Wykład II 9. 10.2000

Ostatnim razem doszliśmy do procesu translacji. Zreplikowaliśmy DNA, poddaliśmy go transkrypcji, następnie obróbce prowadzącej do powstania transkryptu i doprowadziliśmy do obróbki posttranskrypcyjnej. Wyprowadziliśmy go z jądra i doprowadziliśmy go do cytoplazmy na rybosomy. Rozpoczyna się pierwszy etap biosyntezy białka, dla większości białek, nie ostatni. Aminokwasy, które wyznaczają pierwszorzędową strukturę białka, nie mają żadnego powinowactwa do kwasów nukleinowych, muszą używać pośrednika, którym jest aminoacylo – tRNA. To są cząsteczki niewielkiego tRNA z połączonym aminokwasem, liczące około 80 nukleotydów, cechujące się występowaniem zarówno miejsc dwuniciowych oraz czterech sekwencji jednoniciowych. Ważne jest to, że występują tu pewne zmodyfikowane zasady (w pętli D występuje dihydrourydyna, w pętli TC rybotymidyna (tymina nie występuje normalnie w RNA) i modyfikacje te występują na etapie posttranskrypcyjnej modyfikacji tRNA. Najistotniejsza jest pętla antykodonowa, która asocjuje odpowiedni kodon znajdujący się w mRNA. Na 3` końcu cząsteczki tRNA następuje przyłączenie aminokwasu, do grupy hydroksylowej adeniny przez swoja grupę karboksylową. Ta struktura nosi nazwę aminoacylo – tRNA. W takiej formie aminokwas zdąża na rybosom aby w konsekwencji procesu translacji utworzyć łańcuch polipeptydowy. 1tRNA uczestniczy w:

• rybosomalnej biosyntezie białka

• u roślin i organizmów Prokariotycznych 1prokariotycznych uczestniczy w syntezie ściany komórkowej

• syntezie chlorofilu

• syntezie fosfoguanozyny

• transporcie aminokwasów

• u bakterii gram – ujemnych bierze udział w syntezie lipopolisacharydów (endotoksyny tych bakterii)

• degradacji białek

• jest primerem odwrotnej transkryptazy (synteza primerów dla polimerazy DNA RNA zależnej)

Możliwość mutacji w tRNA prowadzi do wytworzenia białka supresorowego (tRNA lekceważy kodony nonsensowne stop).

Dla naszych dalszych rozważań ważne są trzy punkty kontaktowe w cząsteczce rybosomu. Miejsce A, P, E. Do miejsca oznaczonego jako A przyłącza się aminoacylo tRNA z wyjątkiem pierwszego. W miejscu P znajduje się peptydylo-tRNA ( tRNA z przyłączonym narastającym polipeptydem). I wreszcie miejsce E , które zajmuje peptydylo-tRNA przed wyjściem z rybosomu. Inicjacja procesu translacji rozpoczyna się od zajęcia przez pierwszy aminoacylo-tRNA, którym u Eukariota jest metionylo-tRNA, a u Prokariota formylometionylo-tRNA. Kodon rozpoznawalny jest ten sam. Ten pierwszy aminoacylo tRNA zajmuje miejsce P, a nie miejsce A. Po zajęciu miejsca P, do miejsca A przyłącza się kolejny aa tRNA (aminoacylo tRNA). Do akcji wkracza enzym transferaza peptydylowa. Jest to enzym syntetyzujący wiązanie peptydowe, które jest tworzone między grupa karboksylową narastającego peptydu a w przypadku pierwszego pomiędzy metionylo-tRNA a grupą aminową przyłączonego w pozycji A aatRNA. Narastanie peptydu następuje od końca N do końca C. Zawsze dawcą grupy karboksylowej jest peptydylo tRNA (w przypadku pierwszego metionylo-tRNA) a dawcą grupy aminowej aminokwas przyłączony w miejscu A do tRNA. W naszym konkretnym przypadku po zadziałaniu transferazy peptydylowej powstał nam dipeptyd zbudowany z metioniny i jakiegoś drugiego aminokwasu, który zajmuje miejsce A rybosomu. Do akcji wkracza kolejny enzym translokaza, przesuwa nasz dipeptydylo-tRNA w miejsce P. Miejsce A ulega zwolnieniu i znowu przyłącza się jakiś aatRNA. Proces ten przebiega do pojawienia się kodonu nonsensownego i wtedy czynniki terminujące translacje doprowadzają do odłączenia powstałego peptydu z rybosomu.

