GENETYKA 10 PAŹDZIRNIKA 2009

ĆWICZENIA 1

LITERATURA:

Podstawy genetyki dla studentów i lekarzy. 2003r Gerard Greda, Tomasz Ferentz

Genetyka Molekularna. Piotr ..

Genetyka medyczna. Bradley

Genetyka medyczna. Jorge

CYTOGENETYKA CZĘŚĆ 1

1. Omówienie regulaminu ćwiczeń.

2. Metody uzyskiwania chromosomów

3. Metody prążkowego wybarwiana chromosomów (G, Q, R, C)

4. Układania prawidłowego kariogramu człowieka

Fleming odkrył chromosomy, które znajdują się w jądrze.

Baldej- termin chromosom.

46 chromosomów- komórka człowieka.

Kariotyp- zestaw chromosomów komórki somatycznej charakterystyczny dla danego osobnika. Charakterystyczny dla gatunku pod względem struktury i liczby.

Kariogram- zestaw chromosomów danej komórki somatycznej osobnika, przedstawiony graficznie uporządkowany według określonych międzynarodowych zasad.

Budowa chromosomu

Chromosom – forma organizacji materiału genetycznego wewnątrz komórki. Nazwa pochodzi z greki, gdzie χρῶμα (chroma, kolor) i σῶμα (soma, ciało). Chromosomy rozróżniano poprzez wybarwienie.

Chromosomy występują w formie mikroskopijnej struktury najlepiej widocznej w metafazie podziału komórkowego, kiedy to są najbardziej skondensowane. Chromosomy są zbudowane z dwóch chromatyd siostrzanych (podłużnych jego części) połączonych w jednym punkcie centromerem (wyjątkiem są chromosomy powstałe po pęknięciu centromeru w trakcie podziału jądra komórkowego - pod koniec metafazy). U organizmów prokariotycznych chromosom stanowi pojedyncza, kolista cząsteczka DNA, natomiast u organizmów eukariotycznych liniowa cząsteczka DNA. Każda cząsteczka DNA buduje jedną chromatydę. Zarówno u prokariotów, jak i eukariontów chromosomy zbudowane są z kompleksu DNA i białek histonowych lub histonopodobnych (u prokariotów). W komórkach organizmów prokariotycznych i niektórych eukariotycznych (drożdże, pierwotniaki) występują również nieosłonięte, koliste cząsteczki DNA zwane plazmidami.

U organizmów eukariotycznych chromosomy z obu stron zakończone są powtarzającą się sekwencją nukleotydów tworzących telomer. Skracanie telomerów podczas podziałów komórki być może prowadzi do starzenia się komórki.

Locus (l. mnoga loci; czyt. lokus, loci) to miejsce na chromosomie gdzie zlokalizowany jest gen.

Struktura chromosomu nie jest niezmienna, podlega on bowiem zmianom zwanym mutacjami. Mutacje dotyczące bezpośrednio chromosomów to aberracje chromosomowe lub mutacje genomowe.

Chromosomy dzielą się na autosomy - zawiadujące dziedziczeniem cech nie sprzężonych z płcią, oraz chromosomy płciowe - czyli allosomy lub heterosomy, których obecność przejawia się u konkretnej płci i w wielu przypadkach determinuje ją.

Liczba chromosomów może być różna (np. 1 para) aż do 100 par, ale zazwyczaj wynosi kilka do kilkudziesięciu par (4 pary u muszki owocowej, 20 par u myszy, 23 pary u człowieka, 24 pary u szympansa, 39 u psa). Liczba autosomów jest cechą charakterystyczną gatunku, a jej fluktuacje prowadzą do powstawania nowych gatunków (patrz: specjacja).

Komórki mogą być:

• haploidalne - zawierać pojedynczą kopię każdego z autosomów oraz kopie allosomów (chromosomów płciowych) własnej płci.

• diploidalne - zawierać podwójną i większą kopię każdego z autosomów oraz kopie allosomów własnej płci.

U gatunków rozmnażających się bezpłciowo każda komórka organizmu ma tę samą liczbę chromosomów.

U gatunków rozmnażających się płciowo występują komórki zarówno haplo- jak i diploidalne. W przypadku wielu organizmów, w tym zdecydowanej większości kręgowców, liczba chromosomów w komórkach somatycznych jest dwa razy większa (diploidalna) niż w gametach (haploidalna). Do powstania haploidalnych gamet dochodzi w wyniku mejozy. Podział komórek somatycznych (diploidach) zachodzi na drodze mitozy, w której najpierw dochodzi do podwojenia materiału genetycznego.

W przypadku innych organizmów, takich jak np. rośliny lądowe, występuje przemiana pokoleń - pokolenie haploidalne występuje po pokoleniu diploidalnym. Są one przeważnie bardzo od siebie odmienne.

Innym przypadkiem są błonkówki, u których samice są diploidalne, a samce haploidalne.

Ze względu na położenie centromeru wyróżnia się chromosomy:

• metacentryczne

• submetacentryczne

• akrocentryczne

• telocentryczne

Chromosomy człowieka

U człowieka występują 22 pary autosomów (ponumerowanych od największego do najmniejszego) i 1 para chromosomów płciowych (u kobiet złożona z dwóch chromosomów X, u mężczyzny z chromosomu X i chromosomu Y). Ponadto w ludzkich komórkach znajduje się jeszcze DNA mitochondrialne, mieszczące się w mitochondriach. Wszystkie ludzkie chromosomy zostały zsekwencjonowane w ramach projektu poznania ludzkiego genomu. Mutacje genomowe powodują zaburzenia genetyczne lub zespoły chorobowe, takie jak zespół Downa, zespół Turnera, zespół Klinefeltera i inne.

W kariotypie człowieka nie występują chromosomy teocentryczne

Metody hodowli chromosomów - z każdej komórki, która zawiera jądro można wyhodować chromosom.

Hodowla z:
Limfocytów krwi obwodowej
fibloblastów skóry
szpiku
komórki z biopsji cienkoigłowej
komórki kosmówki
z tkanek nowotworowych

Metody hodowli limfocytów z linii obwodowej
Pobranie krwi w warunkach sterylnych, na antykoagulantach żeby nie zgęstniała, dorośli 2-300 ml. Noworodek kilka kropel:
* makrohodowla
* mikrohodowla

Odstawiamy krew na 2h do sedymentacji (oddzielania się osocza)

Podłoże hodowli:

Podstawowy płyn hodowlany pełni funkcję ochronną.

