Współczesne analizatory hematologiczne – technologie stosowane do oznaczania liczby krwinek i ich różnicowania.

Automatyczne urządzenia liczące komórki używają elektrycznych i optycznych technik do opisania i zaklasyfikowania komórek w próbce krwi. Elektryczne analizy obejmują przepuszczanie rozcieńczonego roztworu krwi przez otwór, przez który płynie prąd elektryczny. Odczynnik lityczny jest dodawany do roztworu krwi, aby doprowadzić do lizy krwinek czerwonych (RBC) pozostawiając tylko krwinki białe (WBC) oraz płytki krwi.

Następnie roztwór przepuszcza się przez drugi detektor. Pozwala to na określenie liczby czerwonych krwinek, białych krwinek i płytek krwi. Liczbę płytek krwi jest łatwo oddzielić od WBC przez mniejsze skoki impedancji, które produkują w detektorze z powodu mniejszych rozmiarów.

Metoda optyczna jest używana do określenia typów komórek białych. Rozcieńczona zawiesina komórek przepuszczana jest przez kapilarę oraz wiązkę lasera. Rozproszone i odbite światło od komórek jest analizowane przez program, który określa liczbę oraz prawdopodobny rozkład ogólnej populacji komórek.

Do analizatorów hematologicznych należą również koagulometry oraz urzadzenia odczytujące sedymentację krwinek czerwonych.

Retikulocyty – metody barwienia i liczenia.

Oznaczenia retikulocytów dokonuje się na szkiełku podstawowym, pod mikroskopem świetlnym. Używa się barwników wybarwiających RNA - błękitu brylantowo- krezylowego, błękitu siarczanu Nilu, błękitu metylenowego.

• Metoda manualna

Brawienie:

- kropla krwi żylnej lub włośniczkowej

- kropla płynu barwiącego

- odstawić na 15-20 min

- rozmaz na szkiełku podstawowym

Pod imersją należy policzyć 1000 erytrocytów łącznie z retikulocytami (krwinki z niebieską siateczką), liczbę retik.podać w ‰.

Retikulocytozę wyraża no w ‰, % lub we frakcji cząstek (parfr). Obecnie obowiązuje podawanie bezwzględnej liczby retikulocytów/l.

Wzrory:

Retikulocytoza= liczba policzonych retikulocytów/liczba erytrocytów x 100

Bezwzględna liczba retikulocytów= retikulocyty (%) x liczba erytrocytów/l / 100

Liczy się także tzw. skorygowaną liczbę retikulocytów

,

gdzie R% to względna liczba retikulocytów (w %), zaś Ht to hematokryt: B – u badanego, N – według normy.

• Analizatory hematologiczne

Analizatory hematologiczne określają liczbę retikulocytów na podstawie wielkości komórek oraz ich zdolności do pochłaniania, rozpraszania światła lampy analizatora, czy też zdolności jego emisji po wzbudzeniu (luminescencji).

Wynik z analizatorów fałszować mogą elementy podobnej wielkości również zawierające RNA, np. skupiska płytek krwi, fragmenty białaczkowych leukocytów, pasożyty krwi, czy małe leukocyty (obecne przy limfocytozie)

Wartości prawidłowe dla dorosłych : 25-75 x 10⁹ /l .

Cytometr przepływowy – detektory światła rozproszonego.

Detektory wraz z programem komputerowym najpierw odbierają sygnały świetlne, następnie przetwarzają są na sygnały elektryczn, które mogą być interpretowane przez computer.

Forward i Side Scatter

Jeden z detektorów cytometru ustawiony jest na przeciwko wiązki światła padającej na komórkę, zbierając światło, które zostanie ugięte na brzegach komórki.  Intensywność i kąt padania tej wiązki na czytnik zależy od wielkości komórki- im jest ona większa, tym mocniej ugina światło.

Drugi z detektorów umieszczony jest prostopadle do wiązki światła padającej na komórkę. Część światła lasera załamuje się w różnych kierunkach  po przejściu przez gęste obszary komórki, takie jak ziarnistości i organelle komórkowe. Im bardziej skomplikowana struktura wewnętrzna komórki, tym silniej światło jest załamywane i więcej go trafia na detektor boczny.

Odczyt światła z detektora przedniego nazywany jest z angielskiego „forward scatter” (FSC) [wielkość komórek] , zaś odczyt z detektora bocznego „side scatter” (SSC) [ziarnistości w komórkach].

