Biochemia

laboratorium

Ćwiczenie 9:

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA PEKTYN

Sprawozdanie poprawione 27.06.2011

grupa:

Katarzyna Kędzierska 144530

Dominika Kępska

Justyna Dabrowska

kierunek Biotechnologia

grupa dziekańska: III

semestr: IV

data wykonania ćwiczenia: 26.05.2011

data oddania sprawozdania 2.06.2011

Część teoretyczna:

1. Substancje pektynowe:
   Substancje pektynowe są to heteropolisacharydy roślinne, pełniące funkcję strukturalną. Nazywamy je tzw. lepiszczem międzykomórkowym, gdyż są odpowiedzialne za spójność tkanek. Podstawową jednostką budulcową substancji pektynowych jest głównie reszta kwasu D - galakturonowego (w różnym stopniu zestryfikowana metanolem), rzadziej reszty innych cukrów prostych np. glukozy, galaktozy, mannozy i arabinozy.
   Pektyny natomiast są to polimery kwasu galakturonowego o wyższym stopniu metoksylacji (powyżej 10%), w których poszczególne reszty tego kwasu są połączone wiązaniami 1,4 - α - glikozydowymi.
   Kwas pektynowy - kwas poligalakturonowy zestryfikowany metanolem w niewielkim stopniu (do 10%), rozpuszczalny w wodzie tylko w postaci alkalicznych soli pektynianów.
   Kwas pektowy - kwas poligalakturonowy nie zestryfikowany metanolem.
   Pektyny można podzielić pod względem metoksylacji reszt kwasu galakturonowego na pektyny o:

• niskim stopniu metoksylacji ( do 50% zestryfikowanych metanolem reszt kwasu galakturonowego)

• wysokim stopniu metoksylacji ( ponad 50% zestryfikowanych metanolem reszt kwasu galakturonowego).

2. Enzymy pektynolityczne:
   Enzymy pektynolityczne są to enzymy rozkładające substancje pektynowe. Są one wytwarzane przez rośliny i wiele drobnoustrojów. Podzielić je można na enzymy deestryfikujące i depolimeryzujące. Najważniejsze enzymy pektynolityczne to:

• Pektynoesteraza (EC 3.1.1.11)

• Poligalakturonaza (EC 3.2.1.15)

• Egzopoligalakturonazy

• Liaza pektynianowa (EC 4.2.2.10)

• Liaza pektatowa (EC 4.2.2.2).

3. Celem ćwiczenia jest poznanie metod oznaczania najważniejszych aktywności charakteryzujących preparaty pektynolityczne:

• Ogólną aktywność pektyno lityczną, wyrażaną w °PM,

• Aktywność pektynoesterazy (PE),

• Aktywność poligalakturonazy (PG).
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  Część doświadczalna.

2.1. Oznaczanie ogólnej aktywności pektynolitycznej.

Opis doświadczenia: Zadanie polega na zmierzeniu czasu wypływu przez kapilarę wiskozymetru wody destylowanej o temperaturze 20°C. W taki sam sposób mierzymy wypływ przez kapilarę wiskozymetru cieczy- przygotowanych jako próba 1 i próba 2.

Przygotowanie próby 1: Do 20ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01M buforze octanowym o pH 3,8 , o temperaturze 20°C wprowadzamy 0,2ml wody destylowanej i dokładnie mieszamy. Do wiskozymetru wlewamy 20ml roztworu próby 1 i mierzymy czas wypływu [s].

Przygotowanie próby 2: Do 20ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01M buforze octanowym o pH 3,8 , o temperaturze 20°C wprowadzamy 0,2ml odpowiednio rozcieńczonego tym buforem enzymu- w naszym przypadku rozcieńczenie wynosi 800x , dokładnie mieszamy i inkubujemy w temperaturze 20°C przez 30minut. Po tym czasie wlewamy do wiskozymetru 20ml roztworu próby 2 i mierzymy czas wypływu [s].

Obliczenia:

Lepkość początkową roztworu pektyny obliczamy ze wzoru:

V_a= t_a/ t_H2O

V_a- lepkość początkowa roztworu pektyny

t_a- czas wypływu przez kapilarę wiskozymetru 20ml roztworu próby 1 [s]

t_H2O- czas wypływu przez kapilarę wiskozymetru 20ml wody destylowanej o temperaturze 20°C [s]

Po podstawieniu do wzoru uzyskanych przez nas danych otrzymujemy:

V_a=295,35s /99,70s

V_a=2,962

Lepkość roztworu pektyny po określonym czasie działania enzymu obliczamy ze wzoru:

V= t/t_H2O

V- lepkość roztworu pektyny po określonym czasie działania enzymu

t- czas wypływu przez kapilarę wiskozymetru 20ml roztworu próby 2 [s]

t_H2O- czas wypływu przez kapilarę wiskozymetru 20ml wody destylowanej o temperaturze 20°C [s]

