Wydział: BINOŻ

Kierunek: Biotechnologia Michał Grandys

Semestr: IV Justyna Kulion

Grupa dziekańska: B5 Michał Lorentowicz

Środa 14¹⁵

Ćwiczenie nr 7

Enzymatyczna hydroliza tłuszczów.

Cel ćwiczenia:

Celem analizy jakościowej jest stwierdzenie obecności lipazy, α-amylazy i proteinazy w tabletce kreonu.

Celem analizy ilościowej jest określenie i porównanie poziomu aktywności lipazy w zależności od rodzaju substratu (oleju).

Wstęp teoretyczny:

Tłuszcze naturalne są wieloskładnikową mieszaniną lipidów wśród których przeważają trigricerole. Zanim tłuszcz zostanie poddany trawieniu w organizmie musi ulec hydrolizie do podstawowych składników którymi głównie są kwasy tłuszczowe i glicerol. Hydroliza lipaz przebiega z udziałem enzymów nazywanych lipazami- należących do klasy hydrolaz. Lipazy występują w tkankach zwierzęcych (trzustka, wątroba), roślinnych oraz w różnych drobnoustrojach. Hydrolizę triacylogricerolu przebiega etapowo:

Hydroliza przebiega szybciej, kiedy stosowany tłuszcz znajduje się w postaci emulsji. W celu emulacji stosuje się gumę arabską, żelatynę, alkohol poliwinylowy.

Część doświadczalna:

1. Przygotowanie emulsji oleju:

Do 40 ml oleju z pestek winogron dodaliśmy 60 ml 2% roztworu alkoholu poliwinylowego. Całość homogenizowaliśmy do uzyskania jednolitej emulsji.

1. Przygotowanie preparatu enzymatycznego:

Otrzymaną tabletkę kreonu utarliśmy na moździeźu, po czym rozpuściliśmy proszek w 10 ml buforu amonowego o pH 7, po czym przesączyliśmy roztwór przez gazę.

1. Badanie aktywności lipazy:

• Sposób wykonania:

Do trzech erlenmajerek o pojemności 100 ml wprowadziliśmy po 5 ml przygotowanej wcześniej emulsji, 4 ml buforu amonowego i 1 ml przygotowanego wcześniej preparatu enzymatycznego. Dodatkowo do jednej z nich wprowadziliśmy od razu 10 ml alkoholu etylowego (była to próba kontrolna). Pozostałe dwie erlenmajerki umieściliśmy w inkubatorze w 37^oC, jedną z nich na 30 min, drugą na 60 min. Po upływie wyznaczonego czasu dodaliśmy do erlenmajerek po 10 ml alkoholu etylowego. Roztwór znajdujący się w erlenmajerkach miareczkowaliśmy 0,05 molowym NaOH w obecności fenyloftaleiny, do uzyskania fioletowego zabarwienia utrzymującego się ok. 10 sec.

• Obliczenia:

$$A_{L} = \frac{\left( A - A_{0} \right)*20*50}{n*t}$$

A_L- aktywność lipazy [U/ml_{roztworu kreonu}]

A- objętość 0,05 M NaOH zużyta na odmiareczkowanie próby właściwej [ml]

A₀- objętość 0,05 M NaOH zużyta na odmiareczkowanie próby kontrolnej [ml]

n- ilość preparatu lipazy w mieszaninie reakcyjnej [ml]

50- współczynnik pozwalający przeliczyć cm³ 0,05 M NaOH na μM kwasu tłuszczowego

20- rozcieńczenie

t- czas [min]

Przykład obliczeń dla Oleju z pestek winogron, po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37^oC

$$A_{L} = \frac{\left( A - A_{0} \right)*20*50}{n*t} = \frac{\left( 9,9 - 4,6 \right)*20*50}{1*30} = 176,7\left\lbrack \frac{U}{\text{ml}} \right\rbrack$$

• Tabela 1. Wyniki pomiarów i obliczeń.

Substrat	Pr kontrolna [ml]	V30’ [ml]	V60’ [ml]	∆ V30’ [ml]	∆V60’ [ml]	AL30’ [U/mlroztworu kreonu]	AL60’ [U/mlroztworu kreonu]
Olej kukurydziany	5,5	9,1	12,05	3,6	6,55	120	109,2
Olej ryżowy	5,3	10,4	10,9	5,1	5,6	170	93,3
Olej słonecznikowy	5,5	7,5	11	2	5,5	66,7	91,7
Olej z pestek winogron	4,6	9,9	12,5	5,3	7,9	176,7	131,7

Wykres zależności ∆V=f(t) dla oleju z pestek winogron.

• Wnioski:

Ilość zużytego NaOH na miareczkowanie jest proporcjonalna do powstałych w czasie enzymatycznej hydrolizy kwasów tłuszczowych. Po upływie 60 minut w każdej próbie znajdowało się więcej kwasów tłuszczowych niż po upływie 30 minut. Jednak obliczona aktywność lipazy jest mniejsza po upływie 60 minut niż po upływie 30 minut (wyjątek stanowi tutaj olej słonecznikowy- aktywność lipazy po upływie 60 minut jest większa niż aktywność lipazy po upływie 30 minut). Po 60 minutach nie wytworzyło się dwa razy więcej produktu niż po upływie 30 minut. Jest to spowodowane grupowaniem się produktów- kwasów tłuszczowych na powierzchni faz, przez co tworzą barierę pomiędzy substratem a lipazą. Dodatkowo obniżają pH roztworu, co obniża aktywność lipazy. Najbardziej podatnym na hydrolizę enzymatyczną jest olej z pestek winogron, a najmniej olej słonecznikowy.

1. Oznaczanie w preparacie z tabletki Kreon enzymów- α-amylazy i proteinazy:

1. Oznaczanie α-amylazy:

• Sposób wykonania doświadczenia:

Do dwóch próbówek wprowadziliśmy po 5 ml 1% skrobi. Do pierwszej dodaliśmy kilka kropel przygotowanego wcześniej preparatu enzymatycznego (próba właściwa), o drugiej dodaliśmy kilka kropel wody destylowanej (próba kontrolna). Próbówki pozostawiliśmy w temperaturze pokojowej na 30 min. Po upływie wyznaczonego czasu dodaliśmy do próbówek po kilka kropel J₂ w KJ.

• Obserwacje:

W próbówce z preparatem enzymatycznym nastąpiło całkowite odbarwienie, próba kontrolna zabarwiła się na granatowo.

• Wnioski:

Odbarwienie próby właściwej świadczy o obecności α- amylazy w preparacie Kreon. Α- amylaza niszczy strukturę heliakalną skrobi, przez co pozostałe w wyniku hydrolizy dekstryny nie barwią się na niebiesko w obecności jodu.

1. Oznaczanie proteinazy

• Sposób wykonania doświadczenia:

Do dwóch próbówek wprowadziliśmy po 2 ml 2% kazeiny mleka. Do pierwszej próbówki (próby właściwej) dodaliśmy 1 ml preparatu enzymatycznego, do drugiej (próby kontrolnej) 1 ml wody. Obie próby pozostawiliśmy w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po tym czasie dodaliśmy do obu próbówek 4ml 5% TCA.

• Obserwacje:

W obu próbówkach wytrącił się biały osad, jednak w próbówce zawierającej enzym wytrącił się on w dużo mniejszym stopniu.

• Wnioski:

Po dodaniu TCA zaszła denaturacja białek. W próbie z enzymem białka zostały w większości zhydrolizowane, przez co denaturacja po dodaniu TCA nie była tak widoczna. Świadczy to o obecności proteinazy w tabletce Kreon.