HODOWLA KOMÓREK
Szpik kostny, limfocyty krwi obwodowej oraz fibroblasty z płynu owodniowego.
Jeśli chodzi o hodowle to szpik kostny jest tkanką o dużej aktywności mitotycznej. Zaletą tej tkanki jest szybkie uzyskanie wyniku. Hodowla wynosi 24-48h ale ta hodowla ma wiele wad:
o         Bolesne pobieranie szpiku
o         Trudność w pobieraniu materiału (2-3 krotne)
Rutynowo hodowlę zakładamy na limfocytach krwi obwodowej – dodaje się mukoprotein tj. wyciąg z fasoli, który pobudza limfocyty do podziałów.
Jeśli chodzi o hodowlę limfocytów to mamy dwie metody:
Metoda – makro
                Pobieramy 5-10ml krwi, izolujemy limfocyty przez wirowanie lub  sedymentację
Metoda – mikro
                Pobieramy jałowo 5ml krwi żylnej strzykawką przepłukaną heparyną (r.roboczy) i przelewamy do buteleczki zawierającej 0,5ml heparyny (100j.) ostrożnie, dokładnie mieszamy. Nastawiamy równolegle dwie hodowle. Czas hodowli wynosi 48-96h przeciętnie 72h . Wadą tej metody jest: ograniczona zdolność limfocytów do wzrostu i nie można drugi raz wrócić trzeba zaczynać od nowa. Najlepiej wykonać ze świeżej krwi.
POSTĘPOWANIE
Do każdej buteleczki dodajemy: 7ml podłoża Eagle’a MEM – RPMI, 0,5ml krwi żylnej, 2ml surowicy płodowej, 0,5ml Fazeoliny (wyciąg z fasoli) lub Kalchicyna (alkohol pochodzenia roślinnego) lub związki syntetyczne: Kolcemid (odczynnik temp. 37oC) 72h - 37oC na 1/2h przed zakończeniem hodowli dodać Colcemid (Kolchina) 0,2ml na całą hodowlę i ponownie wstawić do cieplarki (dodaje się celem zahamowania mitozy). Hodowlę 2-3x dziennie mieszać. Sterylizować.
PREPAROWANIE
Hodowle dokładnie wymieszać i przelać do probówki wirówkowej
Wirować przez 20 min – 1500 obrotów/min
Osad delikatnie i bardzo dokładnie rozbić przez wytrząsanie
Nadsącz usunąć pipetą pasterowską
Dodać strumieniem 8-10ml roztworu hipotonicznego 0,075M KCl i wytrząsać kilkakrotnie probówkę
Wstawić ponownie do cieplarki na 30min
Wirować ponownie przez 20min - 1500 obrotów/min
Usunąć nadsącz
Osad delikatnie i dokładnie rozbić
Dodać kroplami 5-8ml roztworu Carnoy’a (utrwalacz)
Odstawiamy zaw.probówki na 15min w temp. pokojowej
Wirować 20 min – 1500 obrotów/min
Stosować 2-3 krotną zmianę utrwalacza dodając po 5ml r.Carnoy’a i wirować 15 min – 1500 obrotów/min
Usuwamy osad delikatnie rozbić (wytrząsarka) i wykładać na zimne (z zamrażalnika) odtłuszczone szkiełka podstawowe kroplami z dużej wysokości, dmuchając by chromosomy dobrze się rozproszyły na szkiełku. Suszymy.
Barwimy 20% roztworem Giemsy 3-4min (otrzymujemy chromosomy bez prążków)
Suszymy na powietrzu a następnie przykrywamy szkiełkami nakrywkowymi z DPX-em.
Wykonujemy 6 szkiełek, liczymy 13 mitoz z tym, że 3 tylko fotografujemy.
               

Choroby genetyczne – zgodnie z prawem Mendla
-          choroby spichrzowe – ganchera (ciała tłuszczowe)
-          ch. Gierkego – magazynowanie glikogenu
-          fenyloketonuria – ciężkie uszkodzenie mózgu
-          galaktozemia
-          mukowiscydoza ( produkcja gęstego śluzu, zapychanie przewodów)
-          hemofilia A, hemofilia B

Choroby chromosomalne
-          mongolizm – zespół Down 1:700
-          zajęcza warga
-          rozszczep podniebienia i wargi
-          wady serca, zwichnięcie stawów biodrowych
-          głuchota, Stwardnienie guzowate mózgu, pląsawica, karłowatość
     Niektóre choroby dziedziczne są sprzążone z płcią tzw. przenoszą się przez geny znajdujące się w chromosomach płciowych daltonizm (x), hemofilia, nadmierne rogowacenie skóry X, zespół Noona (Nuna) 1:1000wada serca – zarośnięcie tętnicy płucnej, zespół Blooma (Bluma).
Zespół Klinefertera – rodzaj obojnactwa, zaburzenie rozwoju płciowego
Zespół Tűrnera (brak chromosomu X).

Ogólna informacja o prawidłowym kariotypie i chromosomach.

W każdej komórce somatycznej człowieka znajduje się 46 chromosomów
(22 pary autosomów i jedna para chromosomów płci: XX u kobiety, XY u mężczyzny). Chromosomy zostały sklasyfikowane według wielkości i położenia centromeru. Stosując rozmaite techniki prążkowe można uzyskać charakterystyczny dla danej pary chromosomów wzór prążkowy.

