16.10.2000

BIOCHEMIA WYKŁAD III

Witam państwa na kolejnym wykładzie, dzisiaj dużo tematów do omówienia, wrócimy najpierw do onkogenów i antyonkogenów. Jak wspominałem ostatnio onkogeny są to wleczone jako bagaż z wirusami onkogennymi, wirusami RNA, które to geny nie są potrzebne dla cyklu życiowego wirusa, są to prawdopodobnie zawleczone z jakiś komórek zainfekowanych wcześniej przez wirusy onkogenne no i mogą być wraz z wirusem wbudowywane w genom gospodarza. Zainteresowanie nimi spowodowane jest tym faktem iż u zwierząt doświadczalnych infekcja takimi onkogennymi wirusami prowadzi do ostrej transformacji, stąd są zwane retrowirusami ostro transformującymi i powstają niektóre nowotwory, głównie są to mięsaki, czyli nowotwory złośliwe tkanek miękkich ale także białaczki i chłoniaki. Jak wcześniej wspominałem również w naszych komórkach występują odpowiedniki funkcjonalne wirusowych onkogenów, które noszą nazwę protoonkogenów i które są w przeciwieństwie do tych genów zarządzających metabolizmem komórki, czyli House Keeping Gens, odpowiadają za istotne dla komórki głównie procesy związane z transmisją sygnału, a więc kodują albo czynniki wzrostu albo kodują receptory dla czynników wzrostu. Następnie transformują sygnał dokonując transdukcji sygnału z receptora na efektory wewnątrzkomórkowe, czyli system białek wykazujący aktywności GTP-azowe, czyli zarówno białka z rodziny białek G jak i białka systemu RAS. Dalej kodują czynniki transkrypcyjne, czyli odpowiadają za przebieg ekspresji genów, mogą kodować enzymy z grupy kinaz, głownie te kinazy, które są sprzężone z receptorami, dzisiaj trochę więcej w dalszej części powiem. No i wreszcie kodują zarówno cykliny jak i kinazy cyklinozależne, które to niezbędne są dla prawidłowego przebiegu cyklu komórkowego. Jak wspominałem również poprzednim razem takie protoonkogeny w sytuacji gdy ulegną przemianie aktywującej stają się onkogenami i od ich mutacji i powstania nieprawidłowego allelu onkogennego powstaje transformacja nowotworowa komórki. I pokazane również ostatnim razem onkogeny wirusowe, które odpowiadają poszczególnym onkogenom komórkowym. Litania obejmuje kilkadziesiąt różnych onkogenów, które są najsilniej badane i najlepiej poznane. A więc kodujący łańcuch B PDGF-u, następnie kodujący białko RAS o czym dalej będzie mowa , ABL który koduje kinazę tyrozynoswoistą sprzężoną z receptorem i wreszcie mięsak kości – który w warunkach funkcjonalnych – protoonkogen - koduje pewne czynniki transkrypcyjne. I generalnie przypominam państwu ten sygnał, a więc albo jest to kodowana cząstka sygnałowa, która działa na receptor, albo receptor, albo wewnątrzkomórkowa część odpowiedzi, czyli białka G, system RAS ewentualnie czynniki transkrypcyjne. To wyjaśnia czemu mutacje w obrębie tych onkogenów mogą powodować transformację nowotworową komórki. Przyjrzyjmy się bliżej jednemu z onkogenów mianowicie onkogenowi RAS, który koduje grupę białek o aktywności GTP-azowej, czyli czerpiącej źródło natchnienia z hydrolizy GTP, nie tylko natchnienia, ale również energii, w przeciwieństwie do białek G, o których będziemy mówić w przypadku transmisji sygnału z receptorów hormonalnych. Białka systemu RAS są białkami monomerycznymi, a nie o budowie trimerów. Co się dzieje zanim białko systemu RAS zostanie zakotwiczone w błonie to w dalszej części dzisiejszego wykładu ponieważ to wiąże się z innym tematem mianowicie modyfikacjami posttranslacyjnymi białek. Białko RAS zakotwiczone w błonie, co już jest pewnym elementem jego aktywacji, dla systemu transmisji sygnału jeszcze jest białkiem nieaktywnym. W momencie pobudzenia receptora przez cząsteczkę sygnałową, którą może być np. czynnik wzrostu, dochodzi do aktywacji sprzężonej z receptorem kinazy tyrozynoswoistej, jak z samej nazwy wynika jest to enzym, który fosforyluje reszty tyrozyny, które dość obficie występują w tym receptorze. Aktywacja kinazy tyrozynoswoistej z jednej strony wywołuje zmiany w receptorze, taka autofosforylacja receptora z reguły prowadzi do jego inaktywacji, co jest formą obrony komórki przed nadmiarem sygnałów, czyli tak jakby sobie stopery do uszu włożyć. To zjawisko nosi nazwę w biologii, w biochemii zjawiska Down Regulation, czyli regulacji w dół, znane powszechnie z działania hormonów, które również mogą chować swoje receptory do wnętrza komórki. Ale fosforylacja przy okazji aktywacji kinazy tyrozynoswoistej dotyczy również białka G i powstaje aktywne białko RAS, które wymieniło posiadane GDP na GTP. No i następnie aktywne białko RAS z przyłączoną aktywnością GTP doprowadza do aktywacji kaskady enzymów fosforylujących, nosi to nazwę kaskady kinaz. Kaskada kinaz będzie wielokrotnie się pojawiała głównie w przekaźnictwie hormonalnym, w przekaźnictwie w zakresie czynników wzrostu. No i kolejne kinazy w wyniku fosforylacji uzyskują aktywność, doprowadzają do fosforylacji zarówno białek enzymatycznych jak i białek nieenzymatycznych. Z tego wynika wniosek, że aktywacja białka RAS może doprowadzić zarówno do ekspresji genów, zmiany ekspresji genów jak i jedne geny mogą ulegać ekspresji, innych aktywność ekspresyjna jest hamowana i wreszcie dochodzi w wyniku zmian posttranslacyjnych w aktywności białek, część białek w wyniku fosforylacji aktywność uzyskuje, a część tą aktywność traci. Tak się dzieje w warunkach prawidłowych, a co się dzieje jeśli dojdzie do mutacji w genie RAS? Konsekwencją tego może być powstanie aktywnego białka RAS bez względu na sygnał płynący z komórki, czyli białko RAS staje się białkiem w sensie funkcjonalnym autonomiczne. Bez względu na to czy czynnik wzrostu podpowiada komórce, że zaktywowała procesy związane z białkiem RAS, aktywacja tego następuje w sposób permanentny. Z czasem doprowadza to do dysregulacji w metabolizmie komórki, do jej proliferacji i może doprowadzić do transformacji nowotworowej. Podobnie dzieje się w przypadku białek, które kodują czynniki wzrostu lub receptory dla czynników wzrostu i wtedy taki gen kodujący receptor dla czynnika wzrostu w przypadku mutacji receptor zachowuje się tak jakby był pobudzany choć sygnał z zewnątrz wcale nie płynął. Ten przykład chyba wystarczająco wyjaśnia czemu akurat to są istotne dla pobudzenia transformacji nowotworowej komórki zmiany. Wskutek aktywacji onkogenów może dochodzić zarówno do zmian ilościowych jak i do zmian jakościowych w komórce. Zmiany ilościowe dotyczą głównie zmian w zakresie kodowanych czynników wzrostu ewentualnie kodowanych receptorów, to może być zarówno wzrost ilości kodowanych cząstek jak i ich zmniejszenie. Natomiast zmiany jakościowe prowadzą jak w przypadku wspomnianego już zmutowanego białka RAS do tego iż bez stymulacji z zewnątrz odpowiada ono na domniemane bodźce. Warto w tym miejscu zapamiętać, że mutacje zachodzące w obrębie genów należących do grupy protoonkogenów przez co stają się one onkogenami dotyczą jednego allelu gdy taka mutacja ma charakter dominujący, w przeciwieństwie do antyonkogenów o których będzie mowa dalej, gdzie potrzebny jest defekt występujący w obydwu genach. Nie należy z tego rozumieć, że wystarczy jedna mutacja i jeden defekt w obrębie któregoś z protoonkogenów aby nastąpiła transformacja nowotworowa komórki, tj. powstanie pewnej predyspozycji, na którą nakładają się zarówno uwarunkowania genetyczne jak i uwarunkowania środowiska. W jaki sposób geny z grupy protoonkogenów mogą ulegać aktywacji? No, pierwszym ze sposobów jest np. amplifikacja, ona jest wykazana w przypadku dwóch takich onkogenów biorących udział w powstawaniu raka sutka, ale znacznie lepiej jest ona poznana w przypadku nowotworu występującego u zwierząt mianowicie mięsaka Rusa kodowanego przez gen SRC. W przypadku zgromadzenia się więcej niż jednej kopii tego genu występuje tzw. efekt dawki genu, który w konsekwencji może doprowadzić do transformacji nowotworowej komórek i rozwoju mięsaka u gryzoni. Następna grupa sposobów aktywacji onkogenów to są mutacje punktowe. To jest wykazane w przypadku takiego onkogenu HRAS, który koduje odpowiednie białko HRAS z tej grupy białek GTP-azowych i tego typu mutacje wykrywa się u chorych z rakiem jelita grubego, płuca, sutka, pęcherza, nie należy rozumieć, że jest jeden typ mutacji we wszystkich tych nowotworach. Cała trudność badania aktywowanych protoonkogenów wiąże się z tym, że u poszczególnych chorych poza nowotworami uwarunkowanymi genetycznie, dziedzicznymi nowotworami, mutacje mogą dotyczyć różnych miejsc, dlatego nie należy o tym myśleć w jednym konkretnym miejscu mutacji. Dalej może nastąpić translokacja części chromosomu z wytworzeniem nowego genu o właściwościach onkogennych. Najlepiej jest to poznane w przypadku chromosomu Philadelphia, tak to się oznacza (Ph` t (9:22) ),to jest chromosom powstały w wyniku translokacji 9-22, następuje urwanie kawałka chromosomu 9, w tym miejscu znajduje się gen ABL i następuje przeniesienie tego kawałka chromosomu 9 na chromosom 22. Tego typu powstanie takiej aberracji chromosomalnej występuje w mniej więcej w 85 do 95% pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową. I poszukiwanie chromosomu Philadelphia jest jedną z podstawowych metod diagnostycznych z zakresu biologii molekularnej i genetyki u chorych z przewlekłą białaczką szpikową. Dalej w wyniku zmian w zakresie chromosomów np. translokacji, może dojść do przesunięcia fragmentu chromosomu w miejsce tzw. aktywnej chromatyny, co prowadzi do ekspresji pewnych genów. Najlepiej jest to poznane w przypadku chłoniaka Burkitta, nowotworu układu chłonnego występującego u dzieci w Afryce Równikowej. W tym przypadku translokacja części chromosomu prowadzi do odblokowania syntezy immunoglobulin. Przypominam państwu, że wśród czynników etiologicznych powstawania chłoniaka Burkitta dopatruje się udziału wirusa z grupy DNA, mianowicie wirusa Ebstaina-Barra.

