Katarzyna Syka (sprawozdanie)
Beata Szymczak
Wydział: Biotechnologii i Nauk o Żywności
Kierunek studiów: biotechnologia
Rok studiów: III
Grupa: V
ĆWICZENIE NR 9
ENZYMATYCZNA HYDROLIZA PEKTYN
Data wykonania ćwiczenia: 17.12.2008
Data oddania sprawozdania: 09.01.2009
Wprowadzenie
Substancje pektynowe stanowią grupę strukturalnych roślinnych heteropolisacharydów odpowiedzialnych za utrzymanie spójności tkanek. Podstawą budowy substancji pektynowych jest łańcuch złożony z kwasu α-D-galaktouronowego, którego reszty są połączone wiązaniami 1,4-α-glikozydowymi i w różnym stopniu zestryfikowane metanolem.
Substancje pektynowe są związkami szeroko rozpowszechnionymi w przyrodzie. Występują głównie w przestrzeni międzykomórkowej oraz w ścianie komórek roślinnych.
Właściwe pektyny są to polimery kwasu poligalaktouronowego, w którym znaczna liczba grup karboksylowych została zestryfikowana metanolem.
Kwasami pektynowymi nazywa się wielkocząsteczkowe polimery kwasu galaktouronowegu, w których tylko niewielka część grup karboksylowych jest zestryfikowana metanolem.
Kwas pektowy to kwas poligalakturonowy, którego reszty kwasowe nie są zmetoksylowane.
Enzymy pektynolityczne:
Pektynoesteraza (EC 3.1.1.11)
Hydrolizuje wiązania estrowe w pektynie z uwolnieniem alkoholu metylowego
Poligalakturonaza (EC 3.2.1.15)
Hydrolizuje wewnętrzne wiązania 1,4-α-glikozydowe w kwasie pektowym w sposób nieuporządkowany, wytwarzając oligopoligalakturonidy.
Enzymy te rozszczepiają jedynie wiązania glikozydowe sąsiadujące z wolną grupą karboksylową.
Liaza pektynianowa (EC 4.2.2.10)
Rozszczepia wewnętrzne wiązania 1,4-α-glikozydowe w pektynie.
Enzymy te nie działają na kwas pektowy.
Liaza pektatowa (EC 4.2.2.2)
Rozszczepia wewnętrzne wiązania glikozydowe w kwasie poligalakturonowym.
Enzymy te nie działają na pektyny.
Preparaty te stosuje się głównie w przemyśle spożywczym i winiarskim do:
- klarowania win,
- otrzymywania soków klarownych,
- zwiększania wydajności soku i właściwej ekstrakcji substancji barwnych i zapachowych,
- rozpłynniania surowców przy produkcji pulp, puree, nektarów.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest poznanie metod oznaczania najważniejszych aktywności charakteryzujących preparaty pektynolityczne: ogólna aktywność pektynolityczna, aktywność pektynoesterazy, aktywność poligalakturonazy.
Część doświadczalna
Preparat pektynolityczny - pektopol
Oznaczenie ogólnej aktywności pektynolitycznej
Wykonanie:
Zmierzyłam czas wypływu przez kapilarę wiskozymetru wody destylowanej
o temperaturze 20oC-tH2O (sek).
Próba 1:
Do 20 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01M buforze octanowym o pH 3,8,
o temperaturze 20oC, wprowadziłam 0,2 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszałam. Następnie odpowiednią ilość roztworu próby 1 (10-20 ml) wlałam do wiskozymetru i zmierzyłam czas wypływu-ta (sek).