Aberracje chromosomowe

Ok. 0,6% dzieci rodzi się z aberracją chromosomową. Udział aberracji chromosomowych w patologii rozrodu jest jednak znacznie większy: aberracje chromosomowe występują u 50-60% samoistnie poronionych zarodków ludzkich oraz w ok. 5% martwych urodzeń.
Zmiany materiału genetycznego w aberracjach chromosomowych są największe ilościowo, widoczne w mikroskopie świetlnym. Można wyróżnić aberracje liczby oraz aberracje struktury chromosomów. Aberracje liczby chromosomów to triploidia (69 zamiast 46 chromosomów), trisomia (dodatkowy chromosom w danej parze chromosomów), monosomia (tylko jeden zamiast dwóch chromosomów w danej parze). Do niedoboru lub nadmiaru materiału genetycznego prowadzą także aberracje struktury chromosomów: delecje i duplikacje fragmentów chromosomów, izochromosomy i chromosmomy pierścieniowe. Z kolei w przypadku zrównoważonych translokacji robertsonowskich i wzajemnych oraz inwersji, materiał genetyczny zmienia położenie, ale ilościowo nie ulega zmianie. Odrębny problem to występowanie tzw. chromosomów markerowych, tj. małych dodatkowych chromosomów o trudnym do identyfikacji materiale genetycznym, stanowiących zarazem aberrację liczby i struktury chromosomów.
W przypadku kariotypu niezrównoważonego mamy zatem do czynienia z niedoborem lub nadmiarem wielu (dziesiątek, setek a nawet tysięcy) genów, z których każdy jest prawidłowy. Przy tak dużych ilościowych zmianach materiału genetycznego skutki dla fenotypu są zawsze poważne, zwłaszcza jeśli niezrównoważenie materiału genetycznego dotyczy autosomów. Z kolei aberracje zrównoważone nie zmieniają fenotypu, natomiast mogą być przyczyną niepowodzeń rozrodu u ich nosiciela.
Do patologii prowadzi również jednorodzicielska disomia, tj. sytuacja, kiedy w danej parze chromosomów obydwa chromosomy pochodzą tylko od jednego z rodziców i tym samym brakuje chromosomu drugiego rodzica. Chociaż w tym przypadkach ilość materiału genetycznego nie zmienia się, jednak na skutek rodzicielskiego piętna genomowego (ang. "genomic imprinting") materiał genetyczny jednego z rodziców nie może zostać zastąpiony materiałem genetycznym drugiego z rodziców. Rodzicielskie piętno genomowe polega bowiem na tym, że chromosom lub jego część "pamięta" od którego z rodziców pochodzi. Odbywa się to poprzez modyfikacje na poziomie DNA, w rezultacie których dochodzi do zmiany w ekspresji genów chromosomu ojcowskiego i matczynego.

Skutki kliniczne aberracji chromosomowych:
- poronienia samoistne, niepłodność
- zespoły wad rozwojowych u dzieci żywo i martwo urodzonych
- zaburzenia różnicowania płci, zwykle z współistnieniem wad somatycznych

Przykłady:

prawidłowy kariotyp męski 46,XY

prawidłowy kariotyp żeński 46,XX

kariotyp pacjenta z Zespołem Downa, dodatkowy chromosom pary 21 zaznaczono strzałką;    46,XY,+21

kariotyp pacjenta z Zespołem Edwardsa, dodatkowy chromosom pary 18 zaznaczono strzałką;   46,XX,+18

kariotyp pacjentki z Zespołem Turnera, pojedynczy chromosom X zaznaczono strzałką ;  45,X

kariotyp pacjentki z niepowodzeniami rozrodu, widoczna translokacja zrównoważona pomiędzy chromosomami pary 1 i 16;     46,XX,t(1;16)

ABERRACJE CHROMOSOMOWE. KLINICZNE SKUTKI ABERRACJI CHROMOSOMOWYCH

1. Około 0,6% dzieci rodzi się z aberracjami chromosomowymi

2. Aberracje występują u 50-60% samoistnie poronionych zarodków

3. Aberracje chromosomowe są przyczyną 5% martwych urodzeń

• Aberracje - liczby chromosomów i struktury chromosomów

• Aberracje mogą dotyczyć zarówno chromosomów płci, jak i autosomów

• Są wynikiem mutacji chromosomowej powstałej w komórce rozrodczej któregoś z rodziców lub u bardziej odległego przodka

Prawidłowa liczba chromosomów:
46 (23 pary) – w komórkach somatycznych– diploidia
23 - w gametach - haploidia

Aberracje liczby chromosomów
Poliploidia – liczba chromosomów stanowi wielokrotność liczby haploidalnej i jest większa niż diploidalna
Triploidia 69 chromosomów
Tetraploidia 92 chromosomy
Trisomia – dodatkowy chromosom w danej parze
Monosomia – brak jednego chromosomu w danej parze

Aberracje struktury chromosomów
Zrównoważone

• Translokacje zrównoważone

• Inwersje

Niezrównoważone

• Duplikacje

• Delecje

• Chromosomy pierścieniowe

• Izochromosomy
  

Chromosomy markerowe – małe dodatkowe chromosomy o nieustalonym pochodzeniu – to aberracje jednocześnie liczby i struktury chromosomów.

Aberracje struktury chromosomów:
1. Translokacje = Przemieszczenie się materiału genetycznego pomiędzy chromosomami

Typy translokacji:
Wzajemne
Robertsonowskie

Insercyjne

2. Inwersja = Chromosom ulega złamaniu w 2 miejscach, a fragment pomiędzy złamaniami ulega odwróceniu o 180 stopni

Inwersja paracentryczna – oba złamania są w obrębie jednego ramienia i odwrócony fragment nie zawiera centromeru

Inwersja pericentryczna – złamania nastąpiły w obydwu ramionach chromosomu i odwrócony fragment zawiera centromer.
Inwersja jest aberracją zrównoważoną

3. Delecja = Utrata części chromosomu

Chromosomy pierścieniowe – forma delecji (chromosom pęka w obu ramionach, dystalne części chromosomów ulegają utracie, a pozostała część chromosomu tworzy pierścień).
Są to aberracje chromosomowe niezrównoważone

4. Izochromosom = Nieprawidłowy chromosom, który ma delecję jednego, a duplikację drugiego ramienia.
Aberracja niezrównoważona.
Kliniczne skutki aberracji chromosomowych.