Teraz przechodzimy do kolejnej grupy genów związanych z transformacją nowotworową, grupy mianowicie antyonkogenów zwanych także genami supresorowymi. Przyrównuje się geny z grupy genów onkogennych czy protoonkogenów do pedału gazu w samochodzie, natomiast grupy antyonkogenów oraz grupy genów mutatorowych o których będzie dalej mowa do systemu hamulca, jeden może być hamulcem nożnym, drugi na odmianę hamulcem ręcznym. Co to są za geny? No część z nich to są geny, które pełnią w komórkach funkcje albo molekuł adhezyjnych, czyli cząstek biorących udział w oddziaływaniach międzykomórkowych, tu szczególnie taki jest gen, nazywa się APC, którego mutacje są istotne w rozwoju rodzinnego raka jelita grubego, rozwijającego się na podłożu rodzinnej polipowatości. Drugi z takich genów, który również koduje molekuły adhezyjne to jest gen VHL, który bierze udział w patogenezie tzw. zespołu Von Hippel- Lindau, to są nowotwory wielonarządowe rozwijające się też genetycznie- rak nerki jest takim. No i wreszcie mamy grupę genów, które kodują białka będące negatywnymi regulatorami cyklu komórkowego, czyli takimi, które nie dopuszczają do tego aby zaszedł cykl komórkowy w sytuacjach, gdy materiał genetyczny nie jest do tego gotowy. Może nie być gotowy w wyniku tego iż nie został w porę naprawiony, tak mniej więcej jak kontroler zmiany w jakimś serwisie samochodowym, który sprawdza czy można klientowi wydać rzekomo naprawiony samochód, żeby na najbliższym zakręcie się nie rozbił. W przeciwieństwie do onkogenów, mutacje mają charakter recesywny, w związku z czym ujawniają się wyłącznie w przypadku gdy jest to forma homozygotyczna. Żeby do tego doszło muszą nastąpić dwie mutacje, albo gen prawidłowy musi ulec uszkodzeniu, np. w aberracji chromosomalnej. Istotnym elementem jest tutaj więc powstanie sytuacji zwanej utratą heterozygotyczności, w przypadku pierwszej mutacji mamy heterozygotę, choroba się nie ujawnia, jeśli dojdzie do utraty heterozygotyczności, czyli albo w drugim genie również wystąpi mutacja albo prawidłowy gen zostanie stracony, wówczas ujawnia się cecha. Jak to się może zdarzyć, że rozwija się utrata heterozygotyczności? No może być np. utrata chromosomu podczas podziału komórkowego. I do komórki potomnej trafia wyłącznie jeden zmutowany gen, to wtedy mamy sytuację taką, że tylko on może się ujawnić. Druga sytuacja nazywa się reduplikacja, do jednej z komórek obok chromosomu prawidłowego, czyli zawierającego allel dziki, trafiają dwa chromosomy zawierające allel zmutowany. Dwóch na jednego - dwóch wygrywa. Kolejna sytuacja, segregacja dwóch alleli wbudowanych do jednej komórki, dalej delecja allelu dzikiego, tutaj to nastąpiło w wyniku podziału komórkowego, a tu w wyniku jakiejś aberracji chromosomalnej doszło do utraty chromosomu z komórki. No i wreszcie w obrębie allelu dzikiego, czyli prawidłowego może dojść do mutacji punktowej w efekcie, której do głosu dochodzi wyłącznie allel zmutowany. Wszystkie te sytuacje prowadzą do utraty heterozygotyczności. Najwięcej danych na temat powstawania nowotworów uwarunkowanych mutacjami w obrębie antyonkogenów pochodzi z prac Knudsona, który w 1971 roku sformułował teorię dwóch zdarzeń. Podstawą do tych badań, które są szeroko cytowane, są badania prowadzone na temat rzadkiego nowotworu gałki ocznej występującego u dzieci mianowicie siatkówczaka, po łacinie retinoblastoma. Retinoblastoma może wystąpić albo jako choroba sporadyczna, albo jako choroba dziedziczna. Jeśli występuje jako choroba dziedziczna to z reguły jest obustronna, w obu gałkach ocznych rozwija się nowotwór i to bardzo szybko po urodzeniu. Natomiast jeśli jest to forma sporadyczna to występuje w wieku starszym, u starszych dzieci i w jednej gałce ocznej z reguły. Knudson i jego grupa badali materiał genetyczny u chorych zarówno z usuniętego guza gałki ocznej jak i z krwi obwodowej, czyli takiego materiału jaki występuje w każdych komórkach. No i co ciekawego zauważyli? Jeśli tu jest guz a tu mamy DNA pobrane z krwi. W guzie, żeby wystąpiła choroba, jak łatwo zgadnąć muszą być dwa allele zmutowane. Natomiast w krwi obwodowej nie znajdujemy w przypadku postaci sporadycznej żadnej nieprawidłowości. Jeśli mamy postać dziedziczną to w guzie jak łatwo zgadnąć muszą być obydwa allele zmutowane, natomiast w krwi obwodowej znajdujemy jeden allel zmutowany. No i narodziła się ta teoria dwóch zdarzeń. Tutaj mamy proszę państwa sytuację prawidłową, obydwa allele są dzikie, pojawia się pierwsza mutacja, w wyniku tej mutacji dochodzi do uszkodzenia allelu dzikiego, powstaje allel zmutowany, choroba się nie rozwija. Jeśli mamy postać sporadyczną to zdarzyło się w obrębie siatkówki na jakimś etapie życia po urodzeniu, natomiast w komórkach całego ciała, czytaj DNA krwi obwodowej, sytuacja jest taka, mutacja wystąpiła w obrębie wyłącznie gałki ocznej. Zdarza się mutacja druga, dochodzi do uszkodzenia drugiego allelu, nastąpiła utrata heterozygotyczności i powstaje sytuacja, gdzie ujawnia się cecha. Jeśli mamy postać sporadyczną również dzieje się to w życiu pozapłodowym i w ten oto sposób rozwinął się nowotwór gałki ocznej. Jeśli mamy postać dziedziczną to pierwsza mutacja została odziedziczona, jej ślad mamy w krwi obwodowej, DNA krwi obwodowej i ona również w momencie urodzenia była już w obrębie siatkówki, natomiast w wyniku działania jakiegoś czynnika mutagennego doszło do rozwoju nowotworu gałki ocznej w wyniku powstania homozygoty, natomiast w obrębie pozostałych komórek somatycznych włącznie występuje ta jedna mutacja, która została odziedziczona. W konsekwencji doprowadza to do rozwoju nowotworu złośliwego. Wśród nowotworów, w których bierze się udział rolę zmutowanych antyonkogenów na pierwszym miejscu jest to siatkówczak, za to odpowiedzialne są mutacje w obrębie antyonkogenu RB1. Drugim najczęściej badanym antyonkogenem jest onkogen TP53 kodujący białko P53 albo TP53, to jest to samo, praktycznie różne mutacje w obrębie tego antyonkogenu stwierdzane są w bardzo wielu nowotworach u człowieka, natomiast uwarunkowane genetycznie zaburzenia w zakresie tego antyonkogenu powodują rozwijanie tzw. zespołu Li-Fraumenii, z licznymi wielonarządowymi