• Sprawozdanie

Frakcjonowanie komórki

Zestaw 2

Wykonali:

--------------- Ocena 4,5

Ćwiczenie 1: Izolacja chloroplastów i tylakoidów

Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia było zapoznanie się z podstawowymi metodami frakcjonowania komórki przy użyciu homogenizacji, wirowania oraz wirowania w gradiencie sacharozy. Podczas ćwiczenia wyizolowaliśmy chloroplasty z liści groszku i sprawdziliśmy ich aktywność.

Wykonanie ćwiczenia:

1. Masa liści (z siewek grochu) użytych do ćwiczenia: 54,84 g

2. Przygotowanie wymaganych roztworów:

• buforu do homogenizacji,

• buforu do płukania,

• 52% roztworu sacharozy,

• 30% roztworu sacharozy,

nastąpiło zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w skrypcie.

1. Cała preparacja ćwiczenia została wykonana zgodnie ze skryptem.

2. Zdjęcie probówki z gradientem sacharozy przed wirowaniem:
   

3. Zdjęcie probówki po wirowaniu:

1. Przygotowaliśmy preparat składający się z 1ml DCIP, 1,5ml wody dejonizowanej i 0,5ml odwirowanych chloroplastów.
   DCIP jest akceptorem wolnych elektronów – zatem, jeżeli odwirowane i odseparowane tym sposobem chloroplasty pozostały aktywne, po umieszczeniu ich w inkubatorze powinny przeprowadzać fotosyntezę (z wykorzystaniem światła i wody), a uwalniane w ich trakcie elektrony odbarwiłyby roztwór DCIP, który charakteryzuje się dużym powinowactwem elektronowym.

2. Reakcja redukcji DCIP:

3. Po kilkudniowej inkubacji w świetle roztwór odbarwił się.
   
   Wniosek:
   
   DCIP zredukował się, zatem preparat po odwirowaniu został aktywny.

Pytanie teoretyczne:

Co wpływa na rozdział cząsteczek biologicznych podczas wirowanie różnicowego, uwzględniając właściwości cząsteczek jak i roztwór, w którym wirujemy?

Wirowanie różnicowe pozwala na rozdzielenie cząstek o gęstościach własnych (q_cz) większych niż gęstość ośrodka (q_o) są równomiernie rozproszone w zawiesinie i wirowane najczęściej w rotorach kątowych lub horyzontalnych, a rozdział cząsteczek prowadzony jest ze względu na różnicę w S poszczególnych cząstek. Cząstki przemieszczają się z różną prędkością do dna probówki, co zależy od:

• Masy cząsteczki;

• Objętości cząsteczki;

• Kształtu cząsteczki.

A także właściwości ośrodka:

• Gęstość;

• Lepkość;

• Temperatury.

Po wirowaniu zauważamy dwie frakcje: pellet oraz supernatant. Jednak osad często zanieczyszczony jest lżejszymi cząsteczkami, co wynika z lepkości większych cząstek, które podczas wirowania „ciągną” ze sobą lżejsze. Aby uzyskać czysty interesujący nas osad przeprowadza się przemywanie osadów.