Niezrównoważonych
U zarodka – obumarcie
U dzieci żywo urodzonych
- Zespoły wad wrodzonych z niepełnosprawnością intelektualną
- Niepełnosprawność intelektualna z cechami dysmorfii
- Zaburzenia cielesno-płciowe

Zrównoważonych
Nosiciel aberracji jest zdrowy, ale może mieć niepowodzenia rozrodu (brak ciąży, poronienia samoistne, porody martwe, dzieci z zespołem wad i upośledzeniem umysłowym)

Fenotyp osoby z niezrównoważoną aberracją chromosomową w zakresie autosomów

• Często dystrofia wewnątrzmaciczna

• Często nieprawidłowy przebieg ciąży (krwawienie z dróg rodnych, nieprawidłowa ilość płynu owodniowego, wady płodu w badaniu USG)

• Wady wrodzone, w tym wady narządów wewnętrznych, często wada serca

• Dysmorfia twarzy, dysplastyczne małżowiny uszne

• Niepełnosprawność intelektualna – zawsze, nawet przy słabo wyrażonych pozostałych w.w. objawach

Wskazania do określenia kariotypu

• Zespół wad wrodzonych

• Wada wrodzona jednego narządu współistniejąca z opóźnionym rozwojem dziecka

• Opóźnienie rozwoju psychoruchowego, niepełnosprawność intelektualna

• Zaburzenia różnicowania płci

• Niepowodzenia rozrodu (brak ciąży, poronienia, poród martwy, urodzenie dziecka z wadami)

• Zdrowa osoba planująca potomstwo, w której rodzinie występowały w/wym. zdarzenia

UWAGA: nawet bardzo mała niezrównoważona aberracja chromosomowa jest molekularnie olbrzymia, oznacza zawsze ubytek lub nadmiar co najmniej dziesiątek, a nawet setek genów, stąd skutki kliniczne muszą być bardzo poważne!

Badanie kariotypu

1. Teoretycznie można użyć każdej rosnącej tkanki

2. Najczęściej badanie wykonuje się na limfocytach krwi obwodowej, czasem także na innych komórkach (fibroblasty skóry)

3. W diagnostyce prenatalnej badanie kariotypu wykonuje się na komórkach płynu owodniowego lub materiale z kosmówki

Badanie kariotypu na podstawie hodowli limfocytów krwi obwodowej

Należy pobrać jałowo do probówki z heparyną ok. 2-5 ml krwi żylnej (od noworodka 0,5-1 ml) i przesłać do laboratorium cytogenetycznego. Jeśli transport krwi jest następnego dnia, probówkę z krwią należy przechowywać w lodówce (+4 stopnie C). Można też probówkę z krwią przesyłać szybką pocztą

Uwaga: u noworodka z wadami wrodzonymi, który zmarł zanim zdążono pobrać krew na badanie kariotypu, można jeszcze jak najwcześniej (ew. nawet do jednej godziny po zgonie) pobrać krew bezpośrednio z serca

Zakłada się hodowlę limfocytów dodając krew do podłoża hodowlanego zawierającego mitogen fitohemaglutyninę, która stymuluje limfocyty do podziałów. Hodowla jest prowadzona przez 72 godziny w temp. 37 stopni C. Bezpośrednio przed kończeniem hodowli dodaje się kolchicynę, która hamuje wytwarzanie się niteczek wrzecionka kariokinetycznego, dzięki czemu następuje zatrzymanie limfocytów na stadium metafazy. Kończenie polega na inkubacji limfocytów w roztworze hipotonicznym (umożliwia lepsze rozproszenie chromosomów), a następnie kilkakrotnym dodawaniu mieszaniny kwasu octowego lodowatego z metanolem. Osad komórek nakłada się na szkiełka mikroskopowe, suszy i uzyskuje wzory prążkowe lub wykonuje technikę FISH. Chromosomy analizuje się pod mikroskopem i układa korzystając ze specjalnych programów komputerowych. Od pobrania krwi do wydania wyniku upływa zwykle, stosując techniki klasycznej cytogenetyki, ok. 14 dni, ale wynik można wydać w ciągu 7 dni.

Standardowo analizuje się chromosomy z wzorem prążkowym GTG (wzór prążkowy G uzyskiwany poprzez trawienie chromosomów trypsyną i barwienie barwnikiem Giemsy).

Postępowanie w przypadku trudności w wykazaniu aberracji chromosomowej przy zastosowaniu standardowego badania kariotypu (limfocyty krwi obwodowej, klasyczne techniki prążkowe)

• Analiza większej liczby płytek metafazowych (poszukiwanie mozaikowości)

• Analiza chromosomów prometafazowych (HRBT)

• Badanie kariotypu na podstawie fibroblastów skóry

• Metody cytogenetyki molekularnej – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

FISH (łączy techniki klasycznej cytogenetyki z metodami biologii molekularnej)

• Metoda polega na hybrydyzacji specjalnie skonstruowanej sondy (fragment DNA), komplementarnej do określonej sekwencji w danym chromosomie.

• Sondę nakłada się na preparat cytogenetyczny (chromosomy leżące na szkiełku podstawowym)

• Sonda jest wyznakowana fluorochromem, co umożliwia obserwację fluorescencji w miejscu specyficznego związania sondy

Zastosowanie FISH

• Zespoły mikrodelecji – metoda z wyboru

• Aberracje struktury chromosomów trudne do identyfikacji metodami klasycznej cytogenetyki

• Identyfikacja pochodzenia chromosomów markerowych

• Szybka metoda identyfikacji aberracji liczby chromosomów (FISH do jąder interfazowych)

• Badanie aberracji chromosomowych w komórkach nie dzielących się.

FISH – widoczna translokacja insercyjna FISH do jądra interfazowego – triploidia

Konwencjonalne badanie cytogenetyczne, przy liczbie prążków 400-500 na garnitur haploidalny pozwala na uwidocznienie zmian materiału genetycznego wielkości około 10 milionów par zasad (10 Mb = 10000 kb) i większych. Przy zastosowaniu analizy chromosomów prometafazowych rozdzielczość metody wzrasta do nawet 2-3 Mb (2000-3000 kb), ale badanie staje się trudne, wymagające najwyższych umiejętności cytogenetycznych i czasochłonne.

Stosując FISH, można wykryć zmiany materiału genetycznego wielkości 0,5 kb, ale w praktyce klinicznej wystarcza FISH o znacznie mniejszej rozdzielczości.

