METODY UNASIENIANIA SAMIC ZWIERZĄT DOMOWYCH

Inseminacja (sztuczne unasienianie) - zapładnianie zwierząt hodowlanych przez wprowadzenie uprzednio pobranego nasienia samca do dróg rodnych samicy; pozwala wykorzystać na dużą skalę spermę najwartościowszych samców.

Proces sztucznego unasieniania składa się z następujących etapów:
1. pobieranie nasienia
2. badanie nasienia
3. rozrzedzanie i konfekcjonowanie nasienia
4. przechowywanie nasienia
5. rozprowadzenie nasienia do punktów inseminacyjnych
6. unasienianie samic

Do zalet sztucznego unasieniania zaliczyć należy:

· możliwość unasienienia nasieniem pobranym od samca znacznie większej liczby samic
· większa ilość uzyskiwanego potomstwa
· dokładniejsza ocena wartości hodowlanej ojców
· możliwość wykorzystania nasienia samca nawet po jego śmierci
· unikanie chorób związanych z naturalnym kryciem
· możliwość transportu nasienia na duże odległości
· niższe koszty zakupu nasienia niż samego samca
· unasienienie samicy nasieniem tego samca, który odmawia skoku na daną samicę
· szybkie i łatwe uzyskiwanie postępu hodowlanego nie tylko w oborach elitarnych, ale także w pogłowiu masowym dzięki temu, że od jednego samca przygotowuje się w roku kilkadziesiąt tysięcy dawek inseminacyjnych i tyle też samic można nimi unasienić

· możliwość korzystania z nasienia samców o najwyższym potencjale genetycznym i produkcyjnym bez względu na to, w jakim kraju czy na jakim kontynencie one żyją
· możliwość realizowania przez hodowcę różnych koncepcji hodowlanych lub produkcyjnych (np. podnoszenie ilości mleka i poprawianie jego składu, produkcja określonego typu materiału rzeźnego) poprzez dobór buhajów o odpowiednich parametrach wyceny
· pewność, że nasienie użyte do inseminacji pochodzi od samców zdrowych, pozostających pod stałym nadzorem lekarsko-weterynaryjnym, a zabieg unasieniania jest wykonywany w sposób perfekcyjny, nie zagrażający zainfekowaniem samicy
· oszczędność sił i czasu hodowcy-właściciela samicy, ze względu na to, że to inseminator dojeżdża do jego zagrody i na miejscu, w oborze, wykonuje zabieg unasieniania.

Podstawa skuteczności unasieniania:

1. Ginekologicznie zdrowa samica;

2. Nasienie odpowiedniej wartości biologicznej;

3. Odpowiedni moment wprowadzenia nasienia do dróg rodnych

BYDŁO

• Inseminacja bydła ma w Polsce już ponad 50-letnią tradycję i dziś trudno wyobrazić sobie hodowcę, który byłby skłonny zrezygnować z usług inseminatora.

• Zasięg i znaczenie inseminacji szczególnie wzrosły z chwilą wprowadzenia do praktyki metody przechowywania nasienia w temperaturze -196*C. Czas i odległość dzielące kojarzonych ze sobą partnerów przestały odgrywać jakąkolwiek rolę.

• Inseminator dysponuje nasieniem różnych buhajów ras mlecznych oraz mięsnych zapewniając możliwość doboru buhaja do indywidualnych kojarzeń.

• Polskie firmy inseminacyjne proponują do wyboru wysokiej jakości nasienie buhajów, oferowane w katalogach buhajów, które są wydawane dwa razy w roku po każdej wycenie szacowanej wartości hodowlanej buhajów.

Wybór optymalnego czasu inseminacji

Ruja u krowy trwa 6-36h, średnio 24h.

Owulacja bez względu na czas trwania rui około 3Oh od początkowych objawów rui. Z tego względu owulacja raz będzie pod koniec rui, innym razem nawet kilkanaście godzin po zakończeniu zewnętrznych objawów rui.