Inhibitory translacji

1. Czynniki hamujące inicjację

1. trimetoprim (spotkaliśmy się z nim ostatnio) inhibitor reduktazy kwasu foliowego, uniemożliwia powstanie FH₄. Grupa formylowa jest przenoszona przez tetrahydrofolian, czyli nie powstaje formylometionylo-tRNA (tylko u bakterii) i nie może rozpocząć się translacja. Poznany już jako inhibitor replikacji, transkrypcji a także inicjacji translacji

2. Antybiotyki aminoglikozydowe (bardzo szeroko stosowana grupa antybiotyków)

Gentamycyna

Tobramycyna

Anitacyna

Hamują inicjacje translacji, co prawda powstaje formylometionylo-tRNA, ale nie może przyłączyć się do rybosomu

1. Czynniki hamujące elongacje

1. Antybiotyki aminoglikozydowe; hamują przyłączanie się kolejnych aatRNA do rybosomu lub powodują błędny odczyt

2. Tetracykliny (doxocyklina znana także wibramycyna) hamuje przyłączanie aatRNA do rybosomu czyli nie może wydłużać się łańcuch polipeptydowy, natomiast nie zaburza procesu inicjacji.

3. Chloramfenikol i cykloheksymid są inhibitorami transferazy peptydylowej, przy czym chloramfenikol działa na rybosom bakteryjny, a cykloheksymid na Eukariota. Chloramfenikol jest bardzo toksycznym antybiotykiem, rzadko obecnie stosowany, głownie w salmonellozach, durze brzusznym, w schigellolozach (czyli czerwonce bakteryjnej) oraz ma silne działanie dla szpiku kostnego. Cykloheksymid nie znalazł zastosowania diagnostycznego, natomiast jest stosowany w badaniach biochemii komórki

4. Antybiotyki makrolidowe, erytromycyna, czy dawercyna oraz toksyna błonicza są inhibitorami translokazy (enzymu umożliwiającego przemieszczenie peptydylo tRNA z miejsca A do P). Działają na rybosom bakteryjny, natomiast toksyna błonicza na rybosom eukariotyczny. Błonica to choroba bakteryjna, wywoływana przez maczugowca błonicy (obecnie choroba ta już nie występuje z powodu masowych szczepień), wydzielana przez niego toksyna uszkadzała miesień sercowy

1. Inhibitory terminacji

1. puromycyna analog tyrozynylo-tRNA i udaje takie tRNA, do którego przyłączana jest tyrozyna, kończy biosyntezę białka

Zsyntetyzowaliśmy łańcuch polipeptydowy, który ulega modyfikacjom wewnątrz i zewnątrzkomórkowym.

Metodologia badania genomu człowieka.

Genom człowieka jest trudny do badania ze względu na jego wielkość (escherichia coli ma 4500 genów, natomiast genom ludzki 80000 genów). Cechy genomu człowieka:

1. gęstość genów (czyli ilość genów przypadająca na jednostkę długości DNA, a tą jednostka długości jest ilość par zasad. Gęsto upakowane są geny w mitochondrium, natomiast w genomie jądrowym geny są rozsiane

2. wielkość genu: różna z reguły od 10 do 15 tysięcy par zasad (kb)

3. odstępy międzygenowe (speceary) w granicach 25 – 30 kb

4. zróżnicowanie w ilości egzonów: są geny proste np. kodujące tRNA zawierające jeden egzon, największy znany gen człowieka zawiera 79 egzonów (największy gen u człowieka kodujący białko dystrofina zwany jako dmd – dystrofia mięśniowa Duchenna) wielkość egzonu wynosi około 70 pz i z reguły zależy od wielkości genu. Największy znany egzon człowieka występuje w genie kodującym białko ApoB – apolipoproteina, białko osocza – wielkość tego egzonu wynosi 7600 pz.