nowotworami, nowotworami synchronicznymi, równocześnie u tego samego pacjenta w tym samym czasie rozwijają się nowotwory w różnych narządach, często wywodzących się z różnych listków zarodkowych. Dalej mutacje w obrębie tego antyonkogenu APC, kodującego jak powiedziałem molekuły adhezyjne, biorą udział w powstawaniu raka jelita grubego na podłożu rodzinnej polipowatości, bo nie zawsze rak jelita grubego potrzebuje występowania polipu. Dalej to samo, molekuła adhezyjna kodowana przez VHL, zespół Von Hippel- Lindau, rak nerki, rak w obrębie ośrodkowego układu nerwowego, rozmaite glejaki, mięsaki, obraz jest bardzo bogaty. Dalej antyonkogen WT1, jego mutacje powodują powstanie nowotworu nerki u dzieci tzw. guza Wilmsa. No i bardzo intensywnie badane dwa antyonkogeny ze względu na ich rolę w powstawaniu rodzinnego raka sutka i raka jajnika. Tu prace są bardzo zaawansowane również w zakresie poradnictwa genetycznego i aplikacji tych badań w codziennej praktyce, nie mniej trudno o jakieś ostateczne wnioski. Są ośrodki amerykańskie, które zalecają w przypadku wykrycia mutacji w obrębie tego antyonkogenu BRCA1, usunięcie u zdrowej kobiety obydwu sutków i obydwu jajników, czyli strasznie okaleczająca operacja, powstaje pytanie ile jeszcze można wyciąć z człowieka żeby jeszcze był człowiekiem. Natomiast na razie za mało wiadomo, aby mogło to być obowiązującym trendem w świecie, w każdym razie takie są próby aplikacji tych wyników w codziennej praktyce. W innych sytuacjach nic się nie proponuje wycinać, bo jeśli nowotwór jest wielonarządowy, równoczasowy, jakakolwiek prewencja nie wchodzi w grę. Jeśli jest rodzinna polipowatość jelita grubego jest kilkaset, kilka tysięcy, lub kilkanaście tysięcy polipów w obrębie jelita, więc jedyny sposób zapobiegawczy to nawet bez badania występowania antyonkogenów wykonanie totalnej colectomii, czyli wycięcie całego jelita grubego, nie muszę nikogo przekonywać jak okaleczający i ciężki jest ten zabieg. No i dwa słowa o dwóch antyonkogenach, pierwszy z nich to jest ten gen RB1, który koduje białko P110, to jest przypominam ten gen, którego mutacje prowadzą do powstania siatkówczaka, gen ten występuje na 13 chromosomie, zbudowany jest z 27 egzonów, funkcja tego białka PRB to jest jego interakcja z czynnikami transkrypcyjnymi, jego możliwość interakcji zależy od tego w jakim stopniu jest on ufosforylowany, a stopień fosforylacji zależy od cyklu komórkowego i zależny jest od współpracujących z tym białkiem kinaz. No i to białko staje się niefunkcjonalne wtedy kiedy albo wystąpi mutacja genu, albo w obrębie komórki znajdą się czynniki, które prawidłowo wytworzone białko wiążą i uniemożliwiają jego prawidłowe łączenie z czynnikami transkrypcyjnymi. I tu najbardziej upatruje się funkcję dwóch wirusów, właściwie białek wirusowych, mianowicie pierwsze to jest antygen T z wirusa SV40. SV40 jest onkogennym wirusem transformującym. Ale znacznie ciekawsze również w przypadku tego następnego białka jest oddziaływanie z białkiem wirusowym produkowanym przez wirus ludzkiego brodawczaka, HPV, który to jest czynnikiem etiologicznym w dysplazji raka szyjki macicy u kobiet. U kobiety podkreślam, nie u ludzi bo mężczyźni jak państwo wiecie szyjki macicy nie mają. No i drugie z tych białek supresorowych, produktu genów supresorowych białko P53, ale też może być określane jako białko TP53, na 17 chromosomie zbudowane z 11 egzonów, dla mnie na egzaminie nie jest istotne żebyście państwo mówili, który odcinek najczęściej ulega mutacji, ani w którym odcinku się to wiąże z DNA, bo to w sensie całokształtu zrozumienia nie ma żadnej istotnej rzeczy, a często ktoś wie z ilu aminokwasów to białko jest zbudowane, natomiast nie wie jaka jest jego funkcja, więc to jest pomylenie pojęć. Swoją aktywność wybiera w ten sposób, że wiąże się z DNA i w przypadku gdy występują tam uszkodzenia uniemożliwia komórce wejście w cykl komórkowy, uniemożliwia powielenie tego materiału w fazie S cyklu komórkowego, dlatego poetycko zwany jest strażnikiem, żandarmem, policjantem, genomu. Swoją działalność wiążącą może rozwinąć tylko wtedy kiedy występuje w formie homotetrameru, czyli są 4 podjednostki identyczne. Jak to się dalej dzieje to za chwilę pokażę, natomiast ten homotetramer nie powstaje w kilku sytuacjach, po pierwsze jeśli nastąpi mutacja genu to wtedy 4 podjednostki będą identyczne, ale nie takie jakie powinny być, będąc produktem zmutowanego genu, albo nastąpi połączenie ze zmutowanym białkiem, albo w komórce pojawią się jakieś białka, które uniemożliwiają to połączenie i znowu mamy antygen T tego wirusa transformującego SV40, z kolei białko E6 też z wirusa brodawczaka ludzkiego. No i jeśli wszystko przebiega jak należy mamy jakieś uszkodzenie, białko P53 po aktywacji wiąże się z tym właśnie regionem, następuje ekspresja genu P21, powstaje odpowiedni mRNA, w wyniku translacji powstaje białko inhibitorowe dla kinaz cyklinowozależnych i taki kompleks staje się nieaktywny, komórka nie wchodzi w fazę S, ważna jest interakcja gdy białko P53 wchodzi w interakcje z DNA uniemożliwiając zajście prawidłowego cyklu komórkowego. Wszystko jest pozastawiane do czasu naprawy uszkodzenia. No i wreszcie trzecia grupa tych genów, o których wspominałem, że biorą udział w transformacji nowotworowej komórki to geny tzw. tworu mutatorowego, geny mutatorowe, są to geny zaangażowane w naprawę materiału genetycznego, w jego stabilizację. Tu badania są stosunkowo najmniej zaawansowane, ale szczególnie dwie jednostki chorobowe są intensywnie eksplorowane, pierwszy jest to rak jelita grubego, szereg mutacji w obrębie tych genów zostało wykrytych i wreszcie drugi zespół to jest tzw. Ataxia teleangiectasia, to jest wrodzony zespół polegający na zaburzeniach sfery pozapiramidowej układu nerwowego, stąd zmiany o charakterze ataxii, niezborności ruchów, zmiany o charakterze teleangiectasii, czyli rozszerzonych naczyń, głównie naczyń skórnych jak i naczyń narządów wewnętrznych w tym również naczyń w obrębie OUN. W ten oto szczęśliwy sposób dobiegliśmy do końca tych podstaw z podstaw biologii i genetyki molekularnej, które trzeba mieć w małym paluszku, bo do tego będziemy wielokrotnie się odwoływać.

