Genetyka kliniczna:
Diagnostyka zaburzeń chromosomowych i chorób wieloczynnikowych oraz diagnostyka prenatalna i poradnictwo genetyczne chorób chromosomowych.
Diagnostyka zaburzeń chromosomowych: badania prenatalne (amniocenteza, biopsja kosmówki, poziom AFP w surowicy matki, USG). Diagnostyka zespołu Downa – test potrójny: AFP ↓, uE3 (nieskoniungowany estriol) ↓, βHCG ↑ (przy zespole Edwardsa ↓). Oznaczanie kariotypu: określenie liczny i struktury chromosomów w komórkach osoby badanej, analiza chromosomów dzielącej się mitotycznie komórki somatycznej, rutynowo w limfocytach krwi obwodowej, rzadziej w fibroblastach skóry lub komórkach innych tkanek, w diagnostyce prenatalnej kariotyp określany jest w komórkach płynu owodniowego lub w komórkach trofoblastu. HRT – metoda uzyskiwania chromosomów o zwiększonej rozdzielczości obrazu prążkowego (więcej komórek w stadium metafazy mitozy w hodowli). Hybrydyzacja in situ FISH pozwala na wykrycie DNA w próbkach preparatów histologicznych, z zastosowanie specjalnych sond molekularnych rozpoznających określone regiony chromosomów w preparacie cytologicznym (połączenie metody cytogenetycznej i molekularnej). Umożliwia identyfikację różnej wielkości regionów lub całych chromosomów dzięki powstawaniu w odpowiednich warunkach kompleksów DNA chromosomowego ze specyficzną sondą molekularną. Analiza cytometryczna polega na ocenie zawartości DNA lub stosunku par zasad AT/GC w poszczególnych chromosomach. Technika umożliwia sortowanie i identyfikację poszczególnych chromosomów. Oceny tej dokonuje się na podstawie pomiarów intensywności fluorescencji chromosomów metafazowych zabarwionych fluorochromem. Identyfikacja chromatyny płciowej: badanie ma obecnie bardzo ograniczoną wartość diagnostyczną, było stosowane dla określenia płci oraz diagnostyki aberracji liczbowych chromosomów X i Y. Diagnostyka chorób wieloczynnikowych: choroby wieloczynnikowe, czyli spowodowane interakcją czynników genetycznych (np. mutacje) i środowiskowych. Analiza sprzężeń; Badanie par rodzeństw; Analiza asocjacji; Analiza mutacji genów kandydujących. Wymienione metody pozwalają na identyfikację poszukiwanych regionów chromosomowych, które następnie mogą być badane za pomocą analizy mutacji w genach kandydujących usytuowanych w tych regionach u osób chorych. Badania mutacji wykonywane jest za pomocą sond np.: TaqMan, Simple Probe, SybrGreen, HybProbe lub za pomocą enzymów restrykcyjnych.