5. Zróżnicowanie w wielkości intronu – jego wielkość zależy od wielkości genu – największy leży w genie dmd i długość jego wynosi 30 000 pz (natomiast całego genu dmd 2 500 000 pz)

Organizacja genomu człowieka. Genom człowieka dzielimy na jądrowy (99%) i mitochondrialny (0,2%), w którym występuje 37 z 80 000 genów. Znacznie mniejsza cześć stanowią geny, które kodują, około 30% to DNA kodujący, pozostała cześć 70% tworzy pozagenowy DNA. W kodującym DNA geny zajmują 10% natomiast większość to sekwencje niekodujące czyli introny. Pozagenowy DNA tworzy tzw, sekwencje unikatowe (80%) a 20% stanowią sekwencje powtórzone. Sekwencje powtórzone dzielimy na dwie frakcje: sekwencje zgrupowane i rozproszone. Warto pamiętać, że geny człowieka maja charakter nieciągły (geny ciągłe w mitochondrium i kodujące histony, oraz większość małych genów, geny niektórych receptorów hormonalnych; receptor dopaminergiczny typy 1 i 5 oraz receptor dla bradykininy typu 2, gen kodujący interferon alfa.

Sekwencje powtórzone dzielimy na sekwencje zgrupowane zwane jako satelity DNA. Jednostka ulegająca powtórzeniu liczy 200 do 5000 pz, nie ma znaczenia w diagnostyce molekularnej (służy do identyfikacji chromosomów) i rozproszone ważne w biochemii zwane jako mini i mikrosatelity. Jednostka powtarzalna to 7 – 100 par zasad. Najbardziej ciekawą strukturą są mikrosatelity obejmujące jednostki powtarzające się od 1 do 6 par zasad, najważniejszym jest sekwencja 3 – 4 par zasad powtórzeń, funkcja nie znana, występują poza genami, nie kodują białka, ale mogą ulec transkrypcji z genem, możliwość funkcji; stabilizacja transkryptu, przed działaniem enzymów nukleolitycznych. Metodologią do badania mikrosatelitów jest technologia STR (Short Tandem Repet, krótkie powtórzenia tandemowe). Służą do diagnozowania mutacji genowych (w wyniku ich sprzężeń z genem wyłącznie na podstawie sekwencji mikrosatelity). U niektórych osób mikrosatelity mogą zanikać, jednostką chorobową w której bada się polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych jest rak jelita grubego (jelito usiane polipami – stan przedrakowy polipy ulęgają transformacji nowotworowej). Ryzyko wystąpienia tego zaburzenia można określić badając krótkie sekwencje tandemowe.

Badania DNA kodującego

Problem w badaniach wynika z małej ilości DNA w komórce. Najstarszymi (nadal używanymi) jest badanie DNA niezamplifikowanego. Mało materiału więc musi istnieć wzmacniacz, który wykrywa tę cząsteczkę DNA. Musimy uciec się do hybrydyzacji związanej ze strukturą sondy molekularnej. Sonda molekularna jest znakowana, jeśli napotka komplementarny fragment łańcucha polinukleotydowego następuje przyłączenie się do łańcucha. Dawniej używane były izotopy promieniotwórcze jako znaczniki, wykrywane następnie metoda autoradiografii i sprawdzano na kliszy fotograficznej, czy dany fragment genu został wykryty czy tez nie. Obecnie używane znaczniki to znaczniki fluororescencyjne, co nie wymaga używania promieniowania jonizującego. Postęp rozwoju diagnostyki molekularnej był możliwy dzięki rozwojowi techniki zwanej amplifikacja DNA, co pozwala na uzyskanie DNA w ogromnej ilości kopii. Może ona być stosowana in vivo (klonowanie), do tego celu naszymi niewolnikami są bakterie, które tresujemy w taki sposób, aby z własnym chromosomem bakteryjnym replikowały w kolejnych cyklach wprowadzony przez nas DNA w formie wektora plazmidowego (bakteria odtwarza nasze DNA).