Drugie zagadnienie, którym się dzisiaj zajmiemy to są modyfikacje posttranslacyjne białek. Modyfikacje posttranslacyjne białek są jednym z etapów biosyntezy białka. Poprzednim razem pokazywałem w jaki sposób następuje translacja, w jaki sposób jest ona regulowana, jakie inhibitory możemy zastosować aby ją zatrzymać, które znalazły zastosowanie jako leki przeciw bakteryjne ale także jako cytostatyki. Na etapie translacji poza jakimiś bardzo drobnymi peptydami białko jeszcze nie jest aktywne, musi ulec tzw. obróbce posttranslacyjnej czyli modyfikacjom posttranslacyjnym, w wyniku których staje się w pełni funkcjonalnym białkiem. Modyfikacje posttranslacyjne można podzielić ze względu na lokalizację w której zachodzą, na modyfikacje wewnątrzkomórkowe i modyfikacje pozakomórkowe. No i ze względu na mechanizm, który za chwilę poznamy można jeszcze podzielić na modyfikacje zachodzące enzymatycznie i na modyfikacje zachodzące nieenzymatycznie. Pierwsza modyfikacja – hydroksylacja, czyli jedna z form utleniania, szczegółowo będzie ona omawiana na seminariach przy okazji omawiania enzymów z grupy hydroksylaz. Najważniejsze znaczenie z punktu widzenia białek, którymi się zajmujemy jest modyfikacja posttranslacyjna kolagenu i elastyny. W tych białkach dochodzi do modyfikacji posttranslacyjnej dwóch aminokwasów, mianowicie proliny i lizyny. Powstaje odpowiednio hydroksyprolina i hydroksylizyna, są to aminokwasy białkowe, które nie mają swojego aminoacylo-tRNA, one nie są włączane do białka na etapie translacji, one powstają w wyniku modyfikacji posttranslacyjnej. Jeśli byśmy oznaczali te aminokwasy np. w surowicy krwi lub w moczu co jest możliwe, to mamy stąd wniosek, że nie tylko zaszła prawidłowo translacja, ale również wewnątrz komórki, bo są to modyfikacje wewnątrzkomórkowe nastąpiła modyfikacja, przynajmniej pierwszy etap biosyntezy kolagenu i elastyny, czyli hydroksylacja. Hydroksylacja ta zależna jest od obecności w komórce witaminy C, jonów żelazawych oraz kwasu α-ketoglutarowego, szczegółowo przy okazji omawiania poszczególnych białek. Po co ta modyfikacja zachodzi? Dla kolagenów hydroksylacja proliny jest kluczowa dla przyjęcia przez kolagen odpowiedniej konformacji przestrzennej, natomiast hydroksylacja lizyny niezbędna jest do tego, aby kolagen mógł w przyszłości ulegać glikozylacji, czyli następowym wiązaniu się z innymi komponentami tkanki łącznej, czyli z glikozaminoglikanami. Kolejna modyfikacja – glikozylacja. Glikozylacja jest to przyłączanie do białka cząsteczki lub cząsteczek cukru, najczęściej jest to glukoza lub galaktoza, jest to proces enzymatyczny mediowany przez odpowiednie gluko- lub galaktozylotransferazy. Kolejny proces, który z nazwy jest podobny do glikozylacji, ale jest zupełnie inny, nosi nazwę glikacja. Glikacja zwana jest inaczej nieenzymatyczną glikozylacją, ale proponuję tego terminu nie używać, bo każdy kształcony człowiek wie, że glikacja to właśnie jest to, czyli proponuję używać nazwy glikacja. Glikacja jest to proces zachodzący przede wszystkim w przestrzeni pozakomórkowej, dotyczy zarówno białek osocza jak i białek tkankowych, ma kolosalne znaczenie dla rozwoju powikłań w przypadku niewyrównanej cukrzycy, czyli takiej cukrzycy, która przebiega z podwyższonymi poziomami glukozy. Wówczas białka ulegają glikacji, początkowo powstają produkty przejściowe, pośrednie, które mają charakter odwracalny tzw. związki amadori. Jak one wyglądają to przy okazji omawiania węglowodanów pokażę, a następnie ulegają one przekształceniu w związki, które w skrócie noszą nazwę AGE, nazwa ich jest dobra ponieważ one z wiekiem się kumulują, nadal mimo iż prosiłem gąbka jest sucha, jak na każdym wykładzie jedno tylko z moich życzeń będzie realizowane to widzę to czarno, także proszę aby gąbka była wilgotna następnym razem, tzn. Advanced Glication End Products, czyli zaawansowane produkty końcowej glikacji. Tego typu związki AGE mają swoje receptory występujące m.in. na makrofagach, w efekcie czego dochodzi do aktywacji makrofagów, do eksplozji tlenowej, wydzielania enzymów proteolitycznych, to może mieć istotne znaczenie w generowaniu dalszych powikłań miażdżycowych. Ocena białek zmodyfikowanych poprzez glikację znalazła również zastosowanie praktyczne, w tym celu oznacza się tzw. glikowaną hemoglobinę, którą w skrócie oznacza się HbA­_1C i która jest markerem do uznania cukrzycy za ostatni kwartał, dlatego za ostatni kwartał, bo krwinka żyje około 120 dni, a nowa hemoglobina w krwince, która uległa zmodyfikowaniu nie zostanie zsyntetyzowana. To jak naciągnięty termometr lekarski, jak temperatura spadnie, czytaj jak spadnie stężenie glukozy, bo pacjent przed wizytą zaczął nagle się racjonalnie odżywiać, przestał jeść słodycze i nawet zaczął brać tabletki, których poprzednio nie jadł. Przychodzi na wizycie, pokazuje jaką ma piękną glikemię, ale to badanie powie prawdę, bo jeśli poziomy glikowanej hemoglobiny są wysokie tzn. przez te 3 miesiące hulaj dusza bez kontusza, natomiast tuż przed wizytą wielka pokora i siermiężny styl życia. Kolejna modyfikacja – dezaminacja oksydacyjna. Dezaminacja oksydacyjna dotyczy ε-aminowych grup lizyny. Lizyna jak państwo pewnie wiecie jest aminokwasem dwuzasadowym i posiada grupę α i grupę ε. Grupa α nie może ulegać modyfikacji, bo jest zaangażowana w wiązanie peptydowe, natomiast grupa ε podlega modyfikacji, za tą modyfikację odpowiedzialny jest enzym oksydaza lizylowa. Jest to enzym miedziozależny. W wyniku tej modyfikacji powstaje aldehydowa pochodna lizyny, która jak sama nazwa mówi nazywa się allizyna, jest to etap wstępny do powstawania wiązań poprzecznych cross linking, które mają kluczowe znaczenie dla stabilizacji zarówno kolagenu jak i elastyny. Jeśli ten enzym wykazuje brak aktywności lub aktywność jest wtórnie zaburzona wskutek niedoboru miedzi, taki stan nosi nazwę latyryzmu, powstają wówczas białka tkanki łącznej pozbawione podstawowej cechy, mianowicie odporności mechanicznej wskutek nie powstawania wiązań krzyżowych. Wiązanie krzyżowe i wiązanie poprzeczne to jest to samo. Następna modyfikacja – karboksylacja, szczegółowo o niej za chwilę więcej słów powiem. Następna modyfikacja – tworzenie mostków disulfidowych, kluczowe znaczenie dla przyjmowania konformacji przez liczne hormony, enzymy. Również pewną modyfikacją, która prowadzi do inaktywacji białek jest zrywanie tych mostków disulfidowych przez redukcję. Kolejna modyfikacja, która dzisiaj do znudzenia będzie w ostatniej części wykładu wałkowana to ograniczona proteoliza. Proteoliza to jest hydroliza białka, a ta jest ograniczona do pewnych miejsc w białku, czyli jest wysoce swoista, specyficzna. W efekcie tego od białka zostaje odcięty jego kawałek, czyli jakiś peptyd drobno cząsteczkowy i w wyniku tego powstałe białko uzyskuje aktywność. Kluczowe znaczenie ma to w przypadku enzymów proteolitycznych i takich trywialnych powszechnie znanych, w przewodzie pokarmowym występujących, jak i tych enzymów, które dzisiaj będziemy omawiać w aspekcie układu krzepnięcia krwi i fibrynolizy. Drugim takim miejscem gdzie ograniczona proteoliza odgrywa istotne znaczenie oprócz aktywacji enzymów jest aktywacja prohormonów do aktywnych hormonów, czy preprohormonów do prohormonów a następnie do hormonów aktywnych. Następne dwie modyfikacje mają kluczowe znaczenie dla aktywacji i inaktywacji enzymów, też się nad nimi dłużej zatrzymam w dalszej części wykładu. Następna modyfikacja białka to ubikwitynacja , czyli przyłączanie do białka drobno cząsteczkowego innego białka, mianowicie ubikwityny, też bliżej coś więcej powiem za chwilę. Następna modyfikacja – acetylacja. W warunkach fizjologicznych acetylacja odgrywa rolę w metabolizmie białek histonowych, histonów. Natomiast znacznie ważniejsza z punktu widzenia lekarskiego jest acetylacja wywołana pewnymi środkami farmakologicznymi. Klasyczny przykład, do którego będziemy wielokrotnie wracać to jest acetylacja centrum katalitycznego cyklooksygenazy przez kwas acetylosalicylowy, czyli aspirynę, wówczas białko ulega zahamowaniu, białko enzymatyczne, czyli cyklooksygenaza w wyniku tejże modyfikacji. Następna modyfikacja to metylacja, w tym biorą udział metylotransferazy, no odpowiednio dla acetylacji może być deacetylacja przez deacetylazy i demetylacja przez demetylazy. No i wreszcie modyfikacje lipidowe nad którymi też się więcej w dalszej części zatrzymam ponieważ jest to w tej chwili taki current topic w biochemii klinicznej, generalnie w medycynie. No kilka słów już powiedziałem o hydroksylacji proliny, lizyny, glikozylacji następnie hydroksylizyny dla łączenia się z pozostałymi strukturami tkanki łącznej. Tu ważna jest również ograniczona proteoliza, czyli nie tylko enzymy, nie tylko hormony, ale przy trójhelikalnej budowie kolagenu mamy na końcu N i na końcu C globularne takie zakończenia. To mniej więcej wygląda tak jak wkładka do kontaktu, żeby dziecko tam druta nie wsadziło, a ponieważ poszczególne molekuły protokolagenu muszą być połączone koniec do końca czyli musi być jak wtyczka męska i gniazdko żeńskie, to nie może być tam na końcu żadnych zabezpieczeń i dlatego te globularne peptydy muszą ulec odcięciu podczas biosyntezy kolagenu, one przedostają się do układu krążenia, mogą być zmierzone metodami immunologicznymi i mówią nam o nasileniu biosyntezy kolagenu. Przy omawianiu biochemii narządowej pod koniec roku wspomnę państwu o tym, że są to markery kościotworzenia, bowiem mówią o tym ile kolagenu zostało zsyntetyzowane, ponieważ one pojawiają się tylko na etapie tworzenia kolagenu, nie na etapie degradacji. No i wreszcie to wszystko jest spinane koniec do końca, aby nam się nie rozleciało, tworzą się tutaj wiązania poprzeczne, czyli cross linking. No i wreszcie włókno kolagenowe zostaje wydzielone poza komórkę, gdzie w przestrzeni poza komórkowej musi asocjować z pozostałymi składnikami tkanki łącznej, włókna kolagenowe nie są tak po prostu porozrzucane tylko są elementami macierzy poza komórkowej tkanki łącznej. Kolejna rzecz, o której trzeba coś wiedzieć to są pewne nietypowe kolageny, zwane w skrócie FACIT, tzn. Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple Helices, jak sama nazwa mówi są to kolageny, których struktura trójhelikalna jest poprzerywana. Ja cały czas używam nazwy kolageny i też taką oczekuję, a nie kolagen, bo jest to heterogenna, bardzo duża grupa zbudowana z kilkunastu rodzajów różnych białek, części z nich nawet dobrze funkcja nie jest poznana, ale zostały zidentyfikowane metodami immunologicznymi jako odmienne od tych, które dotąd zostały poznane. To co trzeba tu mieć w jednym paluszku, znane są: kolagen typu I, gdzie występuje, jaką ma funkcję, funkcja w skórze, funkcja w kościach, kolagen typu IV związany z błonami podstawnymi i z tym kolagenem, a zwłaszcza z odpowiedzią immunologiczną, przeciwko temu kolagenowi wiąże się cała grupa patologii autoimmunologicznych, zwłaszcza kłębkowych zapaleń nerek, gdzie te podtypy odkładają się właśnie w zakresie błon podstawnych i wreszcie taki ciekawy kolagen typu VII......(w tej chwili nastąpiła zmiana kasety magnetofonowej firmy SKC 90 ze strony A na stronę B)...... ......jeśli występuje defekt genetyczny w zakresie tego kolagenu (VII) to wówczas naskórek niczym nie jest przymocowany i najdrobniejszy uraz doprowadza do złuszczania naskórka, tworzenie się ran, pęcherzy i ta jednostka chorobowa nosi nazwę Epidermolissis bulmosa. To są kolageny tych typów, które są tutaj wspomniane, w różnych tkankach są reprezentowane a najpewniej nie jest to kolagen taki najważniejszy strukturalny, ale można mniej brzęczeć tymi kasetami wkładanymi, już pomijając to, że nikt z państwa się nie pyta, czy możne nagrywać, ale już jak się to robi to przynajmniej po cichu i mniej ostentacyjnie. To są tzw. kolageny włókienkowe, ponieważ one towarzyszą innym włóknom kolagenowym, tym które stanowią główną strukturę tkanki łącznej. Co one mają ciekawego? No mają wszystko to czego kolagen dojrzały nie powinien mieć, mianowicie mają wciąż jakieś końce globularne, główna masa to jest potrójny heliks w późnych kolagenach, ale w tych kolagenach stanowi mniej więcej 10 do 15% całej masy kolagenu, czyli jest w mniejszości, dalej występuje tzw. struktura A, która spotykana jest w czynniku von Willebranda- (vWF), o którym w dalszej części będzie jeszcze mowa i wreszcie występuje struktura III występująca i charakterystyczna dla innego białka tkani łącznej, głównie fibronektyny. No i wreszcie możemy znajdować w tych kolagenach włókienkowych, czyli kolagenach typu FACIT również sekwencje przypominające czynniki wzrostu, czyli z tego wynika, że takie kolageny mogą również działać jak czynniki wzrostu, czyli brać udział w systemie integracji organizmu. I o tym wspomnę przy okazji omawiania hormonów, że kolageny włókienkowe postrzegane są jako czwarty układ sygnalizacyjny, czyli integrująca funkcja tkanki łącznej oprócz układu nerwowego, oprócz układu immunologicznego i oprócz układu hormonalnego. Kolejne białko, którym się zajmiemy to jest elastyna. Elastyna jest białkiem występującym w różnych miejscach, ale najobficiej w trzech: mianowicie w skórze, w dużych naczyniach krwionośnych zwanych naczyniami typu sprężystego i trzecie miejsce, w którym występuje są płuca. Jak sama nazwa mówi to białko warunkuje tymże tkankom właściwości sprężyste. Jest to białko o bardzo długim okresie półtrwania, bardzo oporne na działanie enzymów proteolitycznych, enzymy, które degradują elastynę noszą nazwę elastaz. Biosynteza zachodzi w różnych komórkach, w fibroblastach, w chondroblastach, w osteoblastach, zachodzi w kilku etapach. Po pierwsze gen elastyny ulega transkrypcji, powstaje pierwotny transkrypt, jak widać sekwencje mamy zarówno egzonowe jak i intronowe, w wyniku splicingu powstaje mRNA, czytany jest na rybosomach. Jeszcze na etapie powstającego peptydu na rybosomach następuje hydroksylacja lizyny, hydroksylacja proliny, ale głównie lizyny, powstaje tropoelastyna. Zostaje wydzielona poza komórkę, następnie następuje koacernacja, czyli łączenie się poszczególnych molekuł tropoelastyny, dochodzi do dalszych etapów, do dezaminacji oksydacyjnej lizyny, powstają allizyny, które są niezbędne dla tworzenia usieciowania elastyny. I wreszcie poprzez asocjację z glikoproteinami obecnymi w tkance łącznej tworzą się włókna sprężyste. Unikalną właściwością elastyny jest występowanie dwóch aminokwasów wiązań krzyżowych: desmozyny i izodesmozyny. Poza elastyną tego typu aminokwas wiązań poprzecznych występuje jedynie w skorupce jaja, a ponieważ nikt nie jada skorupek jaja, dlatego tyle desmozyny ile posiadamy w organizmie powstaje w wyniku degradacji elastyny, nie w biosyntezie elastyny to powstaje tylko w degradacji, to już jest dojrzała elastyna, która się rozpada, zostaje wydzielona desmozyna. Desmozyna powstaje w sposób nieenzymatyczny przez połączenie trzech allizyn i jednej lizyny nie zmienionej. Niektóre laboratoria proponują jej oznaczanie, oznaczanie jest dość kłopotliwe, wymaga albo metody immunoenzymatycznej albo radioimmunologicznej, albo metody HPLC dla oceny degradacji elastyny. No i tak jak sobie przypomnimy, w których to miejscach występuje elastyna, czyli po pierwsze degradacja w skórze, głównie jak ktoś nadmiernie się opala to dochodzi do aktywacji enzymów proteolitycznych w skórze i po jakimś czasie skórę ma brązową tylko, że nie elastyczną tylko taką pomarszczoną. Drugie miejsce – duże naczynia, czyli aorta, tam następuje degradacja elastyny w powstawaniu procesu miażdżycowego, w patogenezie miażdżycy. I trzecie miejsce – płuca, tam następuje degradacja elastyny w tworzeniu rozedmy płuc. No i wreszcie mamy taki zespół, za chwilę do niego dojdziemy, jeszcze jak jest zbudowana elastyna w sensie molekularnym, to definiuje tzw. model Graya. Według modelu Graya mamy w elastynie naprzemiennie ułożone odcinki helikalne zwane naoliwioną sprężyną, w tych odcinkach zawarte są aminokwasy hydrofobowe. Jeśli rozciąga się tą sprężynę, aminokwasy hydrofobowe wchodzą w kontakt ze środowiskiem wodnym, co termodynamicznie jest niekorzystne i dąży ta cząsteczka do przyjęcia struktury pierwotnej, czyli od tych odcinków helikalnych naoliwionej sprężyny zależy zdolność elastyny do przyjęcia pierwotnej konformacji, czyli sprężystość. Natomiast odcinki, w których występuje desmozyna jak wspominałem trzy allizyny jedna lizyna, czyli można tak spiąć cztery cząsteczki tropoelastyny. Te miejsca są bardzo odporne na rozciąganie, czyli warunkują właściwości mechaniczne to, że elastyna rozciągnięta się nie zrywa. No i wreszcie mamy tu genetycznie uwarunkowany zespół zaburzeń w biosyntezie elastyny, nosi nazwę Cutis laxa. Tutaj dobrze znana modyfikacja – tworzenie mostku disulfidowego jak wspomniałem istotne dla przyjęcia konformacji przez niektóre białka, nie będziemy się nad tym dłużej zatrzymywać. Gamma- karboksylacja, to jest modyfikacja polegająca na karboksylacji reszt γ-karboksylowych, które występują w kwasie glutaminowym, to jest aminokwas dwukarboksylowy, jedna grupa α zaangażowana w wiązanie peptydowe, druga grupa γ, która ulega takiej modyfikacji, po co? Powstały zmodyfikowany aminokwas – kwas γ-karboksyglutaminowy uzyskuje zdolność wiązania jonów Ca²⁺. Występuje więc ta modyfikacja w tych białkach, w których wiązanie wapnia ma znaczenie kluczowe. Są to mianowicie czynniki krzepnięcia z grupy protrombiny, jest to czynnik II, VII, IX, X, dalej dwa naturalne inhibitory krzepnięcia, których funkcję szczegółowo omówię przy okazji witaminy K, mianowicie białko C, białko S oraz szereg białek ulegających ekspresji zarówno w kościach jak i poza kośćmi, ale