Unasienianie wykonujemy na 15-18h od początku rui. Praktycznie unasienia się samicę wieczorem, jeżeli pierwsze objawy rui zaobserwowano rano (tego samego dnia) lub unasieniamy rano następnego dnia, jeżeli

pierwsze objawy rui pojawiają się wieczorem (dnia poprzedniego). Reinseminacja powinna odbywać się 12h od inseminacji.

Wykrywanie rui: najbardziej dokładna metoda to 4x w ciągu doby obserwacja zwierzęcia.

(mało przydatna przy cichej rui).

Pedometry - urządzenia rejestrujące zwiększoną ruchliwość krowy charakterystyczną dla rui,

skuteczność ok. 80%.

KAMAR - urządzenie znaczące, umieszczane na grzbiecie krowy. W przypadku obskakiwania takiej krowy kapsułka z farbą ulega przerwaniu i zostawia czerwony znak na grzbiecie. Skuteczność ponad 90%.

Użycie „próbnika" - buhaja z operacyjnie przemieszczonym prąciem bądź krowy, jałówki

poddanej hormonalnej terapii testosteronem lub estrogenem. Może to by także krowa z cystowatością jajników. W ten sposób zauważamy krowy z odruchem tolerancji

Pomiar oporności śluzu pochwowego - u zwierzęcia znajdującego się poza rują poziom oporności śluzu jest wysoki, w miarę zbliżania się rui oporność spada aby w szczytowej fazie rui osiągnąć wartość minimalną 200 i mniej jednostek. Należy uchwycić minimum, a

następnie moment wyraźnego wzrostu. Wzrost oznacza że owulacja powinna nastąpić w czasie od kilku do kilkunastu godzin - najlepszy czas do inseminacji.

Test arboryzacji ze śluzem szyjkowym - za podstawę tej metody przyjęto zwiększenie ilości NaCl i mukoproteidów w śluzie szyjkowym w okresie działania estrogenów. NaCl wykrystalizowuje w rozmazie w postaci liści paproci.

Tresowane psy - psy uczą się rozpoznawać i sygnalizować zapach charakterystyczny dla feromonów rujowych (dokładność tej próby wynosi 80-87%).

Przygotowanie nasienia do inseminacji bydła

Nasienie mrożone w kulkach - po uprzednim upewnieniu się, że krowę można unasieniać, do termostatu wkładamy ampułkę z płynem fizjologicznym o objętości l ml (szeroka szyjka ampułki) i następnie wyjmujemy 1 lub 2 kulki nasienia i umieszczamy w otwartej fiolce z płynem fizjologicznym, utrzymujemy w termostacie w temp. 38 - 39 C przez 30 - 40min. W tym czasie kulki ulegają rozpuszczeniu i ogrzaniu do w/w temperatury. Tak przygotowane nasienie nabieramy do pipety inseminacyjnej i wprowadzamy do szyjki macicy, po uprzednim sprawdzeniu jej drożności.

Trzeba mieć wprawę aby prawidłowo zaaspirować nasienie do pipety. Nie może być pęcherzyków powietrza, a słupek nasienia powinien znajdować się ok. 1 cm od końca pipety.

Nasienie mrożone w słomkach - rozmrażamy nasienie w łaźni wodnej w temperaturze 37-38 C przez 15-30 min. Wyjmujemy z łaźni, osuszamy ligniną, obcinamy zatopiony koniec słomki a następnie umieszczamy ją w tzw. pistolecie inseminacyjnym. Dalsze postępowanie jest analogiczne jak przy nasieniu mrożonym w kulkach.

Sposoby unasieniania

Metoda oburęczna duńska - środkiem dezynfekcyjnym

(np. nadmanganianem potasu) obmywamy zewnętrzne narządy rozrodcze. Lewą rękę w rękawicy do badania rektalnego wprowadzamy do prostnicy i chwytamy za szyjkę macicy. Prawą ręką wprowadzamy do pochwy pipetę lub pistolet inseminacyjny i dochodzimy do szyjki macicy. Następnie odpowiednio manipulując prawą ręką i podciągając szyjkę ku przodowi ręką lewą wprowadzamy przyrząd inseminacyjny do kanału szyjki i deponujemy nasienie. Przy pewnej wprawie i częściowo otwartej szyjce macicy wejście do kanału szyjki nie nastręcza

większych problemów.