Metoda PCR (amplifikacja genu in vitro – reakcja łańcuchowej polimerazy -- Polimerase Chain Reaction). Pierwszy etap to hybrydyzacja sondą molekularną. Dawnej stosowane były metody hybrydyzacji w roztworach. Obecnie stosuje się metody stałe. Pieśń ostatnich lat to technika FISH (Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ), co oznacza, że celem przeprowadzenia reakcji nie musimy izolować DNA z komórki, tylko operować preparatem cytologicznym działamy sondą molekularną, która na poziomie chromosomu wykrywa allel lub sekwencję poszukiwaną i informuje nas o tym świecąc.

Hybrydyzacja informizowanego DNA (technika zwana blotting). Blotting to transfer DNA na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy i związane są z tym trzy pojęcia (2 związane z transferem kwasów nukleinowych a jedno z transferem białek)

1. Northern blotting (materiałem przez nas poszukiwanym jest RNA, przenoszony na odpowiedni filtr i następuje hybrydyzacja sondą molekularną, którą jest znakowany DNA. Skoro mamy mRNA to wiemy że mamy transkrypt, ale chcemy się dowiedzieć, czego to jest transkrypt (szukamy odpowiedzi na pytanie jakiego genu nastąpiła ekspresja)

2. Southern blotting to technika w której izolujemy na filtrze DNA i hybrydyzujemy go również sondą DNA (badanie prowadzimy na genie) jest to technika szeroko stosowana min. w celach identyfikacji osób. Proces i obróbka prowadzi do powstania prążków, które są rozpoznawane metodą autoradiograficzną. Technika używana w analizie osobniczej jako Finger Priting (badanie typu odcisk palca), każdy ma charakterystyczny układ prążków.

3. Western blotting to technika polegająca na przeniesieniu na podłoże stałe rozdzielonych elektroforetycznie białek, ale na podstawie masy cząsteczkowej nie można odpowiedzieć co to jest za białko, faktycznym badaniem jest zadziałanie przeciwciałem monoklonalnym wykrywającym daną sekwencję aminokwasową (brak hybrydyzacji) – to nie technika badania kwasów nukleinowych

Metody amplifikacja DNA

1. Metoda klonowania (nie zajmujemy się tym na biochemii – celem jest uzyskanie całego fragmentu genu, lub całego genu). DNA wkładamy w plazmid, plazmid w bakterie która w czasie kolejnych podziałów odtwarza nasz fragment DNA, wyciągamy go następnie z bakterii, oczyszczamy z białka i uzyskujemy pochodne (insulinę, czy inne hormony).

2. Technika PCR ograniczenie techniki PCR polega na ograniczeniu fragmentu amplifikowanego DNA do 5 kb (5000 par zasad), W laboratorium wykorzystujemy urządzenie zwane termoblokiem (do obejrzenia na ćwiczeniach). Technika nagrodzona nagrodą Nobla w 1993 pan Mullis

Etapy PCR

1. Wyizolowanie DNA (wystarczy DNA z jednej komórki) w przeciwieństwie do technik hybrydyzacyjnych wystarczy 50 do 100 razy mniej DNA

2. Denaturacja w komórce odbywa się podobnie jak proces katalizowany przez enzymy, my wykorzystujemy temperaturę. Konieczna jest znajomość sekwencji nukleotydów w amplifikowanym fragmencie genu

3. Wprowadzenie primera (fragmenty składające się do 30 nukleotydów), by przyłączyły się do DNA musimy znać sekwencję flankującą. Konieczne są dwa startery, enzym: polimeraza DNA i cegiełki czyli trójfosforany dezoksyrybonukleotydów, odpowiedni bufor.

4. Zwielokrotnienie analizowanego DNA (amplifikacja), który można wykryć techniką elektroforetyczną albo spektrofotometr „4gene qant” które pokazuje nam ile powstało zamplifikowanego DNA.