Zasady zapisu wyniku badania kariotypu

Na podstawowy zapis kariotypu składa się:

• Liczba określająca całkowitą ilość chromosomów w komórce

• Po przecinku wymienione chromosomy płciowe

• Po przecinku ewentualny opis aberracji

Uwagi:

1. Regiony poszczególnych ramion chromosomu numerowane są kolejnymi cyframi arabskimi, poczynając od centromeru i posuwając się w stronę końców ramion

2. Kolejna cyfrą arabską numeruje się kolejne prążki w obrębie danego regionu.

W zapisie wyniku badania kariotypu nie używa się spacji, każdy znak (kropka, przecinek, średnik) jest istotny

Oznaczenia stosowane przy zapisie wyniku badania kariotypu:

t translokacja

del delecja

dup duplikacja

ins insercja

inv inwersja

r chromosom pierścieniowy (ring)

Przykłady zapisu wyniku badania kariotypu:

46,XX prawidłowy kariotyp żeński

46,XY prawidłowy kariotyp męski

45,X zespół Turnera

47,XXY zespół Klinefeltera

47,XY,+21 chłopiec z zespołem Downa

46,XX,t(2;6)(p12;q21) dziewczynka/kobieta nosicielka translokacji wzajemnej: wymieniły między sobą fragmenty chromosomy 2 i 6 (złamanie nastąpiło w prążku 12 ramienia krótkiego chromosomu 2 i w prążku 21 ramienia długiego chromosomu 6, fragmenty dystalne wobec punktów złamań uległy wymianie)

46,XY,del(15)(q13.2) chłopiec/mężczyzna z delecją fragmentu ramion długich chromosomu 15, złamanie nastąpiło w prążku 13.2 i część ramion długich dystalna wobec punktu złamania uległa utraceniu

46,XY,dup(18)(q12q13) chłopiec/mężczyzna z duplikacją fragmentu ramion długich chromosomu 18, zdwojeniu uległ materiał genetyczny obejmujący prążki od q12 do q13

46,XX,r(22) dziewczynka/kobieta z chromosomem pierścieniowym 22

46,XX,9qh+ dziewczynka/kobieta, kariotyp prawidłowy, w jednym z chromosomów 9 tzw. wariant polimorficzny – duży blok heterochromatyny podcentromerowej (wg większości piśmiennictwa bez znaczenia klinicznego, chociaż są również doniesienia o częstszym występowaniu u osób z niepowodzeniami rozrodu).

Utrwalenie (odbiałczanie) hodowli- do hodowli dodaje się mieszankę lodowatego kwasu octowego i metanolu 1/3 (proporcja)- utrwalacz lub roztwór (Arnoy’a na temperaturę ok. 44 )

3 razy przeprowadzamy utrwalenie.

Nakrapiamy na czyste, zimne i mokre szkło- podstawę mikroskopu. Czekamy aż szkiełko wyschnie i mamy gotowe preparaty chromosomowe- są trudne do oceny.

Następnie barwienie chromosomów. Dostrzegamy, co się dzieje.

Podstawową techniką stosowaną do kariogramu są prążki G.

Wzory prążkowe- najpierw zanurzamy preparat w trypsynie a następnie barwimy w barwniku Genzy.

Hetero chromatyna- nieaktywna genetycznie DNA bogate w AT- odzwierciedlają ją jasne prążki G- jasne.
Prążki ciemne G- chromatyna aktywna genetyczne, euchromatyna bogata w pary GC

Na metafazowych chromosomach ok. 300- 400 prążków.

Techniki uzupełniające (barwienia)

• Barwienie na prążki Q- użycie fluorowodorów, które aktywnie świecą. Np. Atebryna, Iperyt akry chinowy.
  Wynik barwienia w postaci świecenia:
  Q+ świecą intensywnie
  Q- nie świecą albo świecą słabo
  chromosomy Y intensywnie świecą- możemy tym sposobem badać płeć płodu XX dziewczynki, Y chłopcy.
  
  polimorfizm- naturalna zmienność.

• Barwienie na prążki C traktujemy preparaty roztworem tlenku baru.
  Wybarwiają się na ciemno okolice centromeru i przycentromerowe. Polimorfizm obszarów centromerowych i przycentromerowych.

• Barwienie na prążki R odwrotność wzoru G tam gdzie w G ciemny w R jasny. Zanurzamy preparaty w buforze fosforanowym (BH 6,5) w temperaturze 67 i przenosimy do barwnika Genzy. Takie barwienie wykorzystujemy aby badać małe niewielkie zmiany na wzorze G w sekwencjach telomerowych.

• Barwienie AG-NOR barwnie preparatów azotanem srebra- wysrebrzanie. Badanie polimorfizmu satelitów i nitek satelitowych. Chromosomów agrocentyrcznych. Chodzi o długość nitek i rozmiar satelitów.

UKŁADANIE KALIOGRAMÓW

46 chromosomów w komórce człowieka

KRYTERIA STOSOWANE W UKŁADANIU KALIOGRAMU:

• Wielkość chromosomu

• Typ budowy chromosomu- położenie centromeru

• Specyficzny układ prążkowy

Prawidłowy kariotyp żeński. Liczba ogólna chromosomów:
46 XX - żeński
46 XY- męski

Z grupy A- G

A- 3 pary: od 1 do 3
1 i 3 największe w kariotypie chromosomy metacntryczne.
Para 2- największe submetacentryczne.

B- 2 pary: 4 i 5
duże chromosomy submetacentryczne.

C- 7 par chromosomów od 6 do 12
są to średniej wielkości chromosomy submetacentryczne.

D- 3 pary: 13, 14, 15

Największe w kariotypie chromosomy akrocentryczne.

E- 3 pary: 16, 17, 18

16- małe chromosomy metacntryczne.

17 i 18 najmniejsze w kariotypie chromosomy submetacentryczne.

F- 2 pary: 19 i 20

Najmniejsze chromosomy metacntryczne.

G- 2 pary: 21 i 22

Najmniejsze w kariotypie chromosomy akrocentryczne.

Chromosom X jest chromosomem submetacentrycznym najbardziej podobny do grupy C. Z tej grupy jest najbardziej metacentrycznym.

Chromosom Y to mały chromosom akrocentryczne najbardziej podobny do grupy G. Nigdy nie zawiera satelitów. Ma dość charakterystycznie ułożone ramiona dolne.