KLACZE

Wybór optymalnego czasu inseminacji

Trzeba uwzględnić dwa warianty:

1. nie musimy liczyć się z ilością nasienia

2. mamy tylko jedną lub dwie porcje nasienia wybitnego ogiera

Klacze unasieniamy świeżym, rozrzedzonym lub mrożonym nasieniem.

Ruja u klaczy trwa od 3 do 12 dni.

Idealnie było by, aby trafić z inseminacją na 12 godzin przed owulacją. Owulacja u klaczy występuje zazwyczaj na 24-48 godzin przed końcem rui, stąd inseminację u klaczy które mają krótką ruję przeprowadza się już w pierwszym dniu trwającej rui.

Lepiej unasiennić nawet 4 dni za wcześnie niż 1 dzień po owulacji.

Kontrola owulacji:

• kliniczna ocena wielkości i napięcia ścian pęcherzyka jajnikowego (F0-F4)

• ocena wielkości pęcherzyka przy użyciu USG

Inseminacja nasieniem mrożonym jest najbardziej skuteczna na 6 godz. przed owulacją. W przypadku inseminacji po owulacji wzrasta odsetek zamierających zarodków nawet do 34% (prawidłowo wynosi ok. 14%).

Najpóźniej do zapłodnienia (nie mylić z zaplemnieniem) powinno dojść do 30 godzin od owulacji. Późniejsze zapłodnienie to wysoki wzrost śmiertelności zarodków. Jeżeli do owulacji dojdzie dopiero po upływie 12-18 godzin od chwili inseminacji (kontrola USG) powinno się powtórzyć inseminację. Optymalny wynik zaźrebień uzyskujemy jeżeli unasieniamy 12 godz. przed i 6godz. po owulacji.

Nasienie mrożone jest zazwyczaj konfekcjonowane w aluminiowych pojemnikach (20-50 ml oraz minimalnie 300mln. plemników w dawce inseminacyjnej) lub słomkach (słomki duże 4,5 ml. 120-150 mln plemników/1 ml lub słomki małe 0,5-l ml koncentracja lOO mln/l ml) stosując małe słomki należy użyć nawet ok. 8 słomek do jednorazowego unasieniania.

Rozmrażanie w temp. 37°C przez 30 min (słomki małe) lub 40°C przez l min (słomki duże).

Należy wspomnieć, że nasienie tylko ok. 25% ogierów nadaje się do mrożenia i późniejszej inseminacji.

Wyróżniamy dwie metody unasieniania klaczy:

• metoda ręczna;

• metoda z użyciem wziernika.

Po odpowiednim przygotowaniu nasienia wylewamy nasienie ze słomek na podgrzaną płytkę Petriego i nabieramy do pipety inseminacyjnej przy pomocy strzykawki. Po naciągnięciu, wprowadzamy ejakulat do kanału szyjki macicy jedną z w/w metod. Podczas wykonywania zabiegu należy zwrócić szczególną uwagę na aseptykę, ze względu na

możliwość wtórnego zakażenia macicy.

Inseminacja klaczy w porównaniu z kryciem naturalnym umożliwia unasiennienie grzejącej się samicy w różnych miejscach i o różnym czasie, bez konieczności doprowadzania do ogiera oraz zapobiega infekcjom takimi chorobami jak: zaraza stadnicza, otręt, zakaźne

zapalenie macicy i inne zakażenia niespecyficzne.

TRZODA CHLEWNA

Wybór optymalnego czasu inseminacji

Metody wykrywania rui:

• najpewniejsza metoda to obserwacja zachowania lochy w obecności knura

• próba dosiadania wraz z obserwacją sromu (świnia pozostaje w bezruchu oraz występuje obrzęk i zaczerwienienie sromu).

• Metody pomocnicze to głos knura nagrany na taśmie magnetofonowej lub pomiar oporności śluzu.

• Ruja u świń zazwyczaj trwa 48-72 godz.