Denaturacja 4następuje podczas ogrzewania w 95⁰C, wtedy nici DNA oddzielają się do siebie i w procesie anilingu następuje dołączanie starterów. Każdy DNA ma określoną temperaturę topnienia i temperatura anilingu jest eksperymentalnie dobierana, wynosi 5 stopni mniej od temperatury topnienia. Temperatura denaturacji zależy od długości łańcucha, im łańcuch dłuższy tym więcej energii potrzeba, od składu zasad czyli procentowego udziału par GC (para GC jest związana trzema wiązaniami wodorowym więc należy więcej dostarczyć energii, im więcej par GC, tym temperatura topnienia wyższa), od środowiska chemicznego. Głównym czynnikiem stabilizującym są jony sodu, natomiast czynnikiem destabilizującym jest głównie mocznik.

Głównym produktem reakcji PCR jest nasz zamplifikowany materiał z niewielką domieszką niewłaściwie wydłużanych sekwencji DNA. Jakie jest ograniczenie tej metody: musimy znać sekwencje genów flankujące (co nie jest potrzebne w klonowaniu), wielkość amplifikowanego fragmentu DNA (nie może przekraczać 5000 par zasad), polimeraza popełnia błędy (po dwudziestu obrotach reakcji PCR w 40% zamplifikowanych tam odcinków DNA są błędy. Dlaczego tak się dzieje: polimerazy DNA -poza dwoma- nie posiadają aktywności 3`- 5` nukleazy, która sprawdza, czy nukleotyd został wprowadzony poprawnie, ale ponieważ w kolejnych cząsteczkach DNA, zbudowanie nieprawidłowego nukleotydu następuje w sposób losowy, a nie w miejscu nieprawidłowego, dlatego w dalszej analizie sekwencyjnej nie ma to większego znaczenia, ale częstość pomyłek jest w PCR bardzo duża. Najbardziej historyczną polimerazą w PCR jest fragment Klenowa polimerazy I, ale ten enzym ma to ograniczenie, że jest enzymem ternmolabilnym, a ponieważ reakcje przeprowadzamy w zmiennej temperaturze, dochodzącej do 95 stopni, to czasem dochodziło do denaturacji enzymu, który trzeba było uzupełniać (duże koszty). Wykorzystano polimerazy pochodzące z organizmów żyjących w gorących wodach “Thermus aquiticus”, tą najczęściej używaną polimerazą jest polimeraza TAQ. Inne używane są rzadziej; polimeraza VENT i TRU niestety bardzo kosztowne posiadające aktywność 3`-5`, czyli sprawdzają, czy prawidłowo włączyły nukleotyd do syntetyzowanej nici, natomiast korzyścią zastosowania polimerazy BSD jest możliwość syntetyzowania bardzo długich łańcuchów dochodzących do 7000 par zasad.

Co robimy jeśli nie mamy pieniędzy na polimerazę BSD a sekwencja nukleotydów jest bardzo duża, to wtedy amplifikujemy poszczególne fragmenty genu, dzieląc je tak, by zachodziły one na siebie, w ten sposób można zamplifikować bardzo długi fragment (do badań)

Zastosowanie techniki PCR:

1. wykrywanie mutacji

2. diagnostyka molekularna

Metody używane w wykrywaniu mutacji dzielimy na dwie kategorie: pierwszej używamy jeśli szukamy nieznanej mutacji, metody screningowe, które maja odpowiedzieć na pytanie czy w analizowanym genie wystąpiła mutacja, jeśli mutacja zaszła, musimy odpowiedzieć na drugie pytanie, na czym dana mutacja polega, czyli ją identyfikujemy, i jeśli ona często występuje to wyszukujemy nowej, taniej metody do wyszukiwania tej mutacji w całej populacji (wtedy w badaniu pomijamy screnning)

Metody używane w diagnostyce mutacji (najważniejsze):

1. PCR HD

2. PCR SSCP

3. PCR DGGE

Dwie następne rzadko wykonywane PCR CCB, PCR PTT oraz sekwencjonowanie (do obejrzenia na filmie)

