2.2 Oznaczanie aktywności poligalakturonaz metodą kolorymetryczną

Zasada oznaczenia aktywności poligalakturonaz:
Metoda ta polega na utlenieniu kwasem 3,5 – dinitrosalicylowym grup redukujących w produktach uwalnianych w wyniku degradacji (enzymatycznej hydrolizy wiązania α-1,4-glikozydowego) pektanu sodu lub niskozmetoksylowanej pektyny przez poligalakturonazy. Natężenie barwy powstałego kompleksu mierzy się kolorymetrycznie przy 530 nm.

Opis doświadczenia:

• Próba właściwa (E_w): - do 0,5 ml 0,5 % roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodać 0,5 ml preparatu enzymatycznego Pektynazy rozcieńczonego 5000x i inkubować w czasie 10 minut w temperaturze 30°C. Reakcję enzymatyczną przerwać przez dodanie 1 ml roztworu DNS (kwasu 3,5 – dinitrosalicylowego). Następnie mieszaninę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodać 3 ml wody destylowanej, wymieszać i odczytać absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm wobec próby kontrolnej (próba ślepa nie jest wykonywana ponieważ jej absorbancja jest równoważna absorbancji próby kontrolnej).

• Próba kontrolna (E_k): - 0,5 ml 0,5 % roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodać 1 ml roztworu DNS (kwasu 3,5 – dinitrosalicylowego) i 0,5 ml preparatu enzymatycznego Pektynazy rozcieńczonego 5000x. Inkubować w czasie 10 minut w temperaturze 30°C. Następnie mieszaninę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodać 3 ml wody destylowanej, wymieszać i odczytać absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm.

Obliczenia:

Absorbancja A₅₃₀ próby właściwej wynosi 0,195. Absorbancja A₅₃₀ próby kontrolnej wynosi 0. Absorbancja A₅₃₀ próby kontrolnej jest równoważna absorbancji A₅₃₀ próby ślepej (dlatego próba ślepa nie jest wykonywana).

Aktywność poligalakturonazy wyliczam ze wzoru:

$$\text{U\ }\left( \text{PG} \right) = \frac{x \bullet R \bullet 2}{212 \bullet t}\left\lbrack \frac{\text{μmol}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{min \bullet ml} \right\rbrack$$

x – odczyt z krzywej wzorcowej $\left\lbrack \frac{\text{μg}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{probe} \right\rbrack$

R – rozcieńczenie enzymu 5000x

t – czas reakcji enzymatycznej [min]

212 – masa 1 μmola kwasu D-galakturonowego $\left\lbrack \frac{ug}{u\text{mol}} \right\rbrack$

2 – przeliczenie na 1 ml enzymu

Za jednostkę aktywności poligalakturonaz przyjmuje się taką ilość enzymu, która w ciągu 1 minuty w temperaturze 30°C uwalnia z substratu grupy redukujące w ilości równoważnej 1 µmolowi kwasu
D – galakturonowego.

Zależność $0,1\ - \ \ 220\ \frac{\text{μg}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{\text{ml}}$ wynika z krzywej wzorcowej. Krzywą wzorcową w tym przypadku nazywamy przedstawioną graficznie zależność absorbancji A₅₃₀ od znanego stężenia substancji wzorcowej (kwas galakturonowy [μg/ml]). Wykonanie takiego wykresu umożliwia bezpośrednie odczytywanie szukanych stężeń na podstawie zmierzonych wartości absorbancji oznaczanych prób.

$$0,1 - 220\ \left\lbrack \frac{\text{μg}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{\text{ml}} \right\rbrack$$

$$0,195 - x\left\lbrack \frac{\text{μg}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{\text{ml}} \right\rbrack$$

$$x = \ \frac{0,195\ \bullet 220\ \frac{\text{μg}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{\text{ml}}}{0,1} = 429\left\lbrack \ \frac{\text{μg}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{\text{ml}} \right\rbrack$$

$$U\left( \text{PG} \right) = \ \frac{429\ \frac{\text{μg}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{\text{ml}} \bullet 5000 \bullet 2}{212\frac{\text{μg}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{\text{μmol}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}} \bullet 10\ min}\ \left\lbrack \frac{\text{μmol}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{min \bullet ml} \right\rbrack$$

$$\text{U\ }\left( \text{PG} \right) = \ 2023,58\ \left\lbrack \frac{\text{μmol}_{\text{kwasu\ galakturonowego}}}{min \bullet ml} \right\rbrack$$