Próba 2:
Do 20 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01M buforze octanowym o pH 3,8,
o temperaturze 20oC, wprowadziłam 0,2 ml odpowiednio rozcieńczonego tym buforem enzymu, dokładnie wymieszałam i inkubowałam w temperaturze 20oCw ciągu 40 minut. Po tym czasie wlałam do wiskozymetru 10-20 ml roztworu próby 2 i zmierzyłam czas
wypływu- t (sek)
Obliczenia i wyniki:
Próba 1:
Z wzoru
wyliczam lepkość początkową roztworu pektyny.
ta = 71,1 s
tH2O = 45,7 s
Próba 2:
Z wzoru
wyliczam lepkość roztworu pektyny po określonym czasie działania enzymu.
t = 60 s
tH2O = 45,7 s
Ogólną aktywność pektynolityczną, wyrażoną w oPM wyliczam ze wzoru:
gdzie:
A - procentowy spadek lepkości pektyny, zadanej preparatem enzymatycznym obliczamy ze wzoru:
T - czas, w którym nastąpił właściwy spadek lepkości (sek)
CE - stężenie preparatu enzymatycznego w roztworze pektyny (%)
Do 20 ml roztworu pektyny wprowadziłam 0,2 ml odpowiednio rozcieńczonego preparatu enzymatycznego. Przeliczając na 100 ml roztworu pektyny, ilość wprowadzonego preparatu wynosiłaby 1 ml. Z definicji stężenia procentowego wiadomo, że jest to ilość gramów substancji zawartej w 100 ml roztworu. Należy więc wyliczyć ilość g wyjściowego preparatu enzymatycznego w 1 ml użytego do reakcji roztworu enzymu.
Zatem: 20 ml roztworu pektyny + 0,2 ml preparatu enzymatycznego
100 ml roztworu pektyny + 1 ml preparatu enzymatycznego
Pektopol był rozcieńczony 200 razy, czyli: 1g / 200 ml = 0,005 g/ml
Ilość g preparatu w 1 ml rozcieńczonego roztworu enzymu jest równoznaczna z jego
stężeniem % w roztworze pektyny, czyli CE=0,005%.
% Vo - graniczna lepkość = 1,1
oPM określają w ilu litrach 0,5% roztworu pektyny nastąpi spadek lepkości o 85% w ciągu 5 godzin w temperaturze 20 oC, pod działaniem 1 kg preparatu pektynolitycznego.
Wnioski:
Ogólną aktywność pektynolityczną, wyrażoną w oPM, oznacza się na podstawie spadku lepkości roztworu pektyny pod działaniem preparatu pektynolitycznego. Spadek lepkości jest wynikiem sumarycznego działania kompleksu enzymów pektynolitycznych zawartych w preparacie. Mogą to być pektynoesterazy, poligalakturonazy i liazy.
Oznaczenie aktywności poligalakturonaz metodą kolorymetryczną
Wykonanie:
Próba właściwa: do 0,5 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodałam 0,5 ml odpowiednio rozcieńczonego (5000 razy) woda preparatu enzymatycznego i inkubowałam w czasie 10 minut w temperaturze 30oC. Reakcję enzymatyczną przerwałam przez dodanie 1 ml odczynnika DNS. Następnie mieszaninę umieściłam we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut , aby zaszła reakcja uwolnionych z substratu produktów redukujących z DNS. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodałam 3 ml wody destylowanej, wymieszałam i odczytałam absorbancję na fotokolorymetrze przy
530 nm wobec próby ślepej.
Próba kontrolna: do 0,5 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodałam 1 ml odczynnika DNS i 0.5ml roztworu enzymu. Dalszy tok postępowania jest taki sam jak dla próby właściwej. Zmierzyłam absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm wobec próby ślepej.
Próba ślepa: do 0,5 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodałam 1 ml odczynnika DNS i 0,5 ml wody destylowanej. Dalej postępowałam tak jak przy przygotowywaniu próby właściwej.
Obliczenia i wyniki:
Za jednostkę poligalakturonaz przyjmuje się taką ilość enzymu, która w ciągu 1 minuty w temperaturze 30oC uwalnia z substratu grupy redukujące w ilości równoważnej 1 μmolowi kwasu D-galakturonowego.