• Owulacja w normalnych warunkach występuje średnio w 43 godz. od początku rui (36-55 godz). Podczas owulacji dochodzi do pękania wielu pęcherzyków jajnikowych. Czas w którym pękają wszystkie pęcherzyki od pierwszego do ostatniego wynosi 1,8 godz. i nie jest zależny od ilości pęcherzyków.

Przy użyciu nasienia mrożonego zaleca się unasieniać loszki 16-20 godz. od rozpoczęcia rui, natomiast lochy 22-26 godz. Reinseminacja po 12 godz.

Jedna dawka do unasieniania nasieniem mrożonym powinna zawierać ok. 2-3 miliardów plemników ruchliwych, ponieważ do 40% plemników traci ruch po zamrożeniu. Wyniki unasieniania nasieniem mrożonym są niższe o ok. 20-30% w porównaniu z nasieniem świeżym. W Polsce używamy nasienia w stanie płynnym, schłodzone do 10-16°C w ilości 100 ml, dawka zawiera ok. 3xl0⁹ plemników.

Metoda unasieniania:

• gotowe nasienie w pojemniku plastikowym (różny kształt) podłączamy do kateteru inseminacyjnego, umieszczonego uprzednio w drogach rodnych samicy (przez odpowiednie przekręcanie kateterem w lewą stronę).

OWCE i KOZY

Ruja u owiec trwa 3-84 godz (zwykle 24-36 godz), natomiast u kóz 36 godz (±8,l godz).

Owulacja natomiast występuje na 20-40 godz u owiec (średnio 24-27godz.) od początkowych objawów rui, u kóz 30-36 godz od rozpoczęcia zewnętrznych objawów rui.

Wykrywanie rui - obserwacja samic, zauważenie zewnętrznych objawów tzn. przekrwienie i nieznaczny obrzęk sromu (czasami niezauważalne). Bardziej charakterystyczne jest zachowanie się maciorki w obecności tryka lub próbnika - odruch tolerancji, które rozpoznają bezbłędnie nawet samice bez widocznych objawów (cicha ruja) bardzo często występującej zarówno u owiec jak i kóz.

Przygotowanie nasienia do inseminacji

W Polsce dostępne jest nasienie tryka przechowywane:

• w stanie płynnym, odpowiednio rozrzedzone i schłodzone do temperatury 0-5°C lub 10-15°C.

• w stanie zamrożenia w postaci kulek, słomek i ampułek podobnie jak u buhaja. Przed mrożeniem nasienie tryka rozrzedza się obecnie w 32 różnych rozrzedzalnikach, co zmniejsza zamieralność plemników podczas mrożenia.

Przygotowanie nasienia do inseminacji podobnie jak u buhaja.

Metody unasieniania

Optymalny czas inseminacji lub krycia maciorek to 12-24 godz od pierwszych objawów rujowych.

Nasienie można deponować do różnych części narządu rodnego, stąd wyróżniamy trzy metody unasieniania:

• unasienianie doszyjkowe;

• unasienianie dopochwowe;

• unasienianie domaciczne.

Unasienianie doszyjkowe - najczęściej stosowane; po unieruchomieniu maciorki w specjalnym stanowisku lub jej przytrzymaniu przez pomocników wprowadzamy do pochwy rozwieracz, co przy użyciu źródła światła uwidacznia zewnętrzne ujście szyjki macicy. Następnie pipetę inseminacyjną wprowadzamy do kanału szyjki na 0,5-l cm i wstrzykujemy nasienie.

Unasienianie dopochwowe - stosuje się zazwyczaj u dziewiczych owiec, u których wprowadzenie wziernika jest utrudnione. Pipetę inseminacyjną wprowadzamy po górnym sklepieniu pochwy do oporu i deponujemy nasienie.

Unasienianie domaciczne - rzadziej wykonywane ze względu na swoją inwazyjność. Możliwe jest wprowadzenie nasienia do macicy dwiema drogami: przez szyjkę macicy (używając wziernika i kleszczy do przytrzymania szyjki, w ówczas długą igłą umieszczoną na pipecie przechodzimy przez szyjkę i wprowadzamy nasienie do macicy) oraz bezpośrednio do macicy (rogu lub trzonu) po uprzedniej laparotomii lub przy zastosowaniu laparoskopi.