Diagnostyka prenatalna: obejmuje wszystkie techniki badawcze wykorzystywane w celu oceny rozwoju zarodka i płodu oraz służące rozpoznawaniu chorób. Techniki badań prenatalnych dzieli się na inwazyjne (amniocenteza, biopsja trofoblastu, kordocenteza, biopsja skóry płodu, biopsja wątroby płodu) i nieinwazyjne (USG, inne techniki obrazowania medycznego, badanie komórek płodu uzyskanych z krwi matki). Materiał do badań pobierany jest na drodze amniocentezy (pobranie próbki płynu owodniowego) wykonanie zabiegu: pomiędzy 16 a 18 tyg. ciąży (objętość płynu owodniowego wynosi ok. 180ml, a odsetek obecnych w nim żywych komórek jest najwyższy) lub amniocenteza wczesna: pomiędzy 12 a 15 tyg. ciąży, w warunkach pełnej aseptyki, uprzednie zlokalizowanie i umiejscowienie łożyska za pomocą USG, wprowadzenie igły do pęcherza owodniowego przez skórę i mięśnie ściany brzucha (wykonanie pod stałą kontrolą USG), pobranie 10-20ml płynu, który służy do wykonania wielu badań. Badania możliwe do wykonania z komórek i z supernatantu płynu owodniowego:1. określenie płci płodu 2. ocena kariotypu płodu 3. badanie stężeń enzymów w tkankach płodu 4. biochemia płynu owodniowego 5. analiza DNA płodu. Biochemia płynu owodniowego: 1. AFP – przy wadach cewy nerwowej, wzrost w surowicy matki, wcześniejszy poród. 2. 17 alfa hydroksyprogesteron zespół nadnerczowo-płciowy. 3. Glikozaminoglikan – wykluczenie niektórych postaci mukopolisacharydoz. Choroby, w których istnieją bezpośrednie wskazania do analizy DNA płodu: talasemia alfa, talasemia beta, mukowiscydoza, zespół łamliwego chromosomu X, hemofilia A, choroba Huntingtona, dystrofia mięśniowa Duchenne’a i Beckera, dystrofia miotoniczna, rdzeniowy zanik mięśni. DNA można wyizolować z płynu owodniowego po 3-4 tygodniach hodowli, natomiast rozpoznanie opiera się na bezpośrednim wykryciu mutacji genowych u płodu albo ustaleniu w wyniku analizy pośredniej potwierdzającej obecność defektywnego genu płodu. Metody pozyskiwania DNA płodu: biopsja trofoblastu (łatwe pozyskiwanie DNA z komórek kosmówki bez konieczności prowadzenia hodowli tkankowej, dokonuje się od 10-go tygodnia ciąży, pod kontrolą USG przez ścianę brzucha, pobranie dostarcza od 5-30 mg tkanki, którą można od razu wykorzystać do oznaczenia płci płodu i określenia jego kariotypu, a także do badań enzymatycznych i molekularnych). Kordocenteza – biopsja skóry lub wątroby płodu; pobranie próbki krwi płodu lub dokonania transfuzji dopłodowej pod kontrolą USG, można nakłuć żyłę pępowinową w okolicy ujścia łożyskowego, zabiegu dokonuje się przez powłoki brzuszne kobiety ciężarnej (od 18 tygodnia ciąży). Wskazania: zakażenia płodu, podejrzenie mozaikowatości, lecznicze transfuzje dopłodowe w przebiegu izoimmunizacji w obrębie erytrocytarego układu grupowego Rh, obrzęk płodu o nie wyjaśnionej przyczynie, niepowodzenia hodowli komórek płynu owodniowego lub późno zgłoszona chęć badania prenatalnego, potencjalnie uleczalne wady wrodzone, znaczny stopień opóźnienia rozwoju płodu, hemofilia A i B, talasemia beta, niedokrwistość sierpowato krwinkowa, zespoły złożonego niedoboru odporności. USG bezpieczne zarówno dla płodu i matki.
Poradnictwo genetyczne: udzielenie profesjonalnej porady oraz specjalistyczna pomoc całej rodzinie osoby z chorobą genetyczną bądź wrodzoną wadą rozwojową, lub parze planującej potomstwo. Przyczyny dla których zgłaszają się pacjenci o poradę genetyczną: częste poronienia samoistne, zaawansowany wiek matki (czyli ukończone 35 lat), urodzenie dziecka z chorobą genetyczna bądź wrodzoną wada rozwojową, występowanie w rodzinie chorób genetycznych bądź wrodzonych wad rozwojowych. pokrewieństwo rodziców, ekspozycja w ciąży na czynniki teratogenne (np.: leki, narkotyki, związki chemiczne, promieniowanie jonizujące), przed wykonaniem wspomaganego zapłodnienia i po wykonaniu wspomaganego zapłodnienia, wysoki poziom lęku u rodziców. Istotą poradnictwa genetycznego jest ustalenie bądź wykluczenie rozpoznania choroby dziedzicznej, określenie matematycznego prawdopodobieństwa wystąpienia choroby dziedzicznej, poinformowanie zainteresowanej rodziny probanta o mechanizmie dziedziczenia się choroby oraz o sposobach jej leczenia i profilaktyki. Porada genetyczna powinna w sposób przejrzysty dla zainteresowanych wyjaśniać mechanizm dziedziczenia oraz profilaktykę i leczenie choroby dziedzicznej, a nie obwiniać któregoś z rodziców. Powinna być udzielana w zrozumieniu dla światopoglądu i wyznania rodziców. Zawsze powinna zawierać element wsparcia psychologicznego. Decyzję o posiadaniu potomstwa zawsze pozostawia się rodzicom. Określenie matematycznego prawdopodobieństwa wystąpienia choroby dziedzicznej: przyjmuje się niskie prawdopodobieństwo dla wartości do 5%, umiarkowane dla wartości z przedziału od 5% do 10%,a wysokie dla wartości większych niż 10% Wyróżnia się 3 rodzaje prawdopodobieństwa:
a priori - czyli prawdopodobieństwo wystąpienia choroby dziedzicznej u potomstwa pary planującej dziecko.