Po podstawieniu do wzoru uzyskanych przez nas danych otrzymujemy:

V= 228,4s /99,70s

V=2,291

Procentowy spadek lepkości pektyny, zadanej preparatem enzymatycznym obliczamy ze wzoru:

A={(V_a- V)/ (V_a- V₀)} *100%

1. procentowy spadek lepkości pektyny, zadanej preparatem enzymatycznym [%]

V_0- lepkość roztworu po całkowitej hydrolizie pektyny, czyli tzw. lepkość graniczna (która została nam podana podczas zajęć laboratoryjnych i wynosi= 1,1)

Po podstawieniu do wzoru uzyskanych przez nas danych otrzymujemy:

A={(2,962- 2,291)/ (2,962- 1,1)} *100%

A=36,04%

Ponieważ procentowy spadek lepkości pektyny, zadanej preparatem enzymatycznym powinien być zawarty w przedziale 50-60% konieczne jest wydłużenie reakcji enzymatycznej. W tym celu pozostawiamy mieszaninę w wiskozymetrze na kolejne 20min. Po upływie tego czasu ( sumaryczny czas reakcji wynosi 50min) mierzymy czas wypływu roztworu przez kapilarę wiskozymetru, ponownie wyliczmy V i A.

V= 202,1s /99,70s

V=2,027

A={(2,962- 2,027)/ (2,962- 1,1)} *100%

A= 50,21%

Następnie obliczamy ogólną aktywność pektynolityczną, wyrażoną w °PM ze wzoru:

°PM= 750/ {(T/A-0,0097*T) *CE}

°PM- jednostka ogólnej aktywności pektynolitycznej [°PM]

°PM- określają, w ilu litrach 0,5% roztworu pektyny nastąpi spadek lepkości o 85% w ciągu 5 godzin w temperaturze 20°C, pod działaniem 1kg preparatu pektynolitycznego.

T- czas, w którym nastąpił właściwy spadek lepkości [s]

CE- stężenie preparatu enzymatycznego w roztworze pektyny [%]

1. procentowy spadek lepkości pektyny, zadanej preparatem enzymatycznym [%]

Obliczamy CE:

0,2ml odpowiednio rozcieńczonego preparatu enzymatycznego- odpowiada 20ml roztworu pektyny. Przeliczając na 100ml roztworu pektyny, ilość wprowadzonego preparatu wynosi x. Zatem z proporcji:

0,2ml_{rozc. p. enzymatycznego}- 20ml_{roztw. pektyny}

x ml _{rozc. p. enzymatycznego}-100ml_{roztw. pektyny}

x= (0,2ml_{rozc. p. enzymatycznego}* 100ml_{roztw. pektyny})/ 20ml_{roztw. pektyny}

x= 1ml_{rozc. p. enzymatycznego}

Po uwzględnieniu zastosowanego przez nas rozcieńczenia 800x otrzymujemy:

1ml 800x rozcieńczonego preparatu enzymatycznego zawiera:

1g/ 800ml= 1,25*10^-3 g/ml=1,25*10^-3 % preparatu enzymatycznego

Po podstawieniu do wzoru uzyskanych przez nas danych otrzymujemy:

°PM= 750/ {(3000s/50,21%-0,0097*3000s) *1,25*10^-3 % }

°PM= 19576°PM

Analogiczne obliczenia przeprowadziły inne grupy dla preparatów pektynazy i pektopolu.

Zestawienie tych danych zamieszczamy w poniższej tabeli.

Tabela nr 1

Tytuł tabeli: Ogólna aktywność pektynolityczna w °PM w zależności od użytego preparatu.

Preparat	Ogólna aktywność pektynolityczna [°PM]
pektopol	10743 16739 11936 18902
pektynaza	33186 19576 28846 20117

Wnioski:

Dane zebrane w tabeli są tego samego rzędu wielkości, co oznacza, że oba preparty zawierają enzymy pektynolityczne o zbliżonej aktywności. Różnice co do ogólnej aktywności pektynolitycznej wynikają z różnego rozcieńczenia preparatów enzymatycznych, a zatem z różnego stężenia preparatu enzymatycznego w roztworze pektyny. Różny był także czas, w którym nastąpił właściwy spadek lepkości ( 30min lub 50min). Możliwe są także niedokładności pomiarowe związane z mierzeniem czasu wypływu cieczy poprzez kapilarę wiskozymetru.