Porównanie wyników płodności maciorek w zależności od miejsca deponowania nasienia przechowywanego w ciekłym azocie.

Metoda unasieniania	Objętość dawki	Liczba maciorek	Maciorki kotne W%
Doszyjkowo	0,1 0,6	48 45	19 42
Dopochwowo	0,1 0,6	47 46	17 17
Domacicznie	0,1 0,6	45 48	56 65

Inseminacja u owiec daje słabsze wyniki (nawet do 17%) niż krycie naturalne.

PSY

Wybór optymalnego czasu krycia

• rozmazy pochwowe

• pomiar poziomu hormonów: progesteronu (wzrost do 1-3 ng/ml przypada na okres przedowulacyjnego wylewu LH) w czasie owulacji 2-8 ng/ml w czasie 10-30 dni po owulacji jest najwyższy poziom 15-80 ng/ml, natomiast w anoestrus 0,2-0,5 ng/ml. Owulacja następuje 24-72godz. (36-50) po wylewie LH. Wartość tego hormonu w okresie szczytu przedowulacyjnego wynosi 8-50 ng/ml (śr.20) i szczyt ten trwa 24-72godz.

• obserwacja zachowania się suki - tolerancja na samca

• zmniejszenie się obrzęku sromu i brak krwawienia charakterystycznego dla okresu przedrujowego

• mierzenie oporności śluzu - aparat Dramińskiego

• test Arboryzacji ze śluzem szyjkowym

W odróżnieniu od innych gatunków zwierząt pęcherzyki jajnikowe w momęcie owulacji są w stadium dalece zaawansowanego procesu luteinizacji tak, że można je uznać za gwałtownie rozwijające się ciałka żółte. Oocyty podczas owulacji są niedojrzałe. Dojrzewanie zachodzi w ciągu 2 dni po owulacji, oocyty zdolne są do zapłodnienia po okresie ok. 60 godz po owulacji i 80-180godz po piku LH. Owulacja następuje gdy oocyt jest w stadium pęcherzyka zarodkowego przed wyrzuceniem pierwszego ciałka kierunkowego czyli przed ukończeniem pierwszego podziału mejotycznego, który następuje najczęściej dopiero po 48 godz. Drugi podział redukcyjny - po wniknięciu plemnika. Oocyt zachowuje zdolność do zapłodnienia przez ok. 5 dni (nawet do lOdni). Plemniki po kopulacji są ruchliwe w jajowodach i macicy jeszcze przez ok. 11 dni (268 godz), ale zdolność do zapłodnienia zachowują przez średnio 2-3 dni (do 6-7 dni). Dwukrotne krycie lub unasienianie od pierwszego dnia przed owulacyjnym wylewem LH (dzień 0) aż do 5 lub 6 dnia po piku LH zapewnia optymalne wyniki zapłodnień.

Przygotowanie nasienia do inseminacji

Nasienie psów może być użytkowane w trzech postaciach:

• nasienie świeże rozrzedzone lub nierozrzedzone; używane jest najczęściej gdy niemożliwe jest pokrycie suki (suka agresywna, pies niechętny do krycia itd.); rozrzedzenie zapewnia lepszą płodność; rozrzedza się 1:3 do 1:8 w zależności od koncentracji; dawka inseminacyjna 2-10ml w tym 100-15Omln plemników w l ml;

• nasienie schłodzone w łaźni wodnej do 5-10°C, może być użyte do inseminacji przez ok. 2l godz lub schłodzone do 4°C może być użyte przez 4-5 dni;

• nasienie mrożone - stosunkowo niska płodność w stosunku do nasienia płynnego; do konserwacji nasienia psa przez mrożenie używa się najczęściej rozcięczalnika

Tris-fruktozo-cytrynianowwgo z glicerolem i żółtkiem jaja kurzego.