wtedy kiedy ulegają ekspresji poza kośćmi to wiąże się z reguły z jakąś dużą patologią. Są to mianowicie białka takie jak osteokalcyna, osteonektyna, osteopontyna. Proces posttranslacyjnej γ-karboksylacji jest procesem zależnym od witaminy K, czyli żeby prawidłowo powstał kwas γ-karboksyglutaminowy musi być po pierwsze kwas glutaminowy, czyli musi nastąpić translacja, dwa – muszą być enzymy, trzy – musi być witamina K. Jeśli któregoś z tych komponentów brakuje, wówczas nie powstaje białko aktywne funkcjonalnie. Kolejna modyfikacja – fosforylacja i defosforylacja, jest to modyfikacja prowadzona przez enzymy: enzymy fosforylujące nazywają się kinazy, enzymy defosforylujące nazywają się fosfatazy. Aminokwasami, które ulegają w białkach tego typu modyfikacji najczęściej jest seryna, treonina i tyrozyna. Stąd też kinazy noszą nazwę kinaz tyrozynoswoistych lub kinaz serynowo-treoninowych. W wyniku działania kinazy dochodzi do wporwadzenia odpowiedniej struktury w centrum katalityczne enzymu i taki enzym albo zyskuje swoją aktywność, albo ją traci. Przeciwstawny proces prowadzony jest przez fosfatazę. Te nawzajem występujące formy aktywna – nieaktywna lub vice versa, która to możliwość zastępuje dzięki dwóm enzymom kinazie i fosfatazie nosi nazwę interkonwersji enzymu. Jest to jeden ze sposobu wpływu na aktywność enzymu, jak to się mówi wpływ na sprawność katalityczną enzymu, który ma kluczowe znaczenie dla kilku procesów w organizmie człowieka. Najlepszym przykładem do wykazania tej funkcji jest pokazanie dwóch białek. Jednym z nich jest syntaza glikogenu, jest to enzym, który prowadzi syntezę glikogenu. Drugi enzym o przeciwstawnym działaniu jest to fosforylaza glikogenu, czyli enzym prowadzący do degradacji glikogenu. Jeśli dochodzi do uruchomienia procesów, o których będzie mowa w przyszłości, w których następstwie dochodzi do aktywacji odpowiednich kinaz, jeśli dojdzie do fosforylacji syntazy glikogenowej, enzym ten staje się nieaktywny, czyli synteza glikogenu ustaje, ale równocześnie ta sama fosforylacja w przypadku fosforylazy glikogenu, czyli enzymu degradującego glikogen prowadzi do aktywacji tego enzymu, czyli równocześnie dochodzi do wzmożenia degradacji glikogenu i vice versa. Jeśli zadziała fosfataza to syntaza glikogenu w formie zdefosforylowanej jest enzymem aktywnym, natomiast fosforylaza glikogenu w formie zdefosforylowanej jest enzymem nieaktywnym, dlatego w danym momencie tylko jeden z procesów zachodzi, albo synteza glikogenu, albo jego degradacja. A wszystko to wbiegając w bieg wypadków jest regulowane przez hormony, które działając na odpowiedni receptor uruchamiają kaskadę kinaz. No i kinaza tyrozynoswoista, jest enzymem sprzężonym z receptorem, najczęściej są to receptory dla czynników wzrostu. Jeśli do tego receptora przytuli się odpowiedni ligand, w naszym przypadku czynnik wzrostu, dochodzi do aktywacji kinazy tyrozynoswoistej, enzym ten ma swój substrat w postaci reszt tyrozyny w części wewnątrzkomórkowej receptora, ale również na szeregu innych białek, które gdzieś tam po drodze się znajdują. W wyniku fosforylacji receptor traci swoją aktywność, czyli jest stop w przekaźnictwie sygnału, a równocześnie fosforylacja innych białek doprowadzi do przeniesienia sygnału z czynnika wzrostu działającego na receptor na odpowiednie substraty, białka enzymatyczne i nieenzymatyczne. Kolejna modyfikacja to ubikwitynacja, jest prowadzona za pośrednictwem odpowiednich enzymów transferujących ubikwitynę, drobno cząsteczkowe białko o bardzo zachowawczej budowie, budowie konserwatywnej, która występuje u organizmów nie spokrewnionych ze sobą praktycznie w takiej samej formie. Przyłączenie tego białka najczęściej postrzegane jest jako jego naznaczenie, aby białko to uległo degradacji. Tak się dzieje w przypadku białek, które są białkami nieprawidłowymi, nie spełniają funkcji, muszą być zdegradowane, jak i takich białek, których los w komórce dobiegł końca. Ale funkcji ubikwitynacji jest znacznie więcej, mianowicie ubikwityna bierze udział w regulacji ekspresji genów, w naprawie DNA, w transformacji nowotworowej komórki, w regulacji cyklu komórkowego, w regulacji aktywności chromatyny, w syntezie rybosomów i peroksysomów. Dana cząsteczka białkowa może być zmodyfikowana jedną cząsteczką ubikwityny, nosi to nazwę monoubikwitynacji, a może zachodzić modyfikacja przez kilka cząsteczek ubikwityny, co nosi nazwę poliubikwitynacji. Do danego łańcucha polipeptydowego może być po jednej cząsteczce ubikwityny przyłączonej w kilka miejsc, taka może być forma poliubikwitynacji, ale również mogą być te cząsteczki przyłączone jedna do drugiej, czyli tak jak winne grona, też taka możliwość poliubikwitynacji istnieje. Tu mamy jakieś nasze białko, które mamy zniszczone, reakcja następuje między grupą karboksylową glicyny występującej w ubikwitynie, a resztą ε-aminową lizyny. W rezultacie tego działania powstaje wiązanie izopeptydowe, czyli już poznaliśmy drugą funkcję grupy ε-aminowej, jedna to było poddawanie się modyfikacji posttranslacyjnej, czyli dezaminacji oksydacyjnej, powstaje allizyna, mamy kolejne tworzenie wiązania izopeptydowego z cząsteczką ubikwityny celem modyfikacji w grupie ubikwitynacji. No i ostatnia grupa modyfikacji posttranslacyjnych, są to modyfikacje lipidowe, jak sama nazwa mówi jest to przyłączanie do białek pewnych składników lipidowych, są to najczęściej kwasy tłuszczowe, mamy np. palmitylację zachodzącą zarówno w białkach biorących udział w transmisji sygnałów, białka enzymatycze, białka nieenzymatyczne. Drugą taką modyfikacją jest mirystylacja, ale tą modyfikacją, która nas najbardziej będzie interesowała jest modyfikacja o typie prenylacji. Jaka to by nie była modyfikacja w wyniku modyfikacji lipidowej, białko uzyskuje możliwość rozpuszczania większego niż dotąd w tłuszczach, a ponieważ błony są tłuste takie białko zaczyna nabierać większego powinowactwa do błony i w błonie może ulec zakotwiczeniu. Na czym polega prenylacja? Związki do prenylacji biorą się ze szlaku mewalonowego, zwanego inaczej szlakiem biosyntezy cholesterolu. Ten szlak w detalach mamy w paluszku z enzymami, w przyszłym semestrze będzie dokładnie omawiany. Najpierw mamy acetylo-CoA, z trzech cząsteczek acetylo-CoA powstaje β-hydroksy-β-metyloglutarylo-CoA, tu mamy taki kluczowy enzym regulatorowy w tym miejscu – reduktazę HMG-CoA, powstaje mewalonian i z niego powstaje pierwszy związek izoprenoidowy, mianowicie pirofosforan izopentenylu, jest to związek pięciowęglowy, ale on jeszcze w prenylacji nie bierze udziału, przez połączenie dwóch izopentenylopirofosforanów powstaje geranylopirofosforan, związek dziesięciowęglowy, przez połączenie kolejnej cząsteczki pirofosforanu izopentenylu, powstaje farnezylopirofosforan, przez przyłączenie kolejnej cząsteczki izopentenylopirofosforanu powstaje geranylogeraniol. Ja to nie mówię jako ciekawostki przyrodniczej, bo to wszystko do naumienia jest. Czyli mamy geranylopirofosforan, farnezylopirofosforan i geranylogeraniol,czyli geranylogeranylopirofosforan, odpowiednio związki 10-cio, 15-sto, 20-sto węglowe. Takiej modyfikacji o typie prenylacji ulegają białka zaangażowane w transfer sygnału w komórce. W różnych sytuacjach tak zarówno z punktu widzenia nowotworów jak i innych chorób nie nowotworowych np. miażdżycy tętnic zależy nam, aby te białka sygnałowe nie powstawały aktywne. Ta prenylacja jest dlatego istotna, że dysponujemy potężnym narzędziem farmakologicznym jakim są inhibitory reduktazy HMG-CoA, hamujące w tym miejscu powstawanie związków izoprenoidowych, które noszą nazwę statyn. Statyny, czyli inhibitory reduktazy HMG-CoA i możemy co udowodniono i u ludzi i u zwierząt i w hodowlach komórkowych i u takich żywych ludzi jak tu siedzących na wykładzie, że możemy szeregom niekorzystnych zjawisk zapobiec. Jak to się wszystko odbywa? Tu mamy nasze białko RAS, które już dzisiaj widzieliśmy i które w wyniku aktywacji kinazy tyrozynoswoistej stawało się białkiem aktywnym, ale zanim to białko stanie się substratem do działania kinazy tyrozynoswoistej to po wyprodukowaniu na rybosomach musi trafić do błony, to białko jest białkiem nie mającym powinowactwa do błony, dopóki nie ulegnie ono prenylacji. Po sprenylowaniu ulega zakotwiczeniu w błonie i może działać. Takich białek zaangażowanych w transfer sygnału jest znacznie więcej, oprócz tego białka RAS również białko Rac i białko Rho. Stosując inhibitory reduktazy HMG-CoA nie doprowadzamy do tego, że to białko nie powstaje, ono nadal powstaje, możemy je wykryć w cytozolu, natomiast przez brak tej niebieskiej kuleczki nie może być ono zakotwiczone w błonie, czyli tak jakby efektu działania tego białka nie było. I to ma kluczowe znaczenie, stąd jedna z ważniejszych intensywnie poznawanych modyfikacji posttranslacyjnych – prenylacja białek.

