Grupa 6B

Ksenia Brusilowska

Katarzyna Figlak

Joanna Morcinek

Daria Nitarska

Biotechnologia – sprawozdanie
z ćwiczeń

Przedmiotem zajęć była ekspresja mutant ludzkiego fibroblastycznego czynnika wzrostu FGF1.

Dziki typ tego białka charakteryzuje się niską temperaturą denaturacji, więc pracowaliśmy z mutantem, w którego strukturze dokonano trzech mutacji punktowych mających na celu zachować jego właściwość wraz ze zwiększeniem stabilności termodynamicznej. Nie wiem, czy to ma sens…nie w białku, a w genie były mutacje i zmutowany mutant nie brzmi dobrze, ale jaki może być synonim dla mutanta?

Dzień 1

Przygotowałyśmy odpowiednie odczynniki, według instrukcji oraz przeprowadziłyśmy transformację bakterii chemicznie kompetentnych metodą szoku cieplnego, po czym bakterie (oraz próbę kontrolną) wysiałyśmy na płytki z LB + Chl + Amp.

Dzień 2

Zaszczepiłyśmy 100 ml pożywki LB + Chl + Amp pojedynczą kolonią bakterii z płytki, następnie bakterie były hodowane przez noc w wytrząsarce (200rpm, 37°C).

Płytka z 100µl hodowli-19 kolonii

Płytka z 750µl hodowli-187 kolonii

19-100µl 187-750µl
x-850µl y-850 µl
x=161,5 y=211,93

(x+y)/2=CFU

CFU=186,72

CFU-120ng

z-1000ng

Wydajność transformacji

z=1555,96

Dzień 3

Do podgrzanych kolb z 1 litrem LB + Chl + Amp zaszczepiłyśmy 40 ml nocnej hodowli. Kolby były inkubowane w temperaturze 37°C (180rpm), co godzinę sprawdzałyśmy gęstość optyczną hodowli. Po 5 godzinach gdy wartość OD wynosiła 0,84; pobrałyśmy 1ml hodowli do analizy elektroforetycznej (po zwirowaniu osad zawiesiłyśmy w buforze do nanoszenia próbek i preparat 1 został zamrożony), i do każdej z kolb dodałyśmy 1ml roztworu IPTG (stężenie końcowe 0,5mM), aby zaindukować produkcję białka. Po 3 godzinach inkubacji, ponownie pobrałyśmy 1ml hodowli do analizy elektroforetycznej (postępując jak w pierwszym przypadku – preparat 2). Następnie hodowle wirowałyśmy (5000rpm, 8 min, 4°C) w 0,5l probówkach wirówkowych, aby cały osad był w jednej probówce, supernatant wylewamy. W kolejnym etapie osad zawiesiłyśmy w 35ml buforu A i zamroziłyśmy.

Dzień 4

Rozpoczęłyśmy od rozmrożenia osadu (miał on bardzo gęstą konsystencję, ponieważ część komórek bakteryjnych po zamrożeniu i rozmrożeniu została zniszczona). Następnie osad sonikowałyśmy na lodzie (5s/5s) przez 15min, aby rozbić komórki). Po zsonikowaniu przystąpiłyśmy do wirowania przy 14 000 rpm, 30min w 4°C, aby pozbyć się resztek komórkowych. Po zakończeniu wirowania pobrałyśmy 20μl supernatantu i osad do analizy elektroforetycznej, dodałyśmy buforu nanoszenia i zamroziłyśmy (preparat 3 i 4). Do supernatantu dodałyśmy 200ml buforu A i preparat naniosłyśmy na kolumnę chromatograficzną (wcześniej przepłukaną 100ml miliQ i zrównoważoną buforem A – przepuszczono 150ml). Utrzymywałyśmy przepływ ok. 1,5ml/min, aby białko związało się ze złożem, w trakcie nanoszenia zbierałyśmy 1,5ml frakcję i mierzyłyśmy absorpcję przy 280nm, z próbki o najwyższej wartości pobrałyśmy 20μl do analizy elektroforetycznej (preparat 5). Następnie przystąpiłyśmy do opłukiwania nie związanych białek poprzez płukanie kolumny 100ml buforu A i 150ml buforu B z 0,7M NaCl, utrzymując przepływ ok. 1,8 ml/ min, zbierając co 30ml frakcję i mierząc ich absorpcję przy 280nm, z próbek o najwyższej wartości znowu pobrałyśmy po 20μl do analizy elektroforetycznej (preparaty 6 i 7). Następnie przystąpiłyśmy do elucji białka poprzez przepłukanie kolumny buforem C z 2M NaCl, zbierałyśmy 1,5ml frakcję i mierzyłyśmy ich absorpcję, po czym te:

Nr frakcji	Absorpcja
7	0,6
8	1,02
9	2,36
10	2,6
15	1,2
16	0,47
31	0,06

Te które miały największą wartość, czyli od 9 do 15, połączyłyśmy. Obliczyłyśmy stężenie białka, poprzez 10x rozcieńczenia preparatu i następnie zmierzenie absorpcji, otrzymałyśmy wynik 8,23mg/ml. Pobrałyśmy próbkę do analizy elektroforetycznej tak aby zawierała ona około 7μg białka (preparat 8). Wydajność ekspresji:

C_białka=8,23mg/ml

V=22,5ml

Wydajność ekspresji wynosi 92,6 mg białka na 1 litr hodowli bakteryjnej.