Zasada oznaczenia: Zasada oznaczenia jest związana ze spadkiem lepkości 0,5% roztworu pektyny w 0,01M buforze octanowym o pH 3,8, o temperaturze 20°C która jest wynikiem sumarycznego działania kompleksu enzymów pektynolitycznych zawartych w preparacie: pektynoesteraz, poligalakturonaz i liaz. Powyższe enzymy degradują substancje pektynowe poprzez hydrolizę wiązań estrowych i α-1,4-glikozydowych w pektynie. Dzięki hydrolizie tych wiązań następuje zmniejszenie lepkości roztworu , wzrasta szybkość i maleje czas wypływu przez kapilarę wiskozymetru badanej cieczy. I tak dla niezhydrolizowanego roztworu pektyny czas jej wypływu wynosi przez kapilarę wiskozymetru wynosi 295,35s natomiast po zajściu reakcji enzymatycznej wypływ tej samej objętości cieczy z próby 2 wynosi 202,10s. Uzależniając te dane od wypływu wody destylowanej z wiskozymetru i podstawiając do odpowiednich wzorów możemy wyliczyć ogólną aktywność pektynolityczną, co też uczyniliśmy.

2.2 Oznaczanie aktywności poligalakturonaz metodą kolorymetryczną

Zasada oznaczenia aktywności poligalakturonaz:
Aktywność enzymu określa się jako przyrost produktów w odniesieniu do czasu reakcji katalizowanej przez ten enzym.
Aktywność poligalakturonazy (PG) oznacza się na podstawie ilości grup aldehydowych uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy wiązania α-1,4-glikozydowego w kwasie poligalakturonowym lub w niskozmetoksylowanej pektynie.

Opis doświadczenia:

• Próba właściwa (E_w): - do 0,5 ml 0,5 % roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodać 0,5 ml preparatu enzymatycznego Pektynazy odpowiednio rozcieńczonego 5000x i inkubować w czasie 10 minut w temperaturze 30°C. Reakcję enzymatyczną przerwać przez dodanie 1 ml roztworu DNS (kwasu 3,5 - dinitrosalicylowego). Następnie mieszaninę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodać 3 ml wody destylowanej, wymieszać i odczytać absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm wobec próby kontrolnej (próba ślepa nie jest wykonywana ponieważ jej absorbancja jest równoważna absorbancji próby kontrolnej).

• Próba kontrolna (E_k): - 0,5 ml 0,5 % roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodać 1 ml roztworu DNS (kwasu 3,5 - dinitrosalicylowego) i 0,5 ml preparatu enzymatycznego Pektynazy odpowiednio rozcieńczonego 5000x. Inkubować w czasie 10 minut w temperaturze 30°C. Następnie mieszaninę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodać 3 ml wody destylowanej, wymieszać i odczytać absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm.
  

Obliczenia:

Absorbancja A₅₃₀ próby właściwej wynosi 0,195. Absorbancja A₅₃₀ próby kontrolnej wynosi 0. Absorbancja A₅₃₀ próby kontrolnej jest równoważna absorbancji A₅₃₀ próby ślepej (dlatego próba ślepa nie jest wykonywana).

Aktywność poligalakturonazy wyliczam ze wzoru:

Gdzie:

x - odczyt z krzywej wzorcowej

R - rozcieńczenie enzymu

t - czas reakcji enzymatycznej [min]

212 - masa 1 μmola kwasu D-galakturonowego

2 - przeliczenie na 1 ml enzymu

Zależność
wynika z krzywej wzorcowej. Krzywą wzorcową w tym przypadku nazywamy przedstawioną graficznie zależność absorbancji A₅₃₀ od znanego stężenia substancji wzorcowej (kwas galakturonowy [μg/ml]). Wykonanie takiego wykresu umożliwia bezpośrednie odczytywanie szukanych stężeń na podstawie zmierzonych wartości absorbancji oznaczanych prób.

Wnioski:

Uzyskana aktywność pokazuje nam, że w ciągu jednej minuty jeden ml enzymu rozłożył ok. 2024 μmoli pektyny.

Zasada oznaczenia:
Aktywność enzymu określa się jako ilościowy przyrost produktów w odniesieniu do czasu reakcji katalizowanej przez ten enzym. Za jednostkę poligalakturonaz przyjmuję się taką ilość enzymu, która w ciągu 1 minuty w temperaturze 30°C uwalnia z substratu grupy redukujące w ilości równoważnej 1 μmolowi kwasu D-galakturonowego.

2.3. Oznaczanie aktywności pektynoesterazy (ćwiczenie pokazowe):

Zasada oznaczenia:
Aktywność pektyno esterazy (PG) oznacza się na podstawie ilości grup karboksylowych uwolnionych w wyniku enzymatycznej hydrolizy wiązania estrowego w pektynie.
Różnica w objętościach 0,1 M NaOH, zużytych na odmiareczkowanie próby właściwej i ślepej, odpowiada ilości ługu potrzebnego do związania uwolnionych w czasie reakcji grup karboksylowych.