PCR HD (PCR heteroduplex) po reakcji PCR doprowadzamy do denaturacji produktu PCR, a następnie doprowadzamy do renaturacji, nici łącza się ze sobą w sposób losowy. Jeśli osoba jest heterozygotą (czyli w jednym genie wystąpiła mutacja) wówczas może mieć następujące możliwości; albo połączą się dwie nici prawidłowe, albo połączą się dwie nici zmutowane, trzecia możliwość to możliwość połączenia się jednej nici prawidłowej i jednej zmutowanej: ta możliwość to heteroduplex. Mieszaninę poddajemy elektroforezie, obserwujemy tu, że heteroduplexy najwolniej migrują w polu elektrycznym. Ograniczenie metody: jeśli fragmenty maja powyżej 200 pz, to skuteczność metody ulega obniżeniu, przy 200 pz dokładność wynosi 95%, wykrywa mutacje punktowe ale nie wykrywa miejsca mutacji, jeśli mamy do czynienia z homozygota zmutowaną, to by tę mutację wykryć do układu musimy wprowadzić zmodyfikowany allel dziki, w ten sposób powstaje możliwość wystąpienia heteroduplexu (bo w warunkach homozygoty elektroforeza odbywa się z jednakową szybkością).

PCR SSCP (PCR single strand conformation polymorphism) czyli polimorfizm fragmentów jednoniciowych. Mamy zamplifikowany produkt, który poddajemy denaturacji uzyskując fragmenty jednoniciowe, które są rozdzielane elektroforetycznie w warunkach żelu niedenaturującego. Nasze fragmenty w tych warunkach mogą wykazywać pewne wewnętrzne sparowania, jeśli nastąpi tu mutacja, to konformer przyjmie inną konformację, w związku z czym w warunkach żelu niedenaturującego jego ruchliwość elektroforetyczna, będzie zależała od dwóch czynników; masy cząsteczkowej i konformacji przestrzennej (zastosowanie żelu denaturującego z dodatkiem mocznika to następuje zerwanie wiązań wewnętrznych a ruchliwość wewnętrzna zależy wtedy tylko od masy cząsteczkowej, tak w przypadku mutacji punktowej ulega tylko niewielkiej zmianie). Jeśli ulega wypadnięciu duża część naszego genu to wpływa znacznie na masę cząsteczkową, to do takiej metody nie musimy się uciekać, tylko dokonujemy zwykłej elektroforezy. Właściwości podobne do heteroduplex, wielkość do 200 par zasad, wykrywa mutacje punktowe i nie wykrywa miejsca mutacji

PCR DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis) elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego. Fragmenty dwuniciowe rozdzielamy elektroforetycznie, a żelu wytwarzamy gradient, chemiczny lub temperaturowy. Nasz fragment dwuniciowy wędruje tak długo, aż natrafi na takie stężenie czynnika denaturującego, który sprawia, że nici denaturujące się oddzielają i wtedy fragment dalej nie wędruje. Jeśli nastąpi mutacja, to wtedy nasz fragment zatrzymuje się w innym punkcie niż się to dzieje bez mutacji. Jest trudniejsze do wykonania niż inne badania.

Kolejna metoda jest kosztowna, nie używana powszechnie a jej zalety: można analizować znacznie większe fragmenty do 1000 par zasad i dalej można się zorientować w którym miejscu nastąpiła mutacja. W skrócie jest to CCM czyli chemical climage of mismatches czyli chemiczne trawienie miejsc zmutowanych. Jeśli nastąpiła w danym punkcie mutacja to można to miejsce chemicznie zmodyfikować i chemicznie strawić. Wiedząc jaka jest ruchliwość elektroforetyczna fragmentu można powiedzieć w którym miejscu wystąpiła mutacja. Metoda rzadko stosowana

Ostatnia metodą (niestosowana: cena i eksperymenty) jest metoda PTT (proteine translation test) wykrywająca białka niekompletnie syntetyzowane wskutek wystąpienia w DNA mutacji nonsensownej. Nasz wyizolowany DNA przepuszcza się w układzie in vitro przez syntetyczny układ transkryptyczno – translacyjny. W wyniku tego z naszego DNA otrzymujemy w układzie in vitro białko i analizując go pod względem determinant antygenowych i masy cząsteczkowej możemy stwierdzić, czy białko powstało w wyniku mutacji, czy tez nie.