a posteriori - czyli prawdopodobieństwo wystąpienia choroby dziedzicznej u potomstwa pary planującej dziecko, w sytuacji gdy z związku tej pary urodziło się już dziecko chore na daną chorobę dziedziczną.
ryzyko populacyjne - czyli prawdopodobieństwo wystąpienia danej choroby dziedzicznej, dla odpowiedniej populacji. Np.: ryzyko populacyjne urodzenia dziecka z aberracja chromosomową, dla populacji kobiet poniżej 35 roku życia wynosi około 0,6%
Zawsze dla porównania należy poinformować zainteresowanych o niespecyficznym ryzyku populacyjnym - czyli prawdopodobieństwu wystąpienia dowolnej choroby dziedzicznej lub wrodzonej wady rozwojowej, u dziecka zdrowych, młodych rodziców. Jest ono stałe dla danej populacji i nie zależy od wyników badań rodziców i dziecka. Dotyczy wszystkich ciężarnych poniżej 35 roku życia. Dla populacji Polaków wynosi około 3-4%. Oznacza to, że każda młoda para planująca potomstwo, obarczona jest prawdopodobieństwem urodzenia chorego dziecka, którego wartość mieści się w przedziale 3-4%.
Profilaktyka chorób genetycznych i wrodzonych wad rozwojowych: profilaktyka pierwotna - to wszystkie działania mające na celu niewystąpienie choroby dziedzicznej u potomstwa. Np.: zażywanie kwasu foliowego przez kobiety będące w 1 trymestrze ciąży i 3 miesiące przed zajściem w ciąże, co obniża prawdopodobieństwo wystąpienia wad cewy nerwowej u dziecka czy profilaktyczne szczepienie kobiet przeciwko różyczce, co obniża prawdopodobieństwo wystąpienia Zespołu Gregga u płodu. Stosowanie pomp insulinowych u kobiet chorych na cukrzycę planujących ciążę i będących w ciąży przyczyniło się w znacznym stopniu do redukcji ryzyka wystąpienia u noworodka objawów fetopatii cukrzycowej. Najlepszym przykładem profilaktyki pierwotnej jest terapia genowa, będąca wciąż jeszcze w fazie badań klinicznych. Polega ona w dużym przybliżeniu na wprowadzeniu w miejsce genu zmutowanego genu prawidłowego, przy pomocy nowoczesnych technologii inżynierii genetycznych, i uniknięcie rozwoju choroby; profilaktyka wtórna - to całość poradnictwa genetycznego i diagnostyka prenatalna.
Przygotowanie kariotypów do oceny i zasady ich opisu. Choroby związane z nie prawidłowościami chromosomów.
Kariotyp: zestaw chromosomów typowy dla każdego organizmu, ułożony według umownych zasad.
Badanie kariotypu: pobranie krwi obwodowej na heparynę, izolacja leukocytów/limfocytów, założenie hodowli komórkowej trwającej 72 godziny (zahamowanie dzielących się komórek na etapie metafazy, za pomocą specjalnych substancji chemicznych np. kolchicynę lub jej pochodne), przygotowanie preparatów chromosomowych, barwienie chromosomów techniką prążków G lub innych w zależności od potrzeby, ocena metafaz pod mikroskopem, ułożenie kariogramów. Pozwala ocenić liczbę, strukturę chromosomów, wielkość, przewężenia, prawidłowy rozdział i inne cechy budowy chromosomów.
