC1. Ekstrakt EJ odrzucono ze względu na jego zbyt małą ilość.
3. Zmierzono objętości próbek EC1 = 30μl, EJ = ?, a następnie stężenia białek metodą Bradford. Próbkę EJ1 odrzucono ze względu na zbyt niską zawartość białek. Po konsultacji z prowadzącym do dalszych badań wykorzystano więc ekstrakt EC, który jednak również nie zawierał wymaganej ilości (163,8/800μg).
4. Do probówki EC1 dodano 60μl buforu do rozdziału 0,4M NaCl, by otrzymać roztwór o stężeniu NaCl równym o,2M.
5. Z probówki zawierającej DNA-celulozę zebrano i odrzucono nasącz, po czym całą zawartość probówki EC1 naniesiono na DNA-celulozę i silnie zworteksowano.
6. Probówkę dobrze zamknięto, a następnie wytrząsano 45 min w 4°C na wytrząsarce w pozycji poziomej.
7. Próbkę odwirowano przez 1 min, 1700xg. Supernatant przeniesiono do probówki opisanej
EC-NZ (nie związane) i zmierzono jego objętość = 62μl.
8. Do powstałego osadu dodano 120μl buforu do rozdziału 0,2M NaCl. Próbkę zworteksowano
i odwirowano przez 1 min, 1700xg. Powstały supernatant przeniesiono do probówki opisanej
EC-F1 i zmierzono jego objętość = 120μl.
9. Do osadu dodano 120μl buforu do rozdziału 0,2M NaCl, a następnie zworteksowano i odwirowano przez 1 min, 1700xg. Otrzymany supernatant przeniesiono do probówki opisanej EC-F2 i zmierzono jego objętość = 102μl.
10. Do powstałego osadu dodano 120μl buforu do rozdziału 0,8M NaCl. Próbkę zworteksowano
i odwirowano przez 1 min, 1700xg. Powstały supernatant przeniesiono do probówki opisanej
EC-F3 i zmierzono jego objętość = 63μl.
11. Z próbki otrzymanej w punkcie 8 (EJ-NZ) pobrano 2μl roztworu i oznaczono stężenie białka metodą Bradford.
12. Z próbek otrzymanych w punktach 9-10 (F1, F2, F3) pobrano po 2μl roztworu i oznaczono stężenie białka metodą Bradford.
13. Próbki otrzymane w punktach 8-10 przeniesiono do zamrażarki.

2) Obliczenia

Całkowita ilość białka w próbce EC1:

5,46μg/μl x 30μl = 163,8μg

Stężenie białka liczono korzystając ze wzoru C [µg/µl] = A₅₉₅ x b : c, gdzie

b =16,2 (współczynnik wyznaczany z krzywej wzorcowej)

c =2μl (ilość białka pobranego do pomiaru)

A₅₉₅ = 0,622 (EC-NZ)

A₅₉₅ = 0,011 (EC-F1)

A₅₉₅ = 0,898 (EC-F2)

A₅₉₅ = 0,035 (EC-F3)

Stężenie białka w EC-NZ:

C_EC-NZ = 0,622 x 16,2 : 2μl = 5,038μg/μl

Stężenie białka w EC-F1:

C_EJ-F1 = 0,011 x 16,2 : 2μl = 0,089μg/μl

Stężenie białka w EC-F2:

C_EJ-F2 = 0,898 x 16,2 : 2μl = 7,274μg/μl

Stężenie białka w EC-F3:

C_EJ-F3 = 0,035 x 16,2 : 2μl = 0,284μg/μl

Całkowita ilość białka w EC-NZ:

5,038μl/μg x 30μl = 151,14μg

Całkowita ilość białka w EC-F1:

0,089μg/μl x 30μl = 2,67μg

Całkowita ilość białka w EC-F2:

7,274μl/μg x 30μl = 218,22μg

Całkowita ilość białka w EC-F3:

0,284μl/μg x 30μl = 8,52μg

132,4	Ilość białka [μg]	% białka nałożonego na DNA-celulozę
Białko nałożone na DNA-celulozę	163,8	100
Białko niezwiązane z DNA-celulozą (NZ)	151,14	92,3
Białko niespecyficznie związane z DNA-celulozą (wypłukane 0.2M NaCl) (F1+F2)	220,89	134,9
Białko specyficznie związane z DNA-celulozą (wypłukane NaCl) (F3)	8,52	5,2

3) Wnioski

Sumaryczna ilość białka we wszystkich frakcjach nie jest równa ilości białka nałożonego na DNA-celulozę. Jest ona o 216,75μg większa. Wszystkie obliczenia dokonane zostały w odniesieniu do faktycznej zawartości białka w preparacie wyjściowym (163μg), a nie do ilości zalecanej przez instrukcję (800μg). Ciężko jest określić co spowodowało tak ogromną różnicę zawartości białka w preparatach. Możliwym powodem mogą być błędne dane dotyczące stężeń białka w poszczególnych próbkach badanych za pomocą spektofotomertu (związane z wadliwym działaniem sprzętu), jak również błędy wykonujących ćwiczenie (takie jak niewystarczające wymieszanie próbek, czy niedokładne pipetowanie).