Sekwencjonowanie (skoro wiemy, że wystąpiła mutacja określamy kolejność zasad). Dwie metody:

1. chemiczna – Maxama Gilberta (nie stosowana)

2. dideoksy czyli metoda Sangera:

1. przygotowuje się mieszaninę inkubacyjną-która zawiera;matrycę w postaci jednoniciowego DNA, starter, polimerazę DNA I oraz wszystkie cztery trifosforany deoksyrybonukleotydów, z których jeden jest znakowany radioaktywnie.

2. mieszaninę dzieli się na cztery porcje i do każdej z nich dodaje jeden z 4 dideoksyrybonukleozydów

3. podczas inkubacji polimeraza DNA rozpoczyna kopiowanie cząsteczek matrycy wydłużając związany z nią starter.

4. po inkubacji uzyskuje się 4 zestawy łańcuchów kończących się odpowiednim analogiem dideoksy w miejscach wyznaczonych przez dystrybucję C, T, A lub G w matrycy

5. produkty każdej z mieszanin inkubacyjnych poddaje się elekroforezie w czterech równoległych ścieżkach żelu poliakrylamidowego a następnie autoradiografii

6. sekwencję DNA określa się przez proste odczytanie obrazu pasm na autoradiogramie, poczynając od końca żelu do jego początku( tzn odczytując sekwencję DNA w tym kierunku, w jakim ona powstaje poczynając od startera)

7. sekwencja odczytana bezpośrednio z żelu jest sekwencją łańcuchów nowo syntetyzowanych. Sekwencja ta jest komplementarna do sekwencji wyjściowej matrycy DNA

Wiemy już na czym polega mutacja. Mamy 1000 osób do przebadania na obecność mutacji. Nie używamy wtedy powyższych technik (zastosowanie techniki kosztowne). Mamy tu kilka metod:

1. PCR RFLP

2. PCR ASO

3. PCR ARMS

4. OLA

PCR RFLP korzysta z enzymów restrykcyjnych: endonukleazy restrykcyjnej, znajdującej się naturalnie u bakterii i chroniące je przed bakteriofagami, których jest kilka tysięcy a używanych jest kilkaset, każda sekwencja DNA, ma swoją endonukleazę, bakteryjne DNA nie jest cięte ze względu na obecność metylaz, enzymy te nie trawią jakichkolwiek miejsc, tylko miejsca zwane palindronowymi o podwójnej rotacji symetrii i co ważne trawią obydwie nici. W wyniku trawienia powstają fragmenty restrykcyjne, których obraz jest charakterystyczny dla danego genu, inny ma obraz gen zmutowany, inny niezmutowany bo w wyniku mutacji pewne miejsca restrykcyjne mogą zniknąć, a inne powstać. Miejsce cięcia przez endonukleazy może być prowadzone przez oś symetrii (powstają tępe końce) lub jeśli przez podwójną oś rotacji końce lepkie (możliwość połączenia go z innym genem). W rozdziale elektroforetycznym mutant homozygotyczny charakteryzuje się dwoma prążkami, a nie jak w niezmutowanym jednym, jeśli mutant jest heterozygotą powstają trzy prążki.

PCR ASO allel specific oligonukleotyde. Mamy dwa allele (allel dziki i drugi allel zmutowany), które znakujemy sondą molekularną specyficzną dla któregoś z alleli, a najlepsze są miejsca w środku oligonukleotydu do znakowania. Następnie szybkie oddysocjowanie naszego oligonukleotydu i nie można rozpoznać miejsca mutacji, miejsce rozpoznajemy za pomocą znakowanego izotopu fluorescencyjnego. Technika szeroko stosowana.

PCR ARMS (amplification refractory mutation system) mutacja prowadzi do niemożności wykonania PCR. Jeśli nastąpiła mutacja stosowany starter nie rozpoznaje miejsca rozpoczęcia (sekwencji flankującej), wybieramy startery rozpoznające tylko jeden z allelów.