CYTOGENETYKA CZĘŚĆ 2

1. Zespoły trysomi autosomów.

- Zespół Downa

- Pa To

- Edwarda

1. Analiza kariogramów wyżej wymienionych zespołów.

2. Aberacje struktury chromosomó somatycznych

- rodzaje aberacji strukturalnych

- przykłady zapisów kariotypów z aberacjami strukturalnymi.

1. Kariotypy mozaikowe.

Anauploidia- obecność dodatkowego chromosomu lub brak chromosomu

Trysomie najwięcej u dzieci 21, 18,13

Anaploidia powstaje w wyniku nieprawidłowego rozdzielenia się chromosomów homologicznych lub chromatyny siostrzanych.

Nierozdzielenie się – nondisnunkcja, prowadząca do powstania nieprawidłowych gamet.

Przykładem trisomi jest zespół Downa 1/800 urodzeń dodatkowy chromosom pary 21 z grupy G.

47,XX,+21 żeński kariotyp Zespołu Downa

47,XY,+21 męski kariotyp Zespołu Downa

5% Zespół Downa wywołuje się aberacjami strukturalnymi. Translokacja Robertsonowska.

Translokacja Robertsonowska dotyczy chromosomów agrocentyrcznych, biorą udział w translokacji gr. D i G mają tendencję do łączenia się w centromie.

Np. 14:21

45,XY, der(14;21)(q10;q10)

Kariotyp mozaikowy

46,XX/47,XX,+21 -około 1% z zespołem Downa

Cechy fenotypowe zespołu Downa

Zespół Pa Toe

Para 13 chromosom pary 13 jest chromosomem akrocentrycznym 13:14

45:XX,der(15:13)(q10;q10)

46:XX,der(13:13)(q10;q10)+13

Zasady zapisu kariotypów

46,XX- chromosomy płci

46- liczba chromosomów

1p31,1- pierwszy subprążek w prążku 1 regionu 3

Aberracje strukturalne

Zmiany struktury chromosomów są to aberracje powstające na skutek pęknięć a następnie łączenia się odcinków w odmiennym już porządku. Mają one ogromne znaczenie dla ewolucji, ponieważ zmieniają położenie genów, a tym samym wpływają na szansę rekombinacji. Aberracje chromosomowe dzieli się na:

• delecje - to utrata odcinka chromosomu (A-B-D-E)

• duplikacje - to powielenie odcinka chromosomu (A-B-C-B-C-D-E)

• inwersje - to odwrócenie fragmentu chromosomu o 180 stopni (A-B-D-C-E z odwróceniem orientacji odcinków C i D)

• translokacje - przeniesienie odcinków między niehomologicznymi chromosomami (Przed translokacja: A-B-C-D-E oraz P-Q-R-S-T, po translokacji: A-B-C-S-T oraz P-Q-R-D-E)

Delecja interstycjalna, utrata części chromosmu na skutek jego podwójnego pęknięcia i połączenia dystalnych odcinków, obejmująca acentryczny (interstycjalny) fragment znajdujący się między pęknięciami.

Zapis wyniku badania kariotypu i jego interpretacja.

   Ramiona krótkie i długie wszystkich chromosomów oznaczane są odpowiednio literami p i q. Struktura łącząca je ze sobą, nazywana centromerem, określana jest skrótem cen. Wolne końce chromosomów, nazywane telomerami, określane są skrótem tel. Regiony poszczególnych ramion chromosomów numerowane są kolejnymi cyframi arabskimi, poczynając od centromeru i posuwając się w stronę telomerów. Kolejną cyfrą arabską numeruje się natomiast kolejne prążki (także od strony centromeru począwszy) w obrębie danego regionu.
Tak więc np. zapis 1p31 oznacza: chromosom pary 1, ramię krótkie, region 3, prążek 1.

   Niektóre prążki, zwłaszcza przy wykorzystaniu technik wysokiej rozdzielczości, ujawniają obecność tzw. subprążków, określanych kolejnymi cyframi arabskimi umieszczonymi po kropce.
Np. zapis 1p31.1 oznacza pierwszy subprążek opisanego wyżej prążka, zaś zapis 1p31.11 lub 1p31.12 kolejne podziały subprążka na następne subprążki.

   Poniższa lista przestawia skróty najczęściej stosowane w opisie rozpoznawanych aberracji chromosomowych i innych szczególnych cech chromosomów:

• + (plus) nadmiar, dodatek

• - (minus) niedobór, ubytek

• : (dwukropek) pęknięcie

• :: (podwójny dwukropek) pęknięcie i połączenie

• , (przecinek) rozdziela liczbę chromosomów od chromosomów płci i ewentualnego opisu aberracji

• ; (średnik) rozdziela zapisy dotyczące różnych chromosomów

• . (kropka) oddziela zapis subprążków od cyfry określającej prążek

• -> (strzałka) od - do (określa zakres regionu chromosomu)

• ( ) (nawiasy) obejmują strukturalnie zmienione chromosomy lub miejsca pęknięć za skrótem określającym typ aberracji

• [ ] (nawiasy kwadratowe) zawarta w nich liczba za zapisem kariotypu jednej z linii komórkowych określa jej procentowy udział w mozaice

• / oddziela różne linie komórkowe w mozaikach

• cen centromer

• del delecja

• der chromosom pochodny

• dic chromosom dicentryczny

• dup duplikacja

• fra miejsce łamliwe

• h heterochromatyna konstytutywna

• i izochromosom

• idic chromosom izodicentryczny

• ins insercja

• inv inwersja

• mar chromosom markerowy

• mat pochodzenie matczyne

• p krótkie ramię chromosomu

• pat pochodzenie ojcowskie

• Ph chromosom Philadelphia

• q długie ramię chromosomu

• r chromosom pierścieniowy

• s satelity

• t translokacja

• tel telomer

• ter koniec chromosomu (fragment terminalny)