Procedura zamrażania jest następująca:

Rozrzedzone nasienie w/w rozcieńczalnikiem bez glicerolu w stosunku 1:2; 1:5 ochładza się z 32° do 4°C w ciągu 30 min. Następnie dodaje się glicerol obecny w drugiej części rozrzedzalnika i poddaje ekwilibracji w ciągu 2 godz w 4°C. Napełnia się słomki o pojemności 0,5 ml i zamraża w parach ciekłego azotu - 9min, a następnie przechowuje w ciekłym azocie w temp. 196°C.

Mrożenie w kulkach - na płytkach suchego lodu, a następnie umieszcza się w ciekłym azocie.

Proces rozmrażania

Istnieją różne sposoby rozmrażania w zależności od zastosowanej metody mrożenia.

W przypadku konserwacji w kulkach najlepsze wyniki daje szybkie rozmrażanie w 2,5 ml płynu fizjologicznego o temperaturze 37°C. Dobre wyniki daje również stosowanie 2,9% cytrynianu sodu o temperaturze 37°C. Niektórzy sugerują rozmrażanie kulek w ilości zapewniającej uzyskanie dawki inseminacyjnej w 10 ml płynu fizjologicznego o temperaturze 65°C.

W konserwacji za pomocą metody słomkowej z użyciem rozrzedzalnika opartego na buforze Tris stosowane są dwie metody:

• gwałtowne ogrzewanie słomek w łaźni wodnej o temperaturze 70°C przez 6 sekund bez potrzeby dodatkowych rozcieńczeń;

• ogrzewanie w łaźni wodnej o temperaturze 35°C przez 30-45 sekund

Najlepsze wyniki i najdłużej utrzymujące się duże wartości plemników o ruchu prawidłowym po rozmrożeniu w odniesieniu do rozrzedzalnika Tris zaobserwowano przy użyciu dodatku „ORVUS pastę", jak również przy umiarkowanym tempie schładzania i mrożenia nasienia w zakresie temperatury +5 do -100°C według programu: -5°C/min od -15°C, -20°C/min od -15 do 100°C

Technika unasienniania

W praktyce powszechnie są przyjęte dwie techniki unasienniania suk. Jest to unasiennianie dopochwowe i unasiennianie domaciczne.

Unasiennianie dopochwowe - Stosowanie unasienniania dopochwowego daje dobre wyniki jedynie w przypadku nasienia świeżego. Przed zabiegiem wystarczające jest wykonanie badania cytologicznego wymazu pochwowego i endoskopowego pochwy, aby określić odpowiedni moment inseminacji. Cały proces rozpoczyna się od pobrania nasienia. Kiedy jest już ono pobrane, powinno zostać w jak najkrótszym czasie zdeponowane w pochwie samicy, tj. w ciągu 5 minut po jego pozyskaniu. Przygotowana suka musi być w odpowiedniej fazie cyklu jajnikowego, ponieważ jest to główny czynnik powodzenia unasienniania.

Technika inseminacji nie wymaga żadnego specjalnego wyposażenia. Jedyny przyrząd, jaki jest konieczny, to sztywny kateter z tworzywa sztucznego długości dochodzącej do około 30 cm. Powinien on zostać połączony z plastikową strzykawką za pomocą również jałowego łącznika wykonanego z materiału nietoksycznego dla plemników.

Unasiennianie domaciczne - metody inseminacji domacicznej możemy podzielić na dwie grupy:

• niechirurgiczne;

• chirurgiczne.

Do pierwszej grupy zaliczamy:

• metodę wykorzystującą kateter norweski;

• metodę przy użyciu kateteru Foleya;

• metody endoskopowe.

Do grupy drugiej zaś należą:

• inseminacja chirurgiczna

• metoda laparoskopowa

Metody niechirurgiczne

Polegają one na wykorzystaniu technik kateteryzacji, które ułatwiają dostanie się nasienia do macicy. Anatomia dróg rodnych suki utrudnia kateteryzację zwykłym sprzętem. Spowodowane jest to niewielkim ujściem zewnętrznym szyjki umieszczonym pod kątem w stosunku do osi długiej pochwy, wąską okolicą szyjki oraz długą pochwą (od 10 do 29 cm).