Równanie reakcji hydrolizy wiązania estrowego:



Opis doświadczenia:
Przygotowanie próby właściwej: Do zlewki o pojemności 200ml wlaliśmy 50ml roztworu pektyny w 0,1 MNaCl ogrzanej do temperatury 30°C. Przy pomocy 0,1 M NaOH doprowadziliśmy pH pektyny do 4. Dodaliśmy 50 ml wodnego roztworu preparatu pektynolitycznego podgrzanego do tej samej temperatury. Po wymieszaniu mieszaninę inkubowaliśmy na łaźni wodnej o temperaturze 30°C w czasie 30 minut. Następnie za pomocą 0,1 M roztworu NaOH doprowadziliśmy pH mieszaniny do 7,5 , notując zużycie ługu.
Przygotowanie próby ślepej: Próbę ślepą przygotowaliśmy w podobny sposób jak próbę właściwą z tą różnicą, że do roztworu pektyny dodaliśmy roztwór preparatu pektynolitycznego po uprzedniej inaktywacji przez ogrzanie we wrzącej łaźni wodnej w czasie 25 minut.

Obliczenia:
Aktywność pektynoesterazy wyraża się jako ilość mikrorównoważników wiązań estrowych, zhydrolizowanych przez 1g (lub 1ml) preparatu pektynolitycznego, w czasie 1 minuty, w temperaturze 30°C, w obecności 0,1 M NaCl
. Zarazem międzynarodowa jednostka aktywności enzymu [U] oznacza taką ilość enzymu, która katalizuje przemianę jednego µmola substratu lub określonej jego części, tj. 1 µmola odpowiednich grup chemicznych, w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30°C i w optymalnych warunkach pH. Zwykle stężenie enzymu podaje się w jednostkach na 1 ml roztworu [U/ml], lub w jednostkach na 1 g preparatu stałego [U/g].

Wyniki miareczkowania:

• V - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na miareczkowanie grup karboksylowych, uwalnianych w próbie właściwej:
  V = V₁+V₂
  gdzie:
  V₁ - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na doprowadzenie pH roztworu pektyny do pH=4
  (w próbie właściwej) [ml],
  V₁=11,2ml,
  V₂ - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na zobojętnienie grup karboksylowych w mieszaninie (w próbie właściwej) [ml],
  V₂=15,8ml.

V = V₁+V₂= 11,2 ml + 15,8 ml = 27 [ml]

• V₀ - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na miareczkowanie grup karboksylowych uwalnianych w próbie ślepej:
  V₀ = V₀₁+V₀₂
  gdzie:
  V₀₁ - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na doprowadzenie pH roztworu pektyny do pH=4
  (w próbie ślepej) [ml],
  V₀₁=10,6ml,
  V₀₂ - ilość ml 0,1M NaOH, zużyta na zobojętnienie grup karboksylowych w mieszaninie (w próbie ślepej) [ml],
  V₀₂=0,1ml.

V₀ = V₀₁+V₀₂= 10,6 ml + 0,1 ml = 10,7 [ml]

Aktywność pektynoesterazy wyraża się jako ilość mikrorównoważników wiązań estrowych, zhydrolizowanych przez 1g (lub 1ml) preparatu pektynolitycznego, w czasie 1 minuty, w temperaturze 30°C, w obecności 0,1 M NaCl
.
Do obliczeń aktywności pektynoesterazy stosujemy wzór:


gdzie:
U (PE) - aktywność pektynoesterazy [
],
V - ilość ml 0,1 M NaOH, zużytych na miareczkowanie grup karboksylowych uwalnianych w próbie właściwej [ml],
V₀ - ilość ml 0,1 M NaOH, zużytych na miareczkowanie grup karboksylowych uwalnianych w próbie ślepej [ml],
100 - ilość mikrorównoważników wiązań estrowych, odpowiadająca 1ml 0,1 M NaOH
[
],
t - czas hydrolizy [min],
v - ilość preparatu pektyno litycznego [ml], przy czym:


gdzie:
50 - ilość preparatu pektynolitycznego użyta do oznaczenia [ml],
200 - wartośc rozcieńczenia preparatu pektynolitycznego.

dla:
V = 11,2 ml + 15,8 ml = 27 [ml]
V₀ = 10,6 ml + 0,1 ml = 10,7 [ml]


t = 30 [min]

mamy:


Wnioski:
Według powyższego wyniku wyliczonej aktywności pektynoesterazy (PG) w wodnym roztworze pektynolitycznym równego 217,33 [µmol_{grup karboksylowych}/ml*min] wiemy, że w ciągu jednej minuty, w temperaturze 30°C, w obecności 0,1 M NaCl zostało zhydrolizowanych przez 1ml wodnego roztworu preparatu pektynolitycznego 217,33 mikrorównoważników wiązań estrowych w roztworze pektyny.

---