Dobrze to jest??

Kolejnym etapem było odsalanie oczyszczonego białka. Kolumnę przepłukano miliQ a następnie zrównoważono 40ml buforu fosforanowego. Po dokładnym przepłukaniu buforem na kolumnę naniesiono 2 mg naszego(oczyszczonego) białka. Kolumnę płukano buforem fosforanowym, zbierając frakcje około 0,5 ml i mierząc ich absopcję przy 280 nm. Istotne były wartości otrzymane przy pomiarze frakcji 4 i 5, wynosiły one odpowiednio 2,204 i 1,216. Do sporządzenia kolejnej próbki do analizy elektroforetycznej (preparat 9) użyłyśmy frakcji 4, ponieważ stężenia białka w niej wynosiło 1,22 mg/ml, dzięki czemu nie musiałyśmy jej rozcieńczać aby w naszej próbce było 7μg białka. Po zakończeniu zbierania próbek kolumnę przepłukano buforem fosforanowym, a następnie miliQ w objętości około 200-250 ml.

Dzień 5

1. Analiza elektroforetyczna:

Rozmroziłyśmy wcześniej zebrane próbki, następnie preparaty 1, 2, i 4 zsonikowałyśmy aby rozbić bakterię. Potem wszystkie próbki umieściłyśmy we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut, po czym naniosłyśmy je na gotowy żel elektroforetyczny.

Analiza wyników:

Nr preparatu	Etap	Obserwacje
1	Przed indukcją IPTG	Widzimy wiele białek, jednak nie ma żadnego wyraźniejszego prążka sygnalizującego FGF-1.
2	Po indukcji i inkubacji	Widzimy wiele białek, jednak już trochę wyraźniej zarysowuje się prążek białka o masie pomiędzy 17, a 20 kDa czyli FGF-1
3	Po wirowaniu – supernatant	Widzimy już wyraźny prążek sygnalizujący FGF-1, co oznacza, że nasze białko prawidłowo znajduje się w supernatancie, widoczne jest jeszcze wiele białek balastowych.
4	Po wirowaniu – osad	Widzimy prążki pochodzące od wielu białek jednak nie ma prążka od FGF-1.
5	Z frakcji zebranych podczas nanoszenia	Znowu widzimy wiele białek balastowych jednak nie ma prążka od FGF-1, co oznacza, że prawidłowo wiązało się do żelu chromatograficznego.
6	Z frakcji zebranych podczas przemywania buforem A	Nie mamy praktycznie żadnego białka co oznacza, że podczas przepłukiwania kolumny buforem A nie wypłukaliśmy żadnego białka.
7	Z frakcji zebranych podczas przemywania buforem B	Widzimy widoczny prążek od FGF-1, co oznacza, że podczas przepłukiwania buforem B, wyleciało go dosyć dużo, czego przyczyną może być to, że otrzymaliśmy tak dużo białka, że doszło do wysycenia złoża i wszystko białko nie mogło się związać.
8	Po chromatografii	Widzimy wyraźny prążek od FGF-1, co oznacza, że w procesie chromatografii otrzymaliśmy oczekiwane białko, jednak widoczne są drobne zanieczyszczenia.
9	Po odsoleniu	Znowu widzimy prążek białka o masie pomiędzy 17, 20 kDa, czyli FGF-1, oznacza to, że po odsoleniu udało nam się otrzymać względnie czysty preparat białka.

1. Pomiar widm fluorescencji białka (FGF1) natywnego i zdenaturowanego.

Mierzono fluorescencje otrzymanego podczas eksperymentu bialaka FGF1 przy wzbudzeniu 280 nm, przy długości fali w zakresie 300-400 nm i temperaturze około 20 stopni. Taka falę wzbudzenia wybrano ze względu na obecność Trp w budowe FGF1, Trp jest schowany wewnątrz struktury naszego białka więc spodziewano ze charakterystyczne dla niego widmo bedzie widoczne na wykresie po badaniu białka zdenaturowanego, natomiast po zmierzeniu fluorescencji białka o natywnej konformacji nie zobaczymy charakterystycznego wrostu absorbancji, lecz niewielkie widmo charakterystyczne dla Tyr obecnych w strukturze naszego bialka mających słabsza tendencje do fluorescencji.

1. Pomiar widm dichroizmu kołowego białka (FGF1) natywnego i zdenaturowanego.