Kolejne zagadnienie, którym się zajmiemy to są immunoglobuliny, pełnią one funkcję przeciwciał. Każda cząsteczka immunoglobuliny zbudowana jest z czterech łańcuchów, dwóch łańcuchów lekkich i dwóch łańcuchów ciężkich. W danej cząsteczce immunoglobuliny zawsze obydwa łańcuchy ciężkie i obydwa lekkie są tego samego rodzaju, a w ogóle, jak pewnie wiecie te, które są ciężkie mogą być pięciu rodzajów, co determinuje rodzaj immunoglobuliny i jej klasę, a lekkie mogą być dwóch rodzajów. Mamy tu dwa rejony wiązania, pierwszy to jest antigene binding - dwa rejony wiążące antygen i miejsce ulegające krystalizacji albo wiążące komplement, jak kto woli fragment Fc, który jest jeden. To jest podstawowy monomer immunoglobuliny, no wydawałoby się, że nie trzeba o tym mówić, ale z doświadczenia chociażby tegorocznego wiem, że muszę o tym powiedzieć, że tak wygląda cząsteczka immunoglobuliny G, natomiast immunoglobulina A występuje w formie dimeru, a cząsteczka immunoglobuliny M w formie pentameru, gdzie takie monomery połączone są łańcuchami spinającymi, łańcuchem J. O funkcji immunoglobulin będzie mowa na biochemii narządowej, gdy będziemy analizować obraz elektroforetyczny osocza, więc o tym nie będę mówił, chcę zwrócić państwa uwagę, że w części N-końcowej cząsteczki immunoglobuliny występują miejsca tzw. rejony zmienne, a w obrębie tych rejonów zmiennych występują regiony nadzmienne, czyli hyperzmienne. Natomiast część C-końcowa cząsteczki immunoglobuliny tworzy tzw. region stały. Jak z samej nazwy wynika, że te zmienne różnią się między poszczególnymi immunoglobulinami, a stałe się nie różnią. Od zawsze było to ciekawe w jaki sposób mamy taką różnorodność immunoglobulin, że potrafimy sobie poradzić z każdym antygenem, który do naszego organizmu trafia. Dwie pierwsze teorie, o których będę mówił to są teorie historyczne, proszę nie mówić, że są one obowiązujące. To tzw. teoria instrukcyjna, gdy sobie wyobrażano, że antygen stanowi instrukcję do tworzenia immunoglobuliny, a wydawało się to dość trywialnie, że tą strukturę przestrzenną antygenu cząsteczka immunoglobuliny w sposób swoisty oplata, już nikt tak dziś nie uważa. Druga teoria – teoria zarodkowa, która mówiła o tym, że dla każdej immunoglobuliny, która z antygenem może się teoretycznie spotkać, mamy już gotowy materiał genetyczny zapisany w DNA, ale analiza nawet pobieżna wykazała, że nie zmieściłoby nam się to DNA w jądrze komórkowym, gdyby dla każdej immunoglobuliny istniał oddzielny DNA. I obecnie obowiązująca teoria somatyczna, za którą w roku 1987 Japończyk Tusumi Tomegawa otrzymał nagrodę Nobla. Teoria somatyczna mówi o tym, że każdy z regionów części zmiennej, tam są w łańcuchu ciężkim trzy takie regiony VDJ, kodowany jest przez różne allele, drobne odmiany pewnych takich mini genów kodujących część hyperzmienną. I na etapie tak wygląda pełne DNA w przypadku limfoblasta, a przeciwciało pewnie jak wiecie z histologii produkuje ztransformowany limfocyt B czyli plazmocyt. I na etapie przekształcania limfoblasta w limfocyt B, czytaj plazmocyt następuje edycja DNA, czyli mamy dodatkowy element powstawania tej zmienności, tak jakbyśmy pisali na maszynie. Dla poszczególnych odcinków VDJ wybierane są z macierzystego DNA odpowiednie fragmenty, tak jak pisząc słowa korzystamy z ograniczonej liczby liter w maszynie do pisania. I taki edytowany DNA trafia do limfocyta B, i dopiero taki DNA edytowany wypętlony, następuje w transkrypcji, powstaje hnRNA i z nim dalej się dzieje wszystko tak samo jak z każdym genem nieciągłym czyli następuje usunięcie intronów, złożenie, dopiero tworzy się mRNA. W przeciwieństwie do innych genów, mamy tutaj składanie na etapie różnicowania komórki, czyli DNA limfocyta B jest bardziej ubogi pod względem odmian zawartych tam informacji, niż w limfoblastach. Podobny mechanizm występuje w przypadku niektórych receptorów występujących w limfocytach T, czyli edycja na poziomie nie RNA tylko DNA. No i mamy tutaj pokazane - tu mamy wyjściowe DNA występujące w limfoblaście, przez wybranie pewnych literek następuje złożenie DNA w limfocycie B, następuje transkrypcja, hnRNA powstaje, powstaje splicing i tworzy się mRNA dla konkretnej cząsteczki immunoglobuliny. Warto również w tym powiedzieć, że pierwotna odpowiedź immunologiczna związana jest z wytwarzaniem immunoglobuliny M przeciwko konkretnemu antygenowi, a po jakimś czasie organizm zaczyna wytwarzać immunoglobulinę G o tej samej swoistości, czyli następuje przełączenie na etapie syntezy immunoglobuliny łańcucha mi w łańcuch gamma, to są łańcuchy ciężkie występujące odpowiednio w immunoglobulinie M i w immunoglobulinie G. To zjawisko nosi nazwę swiching, czyli przełączenie, jest to zmiana syntezy immunoglobuliny M w immunoglobulinę G o tej samej swoistości.

Kolejne zagadnienie, którym się zajmiemy dotyczące białek to są priony. Zainteresowanie prionami datuje się mniej więcej od połowy lat 70-tych, kiedy to amerykański badacz czeskiego pochodzenia Kraidusek? jeżdżąc dość często na wakacje na Papuę Nową Gwineę, spotkał tam się z plemieniem, którego smakołykiem są mózgi przodków, takie danie specjalne. Okazało się, że u tych osób rytualny kanibalizm rozwija się rzadkie schorzenie OUN, cechujące się niezbornością ruchu, otępieniem i śmiercią wśród konwulsyjnego śmiechu, co nazwano śmiejącą się śmiercią. Obecnie ta choroba nosi nazwę choroby Kuru. W dalszych latach intensywnie badano mózgi tychże zmarłych i okazało się, że w poszczególnych neuronach cechujących się dużym stopniem zwyrodnienia, występują złogi amyloidu. Dalej intensywnie sprawę badano aż w latach 80-tych i na początku 90-tych zidentyfikowano naturę czynnika, czynnika w gruncie rzeczy infekcyjnego, który powodował w przypadku zjedzenia mózgu przodka, wystąpienie podobnej choroby u konsumenta, nie spowodowanej pewnie działaniem złych duchów. Tym czynnikiem są właśnie priony, które obaliły podstawowy dogmat w biologii, mianowicie przekaźnictwo infekcji przez kwasy nukleinowe. Priony są to zakaźne cząstki białkowe, a nie cząstki kwasu nukleinowego, jak to w przypadku dotąd nam znanych mikroorganizmów powszechnie występuje, w przypadku wirusów, bakterii, riketsji, chlamydii, czynnikiem infekcyjnym jest kwas nukleinowy, a tu cząstką zakaźną jest białko. U każdego z nas występuje taki gen, który nazywa się PRNP, który to koduje białko zwane PrP^C (cellular), białko komórkowe. Dokładnie funkcja tego białka jest nie poznana, jeśli nawet zmutować gen PRNP, to taka komórka najprawdopodobniej prawidłowo funkcjonuje. Jak to się dzieje, że z białka prawidłowego, takiego, które występuje u każdego z nas powstaje białko nieprawidłowe, które ma tutaj taki super skrypt ^SC, to jest skrót od scrapie, to jest jedna z chorób prionowych występujących u kóz i owiec. No może nastąpić mutacja genów w wyniku czego zamiast PrP^C powstaje PrP^SC, ale również białko prawidłowe, czyli PrP^C, albo spontanicznie może się przekształcić w białko nieprawidłowe, albo ktoś mu o tym powie. To, że dzieje się spontanicznie prawdopodobnie zachodzi super rzadko, a najczęściej dzieje się tak, że temu białku ktoś mówi, żeby stało się nieprawidłowe. Prawidłowe białko PrP^C ma strukturę helikalną, takie białko jest białkiem prawidłowo rozpuszczalnym w wodzie, oraz białkiem podatnym na działanie enzymów proteolitycznych, czyli jest białkiem prawidłowo degradowalnym. Natomiast gry przyjrzeć się strukturze molekularnej białka nieprawidłowego, to traci ono swoją strukturę helikalną i zaczyna przypominać swoim wyglądem strukturę β-harmonijki, która dobrze znana jest z białek chociażby takie jak występujące w przydatkach skóry, we włosach, przypomina strukturę β-keratyny. W przypadku takiej modyfikacji białko to staje się białkiem nierozpuszczalnym, zaczyna się w komórkach głównie OUN wytrącać, powoduje zwyrodnienie tych komórek, aktywację enzymów, wakuolizację i prowadzi do odkładania się złogów w OUN, czemu sprzyja upośledzona degradacja białka prionowego, gdyż jest ono niewrażliwe na enzymy proteolityczne. Oprócz tego jest to białko, które bardzo trudno