Zasady zapisu kariotypu: Prawidłowy kariotyp żeński to 46,XX, kariotyp męski 46,XY. Wszelkie odchylenia od wyników prawidłowych zapisywane są przy użyciu szeregu skrótów np. t (translokacja), del (delecja), inv (inwersja). Przykładowo, 46,XX,t(2;10)(p21;q24) oznacza kobietę z translokacją zrównoważoną pomiędzy krótkim ramieniem chromosomu 2 (miejsce pęknięcia p21), a długim ramieniem chromosomu 10 (pęknięcie w miejscu q24). Dodatkowe chromosomy w kariotypie podaje się po znaku +, np. 47,XY,+21 oznacza osobnika płci męskiej z dodatkowym chromosomem 21.
Choroby związane z nieprawidłowymi chromosomami: trisomia 21 (zespół Downa); trisomia 18 (zespół Edwardsa); trisomia 13 (zespół Pataua); 47, XXY (zespół Klinefeltera); 47, XYY; 47, XXX; 45, X (zespół Turnera); triploidia; zespół Pradera-Williego (mikrodelecja długiego ramienia chromosomu 15 (15q11-q13) pochodzenia ojcowskiego); zespół Angelmana (delecja interstycjalna długiego ramienia chromosomu 15, pochodzenia matczynego); mężczyźni 46, XX.
Kultury in vitro w medycynie i farmacji.
Zastosowanie: w badaniach chromosomów (ocena kariotypu), hodowla wirusów do produkcji szczepionek, badania aktywności wewnątrzkomórkowej, badania wpływu leków na kinetykę wzrostu komórek, badania interakcji między komórkowych, produkcja leków i hormonów, badania nad karcinogenezą, ocena wrażliwości komórek i tkanek na leki, przeszczepy komórek autologicznych, komórek macierzystych, konstrukcje in vitro narządów zastępczych, klonowanie terapeutyczne.
Znaczenie badań genetycznych w diagnostyce nowotworów.
Około 30% nowotworów ma swoje podłoże genetyczne. U chorych badanie genetyczne wykonuje się w celu ustalenia bezpośredniej przyczyny zachorowania (poszukiwanie genu powodującego chorobę), aby podjąć najskuteczniejsze leczenie terapeutyczne. U osób zdrowych, u których w rodzinach odnotowano zachorowanie na nowotwór, badanie genetyczne ma na celu oszacowanie ryzyka zachorowania, a także wyodrębnienie grupy wysokiego ryzyka, aby podjąć odpowiednie działania profilaktyczne. Przykładam ważnego badania genetycznego w diagnostyce i profilaktyce nowotworów jest coraz popularniejsze badanie genu BRCA1. Prawidłowy gen jest genem supresorowym, zapobiegającym rozwojowi komórek nowotworowych. Mutacje genu (w populacji polskiej znaczenie mają 3 mutacje) wpływają na rozwój raka piersi i jajnika. Rozpoznanie zmutowanego genu u kobiet chorych pozwala na wdrożenie odpowiedniego leczenia (cisplatyna), a u kobiet zdrowych na zastosowanie odpowiedniej profilaktyki (profilaktyczna mastektomia i anestektomia, zakaz brania tabletek antykoncepcyjnych do 30 r. ż.).
Choroby nowotworowe związane z zaburzeniami genów o wysokiej i pośredniej penetracji.
Geny o wysokiej penetracji, czyli o wysokim ryzyku zachorowania: gen BRCA1 (rak piersi), gen APC (niektóre postaci raka jelita grubego), gen ATM (nowotwory towarzyszące chorobie ataksja-teleangiektazja), gen TP53 (nowotwory głowy i szyi).
Geny o niskiej penetracji, czyli o niskim ryzyku zachorowania: gen CHEK2, NOD2, NSB1 (rak piersi).