Wydział: Biotechnologii i Nauk o Żywności

Kierunek: Biotechnologia

Semestr: V

Grupa dziekańska: I

Nr grupy: V

Zajęcia: Czwartek 8¹⁵-12⁰⁰

Data wykonania ćwiczenia: 26.11.2015r.

Data oddania sprawozdania: 04.12.2015r.

Ćwiczenie 7

Uwalnianie produktów wewnątrzkomórkowych

Skład grupy:

Marta Kardas 190551

Sylwia Staszek 190609

Monika Śniadowska 190621

1. Wstęp teoretyczny

Większość znanych nam lipaz to drobnoustrojowe enzymy pochodzenia pozakomórkowego. Wewnątrzkomórkowe lipazy należą do enzymów, które poznane są w niewielkim stopniu. Wynika to z faktu, iż mikroorganizmy produkujące te enzymy występują dość rzadko w środowisku. Także trudności związane z wydzieleniem lipaz wewnątrzkomórkowych wpływają na brak danych o tych enzymach. Lipazy są enzymami z klasy hydrolaz, które rozkładają wiązania estrowe w tłuszczach, dając wolne kwasy tłuszczowe i glicerol.

W celu wydzielenia lipaz stosuje się różnorodne metody dezintegracji komórek. Należą do nich mielenie, zamrażanie i rozmrażanie, stosowanie ultradźwięków, działanie wysokimi ciśnieniami, traktowanie wysuszonych komórek rozpuszczalnikami oraz enzymatyczna liza ściany komórek. Należy jednak uważać, gdyż mogą one powodować znaczną inaktywację lipazy.

Do bardziej efektywnych metod w przypadku omawianych lipaz zaliczyć należy ekstrakcję detergentami połączoną z mechaniczną dezintegracją oraz wstępne przemycie komórek rozpuszczalnikami organicznymi.

Definicja jednostki aktywności - za jednostkę aktywności esterazy przyjęto taką aktywność, która hydrolizuje octan p-nitrofenolu powodując uwolnienie 1 mola p-nitrofenolu w czasie 1 minuty.

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest porównanie skuteczności metod dezintegracji komórek w procesie wydzielania wewnątrzkomórkowej lipazy.

1. Wykonanie ćwiczenia

Materiał biologiczny

Do ćwiczenia użyto szczepu grzybów nitkowatych Mucor circinelloides z kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej hodowanego na wstrząsarce w czasie 72 godzin w temp. 30^oC na podłożu zawierającym namok kukurydziany i olej oliwkowy. Do kolby o pojemności 1000 cm³ wprowadzono 300 cm³ podłoża hodowlanego i szczepiono kulturą mateczną za pomocą ezy. Nagromadzoną w wyniku hodowli biomasę sączono na przegrodzie celulozowej i przemywano wodą destylowaną.

Wydzielanie lipazy Mucor circinelloides z komórki przeprowadzone zostało przy pomocy następujących metod:

1. Wydzielenie lipazy Mucor circinelloides

   1. Metoda I

Odważono biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniesiono do naczynia i zalano 5 cm³ buforu fosforanowego o pH 7,0. Inkubowano w temperaturze 37^oC w czasie 15 minut. Około 2 ml płynu próby przeniesiono do probówki Eppendorfa i wirowano w temperaturze 4°C, 8 minut przy 15 tys. RPM. W otrzymanym supernatancie oznaczono aktywność esteraz.

1. Metoda II

Odważono biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniesiono do naczynia i zalano 4,5 cm³ buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubowano w temperaturze 37^oC w czasie 15 minut. Około 2 ml płynu próby przeniesiono do probówki Eppendorfa i wirowano w temperaturze 4°C, 8 minut przy 15 tys. RPM. W otrzymanym supernatancie oznaczono aktywność esteraz.

1. Metoda III

Odważono biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniesiono do moździerza, dosypano bezołowiowych kulek szklanych i zalano 4,5 cm³ buforu fosforanowego o pH 7,0. Rozcierano przez 15 minut. Całość przeniesiono do naczynia szklanego, dodano 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubowano w temperaturze 37^oC w czasie 15 minut. Około 2 ml płynu próby przeniesiono do probówki Eppendorfa i wirowano w temperaturze 4°C, 8 minut przy 15 tys. RPM. W otrzymanym supernatancie oznaczono aktywność esteraz.

1. Metoda IV

Odważono biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniesiono do naczynia i zalano 4,5 cm³ buforu fosforanowego o pH 7,0. Homogenizowano przez 1 minutę. Całość przeniesiono do naczynia szklanego, dodano 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubowano w temperaturze 37^oC w czasie 15 minut. Około 2 ml płynu próby przeniesiono do probówki Eppendorfa i wirowano w temperaturze 4°C, 8 minut przy 15 tys. RPM. W otrzymanym supernatancie oznaczono aktywność esteraz.

1. Metoda V

Odważono biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniesiono do naczyńka wykonanego z folii aluminiowej, dodano 4,5 cm³ buforu fosforanowego o pH 7,0 i dwukrotnie zamrożono do temperatury i rozmrożono. Całość przeniesiono do naczynia szklanego, dodano 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubowano w temperaturze 37^oC w czasie 15 minut. Około 2 ml płynu próby przeniesiono do probówki Eppendorfa i wirowano w temperaturze 4°C, 8 minut przy 15 tys. RPM. W otrzymanym supernatancie oznaczono aktywność esteraz.