Zapis kariotypu prawidłowego
   Prawidłowa liczba chromosomów człowieka w komórkach somatycznych wynosi 46. Składają się na nią 22 pary autosomów (numerowane cyframi arabskimi od 1 do 22) oraz dwa chromosomy płciowe (heterochromosomy), określane literami X i Y. U kobiet obserwuje się dwa chromosomy płciowe X, zaś u mężczyzn jeden chromosom X i jeden chromosom Y.
   Na podstawowy zapis kariotypu człowieka składa się zawsze liczba określająca całkowitą liczbę chromosomów w komórce diploidalnej, z towarzyszącymi jej po przecinku literami oznaczającymi chromosomy płciowe. Tak więc zapis prawidłowego kariotypu kobiety to: 46,XX, zaś mężczyzny: 46,XY.
   W ramach prawidłowego kariotypu mieszczą się również oznaczenia dotyczące obecności większej niż zazwyczaj ilości heterochromatyny konstytutywnej oraz dużych satelitów. Np. zapis 46,XY,9qh+ oznacza całkowicie prawidłowy kariotyp z obecnością większej ilości heterochromatyny konstytutywnej (h+) w długim ramieniu (q) chromosomu pary 9, a zapis 46,XYqh- zmniejszenie długości heterochromatyny w długim ramieniu chromosomu Y. Zapis 21ps+ oznacza zaś szczególnie duże satelity (s+) na krótkich ramionach (p) chromosomu pary 21. Pamiętać jednak należy, że powyższe zjawiska nie stanowią żadnej patologii, a jedynie wariant prawidłowego chromosomu.

Zapis aberracji chromosomowych
   Bardzo rzadko obserwuje się (głównie u obumarłych zarodków i płodów) zaburzenia o typie poliploidii, powstające w wyniku dodania całego haploidalnego garnituru chromosomowego. Są to: triplodia lub tetraploidia, których zapis może odpowiednio przedstawiać się następująco: 69,XXY lub 92,XXYY.
   Zdecydowanie najczęstszymi aberracjami liczbowymi są tzw. aneuploidie, polegające na dodaniu lub utracie jednego, dwóch lub bardzo rzadko kilku chromosomów. Aneuploidie chromosomów płciowych zapisywane są przy pomocy odpowiedniej cyfry określającej całkowitą liczbę chromosomów w komórce oraz bezpośrednie, literowe przedstawienie układu chromosomów płciowych.
Oto przykłady aneuploidii chromosomów płciowych:

• 45,X - kariotyp z brakiem jednego chromosomu płciowego (najczęstsza postać cytogenetyczna zespołu Turnera);

• 47,XXY - kariotyp z dwoma chromosomami X i jednym chromosomem Y (najczęstsza postać cytogenetyczna zespołu Klinefeltera);
  Aneuploidie autosomów zapisywane są poprzez wymienienie za całkowitą liczbą chromosomów i chromosomami płciowymi, numeru nadliczbowego lub brakującego chromosomu, poprzedzonego znakiem "+" lub "-".
  Najpowszechniejsze przykłady aneuploidii autosomów obejmują: 47,XX,+21 lub 47,XY,+21 - kariotyp z trisomią 21 (najczęstsza postać cytogenetyczna zespołu Downa);

• 47,XX,+18 lub 47,XY,+18 - kariotyp z trisomią 18 (najczęstsza postać cytogenetyczna zespołu Edwardsa);

• 47,XX,+13 lub 47,XY,+13 - kariotyp z trisomią 13 (najczęstsza postać cytogenetyczna zespołu Patau).

   W bardzo podobny sposób zapisywało się do niedawna ubytki całych ramion chromosomów. Na przykład: ubytek ramion krótkich chromosomu pary 5 (znany jako zespół "cri-du-chat" czyli "krzyku kota") lub ubytek ramion krótkich chromosomu pary 4 (znany jako zespół Wolfa-Hirschhorna) zapisywane były odpowiednio jako: 46,XX,5p- lub 46,XY,4p-. Obecnie obowiązuje jednak raczej zapis takiej aberracji jako delecji (patrz niżej).
    Znacznie bardziej skomplikowane i z pewnością w znacznej mierze wykraczające poza ramy tego opracowania są zasady zapisu aberracji strukturalnych. Każdą aberrację strukturalną opisuje się po przecinku za chromosomami płciowymi, a zapisać ją można w sposób skrócony lub sposób szczegółowy. Sposób skrócony przedstawia jedynie punkty pęknięć, zaś sposób szczegółowy opisuje wszystkie regiony chromosomowe zawarte w nieprawidłowym strukturalnie chromosomie.

Delecje (del)
1. Delecja terminalna ramion długich chromosomu pary 5 od prążka q13:

• 46,XX,del(5)(q13) lub 46,XX,del(5)(pter -> q13:)

2. Delecja całych ramion krótkich (od centromeru) chromosomu pary 5:

• 46,XX,del(5)(p10) lub 46,XX,del(5)(qcen -> qter)

Duplikacje (dup)
Duplikacja fragmentu chromosomu pary 1 pomiędzy prążkami q22 i q25:

• 46,XX,dup(1)(q22q25) lub 46,XX,dup(1)(pter-->q25::q22 -> qter)

Insercje (ins)
Insercja fragmentu ramion długich chromosomu pary 2 zawartego między prążkami q21 i q31 w ramię krótkie tego chromosomu, w prążek p13:

• 46,XY,ins(2)(p13q21q31) lub
  46,XY,ins(2)(pter->p13::q31->q21::p13->q21::q31->qter)

Inwersje (inv)
Inwersja fragmentu pomiędzy prążkami q21 i q26 krótkim ramieniu chromosomu pary 3 (inwersja paracentryczna, nie obejmująca centromeru):

• 46,XX,inv(3)(q21q26) lub
  46,XX,inv(3)(pter->q21::q26->q21::q26->qter);

Translokacje wzajemne (zrównoważone)
1. Wymiana dystalnych części ramion długich chromosomów pary 2 (od prążka q21) i pary 5 (od prążka q31):

• 46,XY,t(2;5)(q21;q31) lub
  46,XY,t(2;5)(2pter->2q21::5q31->5qter;5pter->5q31::2q21->2qter)

2. Wymiana całych ramion krótkich chromosomu pary 1 i długich chromosomu pary 3:

• 46,XY,t(1;3)(p10;q10) lub
  46,XY,t(1;3)(1pter->1p10::3q10->3qter;3pter->3p10::1q10->1qter)

Translokacje niezrównoważone oraz robertsonowskie (powstające w wyniku fuzji w centromerze długich ramion chromosomów akrocentrycznych 13-15 i 21-22, zwykle z jednoczesną utratą ramion krótkich) opisywane są z wykorzystaniem skrótu der, oznaczającego chromosom pochodny (patrz niżej).