Aktywność poligalakturonazy wyliczyłam ze wzoru:
gdzie:
A-odczyt z krzywej wzorcowej [μg/próbę]
rozc - rozcieńczenie enzymu
t - czas reakcji enzymatycznej [min]
212 - masa 1 μmola kwasu D-galakturonowego
2-przeliczenie na 1 ml enzymu
Wnioski:
Aktywność poligalakturonazy oznacza się na podstawie ilości grup aldehydowych uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy wiązania α-1,4-glikozydowego w kwasie poligalakturonowym lub niskozmetoksylowanej pektynie.
Metoda polega na utlenieniu kwasem 3,5-dinitrosalicylowym grup redukujących w produktach uwolnionych w wyniku degradacji niskozmetoksylowanej pektyny przez poligalakturonazy.
Tabela nr 1. Zestawienie obliczonych wartości aktywności charakteryzujących preparaty pektynolityczne (pektopol i pektynaza)
Ogólna aktywność pektynolityczna |
Aktywność poligalakturonazy |
||
oPM |
μmol/g*min |
||
Pektopol |
Pektynaza |
Pektopol |
Pektynaza |
6906 |
10113 |
2387 |
6724 |
- |
- |
2024 |
6641 |
10256 |
10113 |
1774 |
5707 |
9107 |
11812 |
2656 |
6226 |
Wyniki umieszczone w tabeli nr 1 wskazują, że pektopol posiada niższą ogólną aktywność pektynolityczną i aktywność poligalakturonazy w stosunku do pektynazy..
Oznaczenie aktywności pektynoesterazy (ćwiczenie pokazowe)
Wykonanie:
Próba właściwa: do zlewki o pojemności 200 ml należy wlać 50 ml roztworu pektyny
w 0,1 M NaCl ogrzanej do temperatury 30oC. Przy pomocy0,1 M NaOH doprowadzić pH pektyny do 4. Dodać 50 ml wodnego roztworu preparatu pektynolitycznego podgrzanego do tej same temperatury. Po wymieszaniu mieszaninę inkubować na łaźni wodnej o temperaturze 30oC w czasie 30 minut. Następnie za pomocą 0,1 M roztworu NaOH doprowadzić pH mieszaniny do 7,5, notując zużycie ługu.
Próba ślepa: należy przygotować w podobny sposób jak próbę właściwą z tą różnicą, że do roztworu pektyny należy dodać roztwór preparatu pektynolitycznego po uprzedniej inaktywacji przez ogrzanie we wrzącej łaźni wodnej w czasie 25 minut. Różnica w objętościach 0,1 M NaOH, zużytych na odmiareczkowanie próby właściwej i ślepej, odpowiadailości ługu potrzebnego do związania uwolnionych w czasie reakcji grup karboksylowych.
Obliczenia i wyniki:
Aktywność pektynoesterazy wyraża się jako ilość mikrorównoważników wiązań estrowych, zhydrolizowanych przez 1g (lub 1ml) preparatu pektynolitycznego, w czasie 1 minuty, w temperaturze 30oC, w obecności 0,1 M NaCl.
Do obliczeń stosuje wzór:
gdzie:
V, Vo-ilość ml 0,1 M NaOH, zużytych na miareczkowanie grup karboksylowych,
uwalnianych w próbach,
100-ilość mikrorównoważników wiązań estrowych, odpowiadająca 1 ml 0,1 M NaOH,
t-czas hydrolizy (min),
v-ilość preparatu pektynolitycznego (ml).
V= 10,6 ml + 8,2 ml = 18,8 ml
Vo= 10,7 ml + 4,5 ml = 15,2 ml
Wniosek:
Aktywność pektynoesterazy została oznaczona na podstawie ilości grup karboksylowych uwolnionych w wyniku enzymatycznej hydrolizy wiązania estrowego w pektynie
6