uszkodzić czynnikami fizycznymi, praktycznie jest wrażliwe na skojarzenie wysokiej temperatury jak i podwyższonego ciśnienia, to się nazywa autoklawowanie. Również jest odporne na typowe środki dezynfekcyjne i można je zniszczyć jedynie albo przy pomocy wodorotlenku sodowego albo nadchloranu sodowego, czyli jest to struktura wyjątkowo oporna. Unikalną właściwością białka prionowego jest to, że zarażając białko prawidłowe zmusza je do zmiany konformacji, to zjawisko nosi samoodwzorowania, samoodwzorcowania. Warunkiem, żeby czynnik infekcyjny jakim jest prion mógł się rozprzestrzenić jest to, że musi istnieć gen PRNP i musi istnieć produkowane przez niego prawidłowe białko o budowie helikalnej. Jeśli cząstka prionowa trafi do komórki, zaczyna oddziaływać na białko prawidłowe, to jest dokładnie nie poznane, ale zmusza to białko do zmiany konformacji. Struktura α-helikalna zaczyna się rozciągać i z czasem zaczyna przypominać typową β-harmonijkę, czyli na matrycy białka prionowego, nieprawidłowego białko prawidłowe zaczyna zmieniać konformację i zarażać kolejne komórki, taki jest sposób transmisji infekcji prionowej. Zainteresowanie chorobami prionowymi spowodowane jest tym, iż są one mimo, że rzadkie to wciąż coraz częstsze. Najlepiej poznaną to jest choroba Kuru, ale to u nas nie występuje, tylko jakby ktoś się wybrał na wakacje. Ale tą, która występuje znacznie częściej jest choroba Creutzfelda-Jakoba, w sposób sporadyczny, czyli bez jakiegoś uzasadnionego działania cząstki infekcyjnej występuje raz na milion w populacji, jako postać sporadyczna, mogą być postacie transmitowane genetycznie. Następny zespół Gerstmanna-Straeusslena-Scheikera, którego symptom jest bardzo do Kuru, też się cechuje ataksją, niezbornością ruchu, zaburzeniami czucia, osłabieniem i postępującą demencją, czyli otępieniem. No i wreszcie taki zespół śmiertelnej rodzinnej bezsenności, gdzie objawem osiowym są zaburzenia zasypiania. Natomiast u zwierząt najlepiej poznaną jest Scrapie, no i ta choroba, której wszyscy konsumenci wołowiny się boją, mianowicie zwyrodnienie gąbczaste mózgu wołu BSE, zwana inaczej chorobą wściekłych krów. W jaki sposób następuje transmisja chorób prionowych. No forma sporadyczna, czyli nastąpiła jakaś albo mutacja genu, albo mutacja w cudzysłowie białka, czyli zmiana jego konformacji, mniej więcej tak jak wygrana na loterii w toto lotka, pod względem mechanizmu, a nie pod względu efektu, raz na milion osób w populacji. Forma rodzinna, czyli uwarunkowana transmisją nieprawidłowego genu PRNP, no i wreszcie formy nabyte, najlepiej poznana to jest postać związana z transmisją poprzez wyizolowane z przysadki mózgowej hormony. W latach 60-tych, 70-tych szeroko stosowano do leczenia karłowatości przysadkowej hormonów wzrostu izolowanych z przysadek i u tych osób po latach, to są tzw. infekcje spowalniające, czyli po wielu, często po 20-tu latach ujawnia się choroba, u dużego odsetka tak leczonych rozwinęła się choroba Creutzfelda-Jakoba. Inne możliwości to przeniesienie od osoby chorej poprzez implantację rogówki, po operacjach neurochirurgicznych, czy wreszcie choroby odzwierzęce, które wciąż stoją pod znakiem zapytania, czy możliwa prawdopodobnie jest możliwa transmisja prionów między gatunkami, czyli zjada się hamburgera, a zachorowuje się na chorobę Creutzfelda-Jakoba.

I ostatnie zagadnienie, którym się dziś zajmiemy na które też w całości nie zdążymy zrealizować, więc będziemy kontynuować w przyszłości to jest biochemia układu krzepnięcia i fibrynolizy. Ponieważ te zagadnienia są stosunkowo najsłabiej znane, dlatego w wakacje razem z panem doc. Samkiem umówiliśmy się, że my państwu przekażemy informacje na temat biochemii krzepnięcia, dotyczyć to będzie wyłącznie układu krzepnięcia osoczowego. Natomiast fizjolodzy powiedzą o układzie krzepnięcia, zaangażowaniu w krzepnięcie układu naczyniowego i układu płytkowego. Także nas interesuje wyłącznie biochemia krzepnięcia, biochemia osoczowych czynników krzepnięcia i fibrynolizy. Co to jest proszę państwa hemostaza? Od tego należałoby zacząć, jest to proces, który zapobiega wynaczynieniu krwi w przypadku uszkodzenia łożyska naczyniowego. No i w ten proces zaangażowane są płytki krwi, ściana naczyniowa, to są rzeczy, które nas w biochemii interesują tak pobieżnie. Natomiast najbardziej interesuje nas układ krzepnięcia i fibrynolizy i stąd to najłatwiej zdefiniować, że krzepnięcie z punktu widzenia tego krzepnięcia osoczowego polega na doprowadzeniu, aby rozpuszczalne globularne białko osoczowe – fibrynogen przekształcił się w białko nierozpuszczalne, czyli fibrynę. To jest istota procesu krzepnięcia. Zasadniczo w celach dydaktycznych wyróżnia się dwie drogi aktywacji układu krzepnięcia, mianowicie drogę zewnątrzpochodną i drogę wewnątrzpochodną. Jest to podział ściśle umowny, bo te drogi na wielu etapach, a szczególnie w jednym no ewidentnie ze sobą współpracują, się schodzą. No i jest to podyktowane wyłącznie celem dydaktycznym, a nie jakimś odrębnym krzepnięciem krwi. I również proszę sobie zapamiętać to, że aktywacja układu krzepnięcia w warunkach fizjologicznych, czyli faktycznie po zranieniu naczynia, a nie w sposób patologiczny bez uszkodzenia naczynia, następuje poprzez aktywację układu zewnątrzpochodnego. W wyniku aktywacji układu zewnątrzpochodnego powstają pewne niewielkie ilości trombiny, która następnie aktywuje układ wewnątrzpochodny, a tam układ wewnątrzpochodny również ulega w dalszej części aktywacji, wskutek kontaktu tych czynników układu wewnątrzpochodnego z pewnymi składnikami ściany naczyniowej, które uległy odsłonięciu. W tym czasie układ wewnątrz- i zewnątrzpochodny, który jest tą zapałką podpalającą ulega wygaszeniu przez obecność pewnych inhibitorów, o których dalej powiem, czyli inicjuje układ zewnątrzpochodny, a główny tor utrzymywania krzepnięcia podtrzymuje układ wewnątrzpochodny. Najważniejsze z punktu widzenia zrozumienia krzepnięcia są trzy etapy. Pierwszy etap jest to utworzenie aktywnego czynnika X, odmiennie ten proces przebiega na drodze zewnątrzpochodnej, odmiennie przebiega na drodze wewnątrzpochodnej. Od tego momentu obie drogi ze sobą współpracują. Drugim etapem jest aktywacja protrombiny z utworzeniem trombiny, czyli enzymu, którego substratem jest fibrynogen. I trzecim etapem jest utworzenie włóknika, czyli fibryny oraz jego stabilizacja. Z punktu widzenia biochemicznego czynniki krzepnięcia dzielimy na czynniki białkowe i nie białkowe. Najważniejszymi czynnikami nie białkowymi są fosfolipidy, które żadnego numeru nie mają oraz jony Ca²⁺, które oznaczone są jako IV czynnik krzepnięcia. Czynniki krzepnięcia oznaczamy cyframi rzymskimi i zgodnie z zaleceniami międzynarodowymi unikamy nazw eponimowych, czyli od nazwisk pochodzących, tylko używamy wyłącznie symboli. Czynniki białkowe: pierwsza grupa jest to zespół protrombiny, jest to czynnik II, VII, IX, X. Są to czynniki, które są aktywowane przez witaminę K, to jest zespół protrombiny. Są one produkowane przez wątrobę, a więc w przypadku dysfunkcji wątroby, nawet jeśli jest obecna wit. K to nie powstają. Druga grupa czynników to są czynniki wrażliwe na trombinę, do nich należy czynnik I, V, VIII, XIII. I wreszcie tzw. czynniki kontaktu, do których należy czynnik XI, XII, prekalikreina i wysoko cząsteczkowy kininogen. Pod względem funkcjonalnym część z tych czynników jest białkami enzymatycznymi, a część nie. Mianowicie czynnik V, VIII i wysoko cząsteczkowy kininogen nie są enzymami. Czynnik XIII to jest transglutaminaza, jest to czynnik stabilizujący skrzep, jest to czynnik tworzący wiązanie między resztami epsilon-aminowymi lizyny, występującej w fibrynie, a resztą kwasu glutaminowego, czyli tworzą się też usieciowania wewnętrzne, tak jak było w kolagenie tylko w innym mechanizmie. Pozostałe czynniki krzepnięcia poza czynnikiem I, czyli fibrynogen są proenzymami, są konkretnie proteazami o typie proteaz serynowych. Są cztery klasy proteaz: serynowe, kwaśne, cysteinowe, metaloproteazy i tu akurat mamy do czynienia z proteazami serynowymi. Ciąg dalszy nastąpi.