OLA (oligonukleotyce ligation assay) wybieramy dwa fragmenty DNA (nazwijmy je sondami), które muszą komplementować z wybieranym przez nas miejscem, są one sprzężone z odpowiednim markerem np. enzymatycznym i w tym układzie musi mieć ligazę, jeśli wszystko jest w porządku następuje przyłączenie fragmentów oligonukleotydowych, i procesy prowadzące do powstania produktu – wtedy zgłasza się sygnał, że wszystko jest OK. Jeśli nastąpiła mutacja punktowa, brak produktu – sygnału nie ma.

Metody powyższe są szczególnie przydatne w chorobach długo rozwijających się np.: gruźlicy. Hodowla prątka trwa bardzo długo., zamplifikowanie jego DNA po kilkunastu godzinach możliwe jest postawienie diagnozy (hodowla trwa 6 tygodni)

Synteza genów (tym zwykle zajmuje się biotechnologia i przez to enzymów, hormonów, oraz synteza całych genów którymi możemy zastąpić geny zmutowane – terapia genowa)

Odmianą techniki PCR jest technika RTPCR 9restriction – site generating PCR) co jest podobne do Nothern blootingu. Mamy tu mRNA, który amplifikujemy, czyli amplifikujemy transkrypt.

Geny w onkogenezie. Dzielimy je na trzy kategorie:

Onkogeny – takie geny, które stymulują proliferacje komórek, pod wpływem aktywacji protoonkogenów komórka w sposób niepohamowany zaczyna polimeryzować

Antyonkogeny lub geny supresorowe, stymulują zatrzymanie komórki w fazie międzypodziałowej.

Geny mutatorowe, które normalnie biorą udział w naprawie DNA, dbają o integralność genomu, ich uszkodzenie prowadzi do rozwoju nowotworów.

Badanie onkogenów od lat 20 naszego wieku, kiedy stwierdzono, że wirusy mogą powodować nowotwory. Pierwszym odkrytym genem był gen SRC (mięsaka Roussea). Tylko retrowirusy posiadające onkogeny są w stanie wywołać transformacje nowotworową komórki (niektóre retrowirusy nie posiadają onkogenów jak np. HIV, atakują limfocyty T helper ale nie wywołują transformacji nowotworowej). Onkogeny retrowirusów żywo przypominają geny człowieka i zwierząt (onkogeny nie są potrzebne wirusowi, potrzebuje on genów kodujących kapsyd, czynniki transkrypcyjne i odwrotną transkryptazę, zaś onkogen nie jest potrzebny). Ważnym jest onkogen HPV6 wywołujący raka szyjki macicy, wirus Epsteina-Bar wywołujący mononukleazę zakaźną, ale jest czynnikiem powodującym raka nosogardzieli (w naszym klimacie), zaś w klimacie równikowym wywołuje złośliwego chłoniaka Burkitta (zależnie od tego jak asocjuje z genomem gospodarza). Wirusy ostrotransformujące – są to wirusy onkogenne posiadające onkogeny. To co występuje u wirusa to onkogen, to co występuje u nas w formie prawidłowej to protoonkogen.

Onkogeny występujące w formie wirusa są poprzedzone literką v, a onkogeny u człowieka literką c (cellular). Są to geny zaangażowane w różne etapy proliferacji, różnicowania i odpowiedzi komórki na różne sygnały (transdukcja sygnału i proliferacja komórki). Są to geny kodujące czynniki wzrostu np. onkogen sis, kodujące receptory powierzchniowe dla czynników wzrostów lub hormonów: gen ErbB - kodujący receptor powierzchniowy, grupa genów kodujących białka RAS dla transdukcji sygnału komórkowego, geny kodujące czynniki transkrypcyjne np. onkogen sis kodujący PDGF, onkogen ras wywołujący u szczurów mięsaka, onkogen adl u myszy wywołuje białaczkę, gen fos wywołujący mięsaka kości u myszy, u człowieka kodujący kinazę tyrozynoswoistą podobnie jak adl.