Chromosomy pochodne (der)
   Za skrótem der i numerem chromosomu, który został zastąpiony przez chromosom pochodny, zapisywany jest typ aberracji strukturalnej, obejmującej bądź dwa lub więcej chromosomy, bądź mnogie rearanżacje w obrębie jednego chromosomu.
1. Zamiast prawidłowych chromosomów 13 i 21, obecny jest jeden chromosom pochodny, powstały na skutek translokacji robertsonowskiej (patrz wyżej) pomiędzy tymi chromosomami (skutkiem jest brak ramion krótkich obu chromosomów):

• 45,XX,der(13;21)t(q10;q10) lub
  45,XX,der(13;21)(13qter->13q10::21q10->21qter)

Izochromosomy (i)
Izochromosom zbudowany z dwóch ramion długich chromosomu X:

• 46,X,i(X)(q10) lub 46,X,i(X)(qter->q10::q10->qter)

Chromosomy dicentryczne (dic) i izodicentryczne (idic)
Zastępują one jeden lub dwa prawidłowe chromosomy i zawierają dwa centromery.
1. Chromosom dicentryczny złożony z dużych fragmentów (zawierających centromery) chromosomów 13 i 15 (wynik translokacji niezrównoważonej):

• 45,XX,dic(13;15)(q22;q24) lub
  45,XX,dic(13;15)(13pter->13q22::15q24->15qter)

2. Izodicentryczny chromosom Y (wynik delecji części dystalnej ramienia długiego i duplikacji pozostałego fragmentu zawierającego centromer):

• 46,X,idic(Y)(q12) lub 46,X,idic(Y)(pter->q12::q12->pter)

Chromosomy pierścieniowe (r)
Chromosom pierścieniowy powstały w wyniku pęknięcia i ponownego zlepienia w obrębie prążków p22 i q36 chromosomu pary 7 (segmenty dystalne do miejsc pęknięć ulegają delecji!):

• 46,XX,r(7)(p22q36) lub 46,XX,r(7)(::p22->q36::)

Chromosomy markerowe (mar)
Dodatkowy chromosom, nieprawidłowy strukturalnie, o nieznanym pochodzeniu:

• 47,XY,+mar

Miejsca łamliwe (fra)
   Miejsce łamliwe w subprążku q27.3 na chromosomie X u mężczyzny z zespołem Martina-Bella (zespołem łamliwego chromosomu X):

• 46,Y,fra(X)(q27.3)

Mozaiki
   W wielu przypadkach, aberracje chromosomowe stwierdzane są tylko w części komórek. W pozostałych komórkach, obecny może być prawidłowy kariotyp lub inna aberracja chromosomowa. Procenty lub liczby podane w nawiasach kwadratowych oznaczają odsetek lub liczbę komórek o określonym kariotypie:
1. Mozaika linii komórkowej z trisomią 21 z linią o prawidłowym kariotypie (postać mozaikowa zespołu Downa):

• 47,XX,+21[70%]/46,XX[30%]

2. Mozaika linii komórkowej z monosomią X z linią zawierającą izochromosom X (jedna z postaci mozaikowych zespołu Turnera):

• 45,X[21]/46,X,i(X)(q10)[29]

 

Na zakończenie podkreślić należy, że jakiekolwiek wątpliwości co do zapisu kariotypu lub jego interpretacji, powinny być zawsze rozwiązane poprzez kontakt lekarzem poradni genetycznej!
Często bowiem zdarza się, że zapisy oznaczające fizjologiczne warianty chromosomowe lub translokacje zrównoważone, traktowane są jako niezrównoważenie kariotypu, co prowadzi do poważnych nieporozumień i niekorzystnych skutków dla chorego i jego rodziny.

Translokacja (z łac. translocatio = przemieszczenie) – w genetyce, mutacja polegająca na przemieszczeniu fragmentu chromosomu w inne miejsce tego samego lub innego chromosomu. Ten rodzaj mutacji jest przyczyną m.in. białaczki szpikowej.

Translokacja wzajemna.

Praktyczne znaczenie mają dwa rodzaje translokacji - wzajemna i robertsonowska (zwana także fuzją centryczną), obserwowane w patologii człowieka:

• Translokacja wzajemna: dwa chromosomy wymieniają między sobą odcinki. Całkowita liczba chromosomów pozostaje niezmieniona, a dwa spośród nich mają nieprawidłowe kształty

• Translokacja robertsonowska: łącza się całe lub prawie całe ramiona długie chromosomów. Miejscem połączenia jest rejon centromeru. Dochodzi do utraty ramion krótkich. W kariotypie stwierdza się brak chromosomu.

Translokacje mogą być zrównoważone i niezrównoważone:

• W translokacjach zrównoważonych zasadniczo nie zmienia się ilość materiału genetycznego, ale następuje zmiana jego rozmieszczenia w genomie. Liczba chromosomów może być prawidłowa lub zmieniona. Aberracja ta może nie przejawiać się fenotypowo. Często problem pojawia się dopiero, gdy posiadacz zaczyna myśleć o potomstwie, gdyż u dziecka może wtedy pojawić się translokacja niezrównoważona.

• W translokacji niezrównoważonej zmianie ulega ogólny skład genowy. Ilość materiału jest większa, a liczba chromosomów jest prawidłowa. W tym przypadku zawsze dochodzi do ujawnienia fenotypowego choroby.

Chromosom markerowy – dodatkowy, najczęściej mały chromosom, niepodobny morfologicznie do innych chromosomów. Jest on możliwy do wykrycia w klasycznym badaniu cytogenetycznym (ocena prążków), ale na podstawie badania klasycznego nie można z całą pewnością określić jego pochodzenia oraz wpływu na fenotyp pacjenta. Zbadanie pochodzenia takiego chromosomu oraz określenie skutków klinicznych dla pacjenta wymaga badań molekularnych (najczęściej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondą molekularną specyficzną dla regionu danego chromosomu oraz badania rodziców nosiciela.