1) Opis wykonywanych czynności

1. Przygotowano aparat do elektroforezy.
2. Przygotowano wg instrukcji 7 ml 12% żelu poliakrylamidowego bez dodatku TEMED do elektroforezy. Do osobnej próbówki przeniesiono 1 ml żelu i dodano do niego 2μl TEMED, po czym całość wylano pomiędzy szyby i odczekano aż spolimeryzuje.
3. Do pozostałej mieszaniny dodano 4μl TEMED i od razu wylano pomiędzy szyby do zaznaczonego poziomu. Na powierzchnię żelu wylano 1 ml wody. Pozostawiono do spolimeryzowania.
4. Przygotowano wg instrukcji 2 ml żelu zagęszczającego bez dodatku TEMED. Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego wylano wodę i osuszono szybki bibułą. Do przygotowanego żelu zagęszczającego dodano 2μl TEMED i od razu wylano pomiędzy szyby aż do utworzenia menisku wypukłego. Następnie pomiędzy szyby delikatnie włożono grzebień i pozostawiono do spolimeryzowania.
5. Z preparatu EC pobrano 4μl roztworu (20μg białka) do nowej probówki nr 1. Preparat uzupełniono 11μl 0,2M NaCl aby objętość końcowa była równa 15μl.
6. Do osadu białkowego z ćw. 2 dodano 15μl wody i opisano jako probówkę nr 2.
7. Z preparatu EC-NZ pobrano 4μl roztworu do nowej probówki nr 3. Preparat uzupełniono 3μl 1M NaCl oraz 8μl wody tak, aby końcowe stężenie NaCl wynosiło 0,2M, a objętość końcowa była równa 15μl.
8. Ze wszystkich frakcji (F1, F2, F3) pobrano 20μl i przeniesiono kolejno do probówek 4, 5, 6.
9. Do preparatów 1 i 3 dodano po 3μl LB 6x, do preparatów 4-6 dodano po 4μl buforu LB 6x.
10. Wszystkie próby (1-6) gotowano przez 3 min w termobloku (95°C), a następnie krótko zwirowano na maksymalnych obrotach.
11. Przygotowano wg instrukcji bufor do elektroforezy i założono żele do aparatu.
12. Wlano bufor do wewnętrznej części pomiędzy szyby, aż do samej góry i do zewnętrznej części.
13. Do pierwszej ścieżki utworzonej w żelu naniesiono 5μl markera masy. Do następnych ścieżek naniesiono kolejno wszystkie preparaty.
14. Elektroforezę prowadzono pod napięciem 100 V przez 15 min, a następnie zwiększono napięcie do 200 V. Proces prowadzono aż do przejścia barwnika do końca żelu.
15. Po skończonej elektroforezie żele wyjęto, usunięto z nich żel zagęszczający i przełożono do przygotowanego pudełeczka. Następnie zalano je barwnikiem i barwiono na kołysce przez 30 min.
16. Po upływie pół godziny barwnik zlano do butelki, a żel zalano odbarwiaczem i pozostawiono aż do odbarwienia tła.
17. Przez dwa kolejne dni zużyty odbarwiacz zlewano do butelki z węglem aktywnym (regeneracja), a na żele nalewano nową porcję odbarwiacza.

2) Obrazy

3) Wnioski

Niestety na pierwszym żelu nie widoczne są żadne ślady rozejścia się preparatów poza ładnie rozdzielonym markerem. Na drugim wybarwionym żelu ścieżki są co prawda widoczne, ale nie widać prążków elektroforetycznych. W związku z tym nie można nawet w przybliżeniu określić mas wyizolowanych białek. Nieudany rozdział mógł być spowodowany niską wydajnością uzyskiwanych preparatów.
Ilość białek wiążących DNA izolowanych z EC i z EJ nie powinna być podobna, ponieważ jądro składa się w większości z białek (ilość białek do 75% zawartości jądra), a cytoplazma z wody (zawartość białek do 50% suchej masy – po odparowaniu wody; zawartość wody do 90%).