1. Metoda VI

Odważono biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniesiono do naczynia szklanego i zalano 5 cm³ acetonu. Mieszano przez 5 minut i odsączono dobrze odciskając na przegrodzie ceramicznej. Operację przemywania acetonem powtórzono 3 razy. Odwodnioną grzybnię rozłożono pod wyciągiem na bibule i suszono przez 15 minut. Całość przeniesiono do naczynie szklanego, dodano 4,5 cm³ buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubowano w temperaturze 37^oC w czasie 15 minut. Około 2 ml płynu próby przeniesiono do probówki Eppendorfa i wirowano w temperaturze 4°C, 8 minut przy 15 tys. RPM. W otrzymanym supernatancie oznaczono aktywność esteraz.

1. Oznaczenie aktywności esterazowej lipazy

Substratem do oznaczenia aktywności jest octan p-nitrofenolu, który pod działaniem esteraz i lipaz ulega hydrolizie z wydzieleniem p-nitrofenolu. Maksimum pochłaniania światła dla tego związku występuje przy długości fali 399nm. Sam octan p-nitrofenolu nie wykazuje pochłaniania przy tej długości światła. Bezpośrednio przed użyciem substrat o stężeniu 50 μmoli/cm³ w acetonitrylu został rozcieńczony pięciokrotnie wodą destylowaną.

Wykonanie oznaczenia

Do probówki wprowadzono 0,1 cm³ ekstraktu lipazy, 0,8 cm³ buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,1 cm³ rozcieńczonego roztworu p-nitrofenolu. Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Próbę kontrolną wykonano dodając do probówki 0,9 cm³ buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,1 cm³ rozcieńczonego roztworu p-nitrofenolu. Szybkość uwalniania p-nitrofenolu zmierzono przy użyciu fotokolorymetru przy długości fali 399 nm.

Wyniki pomiarów uzyskane przez wszystkie grupy, po przeliczeniu z uwzględnieniem współczynnika krzywej wzorcowej i ewentualnych rozcieńczeń (metoda III i IV) zestawiono w tabeli 1.

Aktywność zestawiono w tabeli 2.

1. Wyniki

   1. Wyznaczenie wartości R

      1. Metoda I

Wartość otrzymanej absorbancji wynosiła 0,211.

Po podstawieniu jej do wzoru:

gdzie:

A-otrzymana absorbancja

0,0757- współczynnik kierunkowy odczytany z krzywej wzorcowej

Analogicznie postąpiono w pozostałych przypadkach z uwzględnieniem dwukrotnego rozcieńczenia w punkcie 4.3 i 4.4

1. Metoda II

Wartość otrzymanej absorbancji wynosiła 0,262.

1. Metoda III

Wartość otrzymanej absorbancji wynosiła 1,565.

1. Metoda IV

Wartość otrzymanej absorbancji wynosiła 0,969.

1. Metoda V

Wartość otrzymanej absorbancji wynosiła 0,205.

1. Metoda VI

Wartość otrzymanej absorbancji wynosiła 0,437.

Tabela 1. Wyniki wartości R dla poszczególnych metod

Metoda	Numer grupy	Wartości średnie
	I	II
Metoda I	5,31	1,19
Metoda II	5,96	2,11
Metoda III	14,54	20,45
Metoda IV	20,32	19,15
Metoda V	6,57	3,86
Metoda VI	5,57	3,37

1. Wyznaczenie aktywności esterazowej lipazy

   1. Metoda I

Otrzymane w punkcie 4.1 wartości R podstawiono do wzoru w celu wyliczenia aktywności

gdzie:

R- liczba moli

10^-6-mnożnik użyty w celu zamiany jednostki

10- rozcieńczenie

t- czas prowadzenia reakcji równy 15 minut

Analogicznie postąpiono dla pozostałych metod, jaki i wartości średnich.

Tabela 2. Zestawienie aktywności i aktywności średniej esterazowej lipazy dla omawianych metod.

Metoda	I	II	III	IV	V	VI
Aktywność	1,86*10^-6	2,31*10^-6	2,76*10^-5	1,71*10^-5	1,81*10^-6	3,85*10^-6
Aktywność średnia	2,01*10^-6	2,45*10^-6	2,25*10^-5	1,66*10^-5	3,55*10^-6	5,29*10^-6

Wykres 1. Wykres obrazujący aktywność lipazy w odniesieniu do wykorzystanej metody.

1. Wnioski

Najmniej efektywna jest metoda pierwsza, czyli ekstrakcja buforem. Stosując metodę drugą z cholanem sodu i buforem otrzymujemy nieco wyższe wyniki, gdyż cholan niszczy składniki ściany komórkowej, powodując zmianę napięcia powierzchniowego i aktywności jonowej, a tym samym większy stopień uwalniania enzymu poza komórkę. Rozcieranie w naszym przypadku dało najlepsze wyniki, jednakże mogą być one zawyżone przez zmętnienie próby. Równie wysoką aktywność uzyskujemy stosując homogenizację, która stwarza dobre warunki do wyekstrahowania enzymu. Zamrażanie i rozmrażanie dało nam dość niską aktywność. Powodem tego mogło być niecałkowite rozmrożenie przed ponownym zamrożeniem. W efekcie rozmiar powstających kryształów był niewystarczająco duży, ażeby rozerwać komórkę. Używanie acetonu, czyli rozpuszczalnika organicznego okazało się skutecznym sposobem wydobywania enzymu z komórki. Metoda ta daje trzecią co do wielkości aktywność.