Odczyt sygnału fluorescencyjnego w komorze cytometru polega na detekcji ilości światła odbitego i załamanego przez detektory znajdujące się z boku oraz naprzeciw wiązki lasera. W przypadku dużej, ziarnistej komórki takiej jak neutrofil, znaczna ilość światła zostanie skierowana na oba detektory, co na wykresie scatterplot zostanie przestawione jako sygnał w górnej prawej ćwiartce.

Fluorochromy – właściwości i zastosowanie w cytometrii przepływowej.

Siła i barwa fluorescencji mogą zależeć od warunków panujących w środowisku: pH, potencjał redox, lipofilowość, potencjaŁ błonowy. Pozwala to zróżnicować komórki lub ich fragmenty ze względu na panujące w nich warunki. Istnieje kilka rodzajów fluorochromów, różniących się między sobą sposobem działania. Niektóre z nich emitują sygnał jedynie po przyłączeniu się do specyficznych składników komórkowych: białek (izotiocyjanian fluoresceiny, ang. fluorescein isothiocyanate - FITC), kwasów nukleinowych (jodek propidyny, ang. propidium iodiode - PI) i tłuszczy (Czerwień Nilu, ang. Nile Red). Inną grupą są tzw. fluorogeniczne substraty, których aktywność zależy od obecności odpowiednich enzymów. Wyróżnia się także znaczniki związane z fizjologicznymi parametrami komórki (pH< potencjał błonowy, itp.).

Fluorochromy mogą być przyłączane do przeciwciał lub sond nukleotydowych i w ten sposób służyć do bezpośredniego wykrywania antygenów oraz sekwencji DNA i RNA (DAPI, Hoechst).

Mikroskop konfokalny – zasada działania i zastosowanie.

Założeniem mikroskopii konfokalnej jest wyeliminowanie obrazów pochodzących spoza płaszczyzny ogniskowania. Uzyskany w efekcie obraz warstwicowy charakteryzuje się słabszym tłem i ostrzejszymi konturami. Pozwala to stosować większe powiększenia i ułatwia interpretację uzyskanych obrazów. Dodatkową zaletą mikroskopii konfokalnej jest możliwość uzyskania obrazów warstwicowych dla kolejnych przekrojów obiektu poprzez zmianę położenia płaszczyzny ogniskowania. Zestaw takich obrazów warstwicowych pozwala odtworzyć trójwymiarowy obraz obiektu wraz z jego budową wewnętrzną.

Zasada działania

Źródłem światła w mikroskopii konfokalnej jest laser zapewniający skupioną wiązkę światła o dostatecznie dużej intensywności. Wiązka ta jest ogniskowana na obserwowanym obiekcie.

Światło odbite od obiektu (lub emitowane w przypadku znacznika fluorescencyjnego) przechodzi przez układ optyczny (obiektyw) zogniskowany na pewnej płaszczyźnie prostopadłej do osi optycznej.

Promienie światła pochodzące z płaszczyzny ogniskowania, po przejściu przez obiektyw przecinają się w pewnym punkcie osi optycznej. Promienie pochodzące spoza płaszczyzny ogniskowania przecinają się w innym punkcie. Jeżeli w punkcie przecięcia się promieni z płaszczyzny ogniskowania umieścimy przesłonę z bardzo małym otworkiem, to do detektora dotrą tylko promienie z tej płaszczyzny. Promienie pochodzące z innych miejsc obiektu zostaną przez przesłonę odbite lub pochłonięte. Zmieniając położenie przesłony z otworem wzdłuż osi optycznej uzyskuje się zmianę płaszczyzny ogniskowania. Pozwala to na uzyskanie szeregu „przekrojów” badanego obiektu na różnej głębokości. Zbiór takich przekrojów umożliwia, dzięki cyfrowej obróbce danych, stworzenie trójwymiarowego obrazu analizowanego obiektu.

Detektorem w mikroskopie konfokalnym jest niskoszumowy fotopowielacz rejestrujący w formie cyfrowej natężenie światła, które przeszło przez przesłonę. Zmieniając kierunek wiązki laserowej otrzymujemy informację o natężeniu światła pochodzącego z różnych punktów płaszczyzny ogniskowania. Ostateczny obraz przekroju obiektu w płaszczyźnie ogniskowania tworzony jest przez cyfrową obróbkę zgromadzonych danych i wyświetlany na ekranie monitora o wysokiej rozdzielczości.

.

Rozwiązania konstrukcyjne

We współczesnych mikroskopach konfokalnych stosuje się 2 odmienne rozwiązania konstrukcyjne. W obydwu otrzymuje się obraz przekroju obiektu na określonej głębokości,

Jednakże obrazy te otrzymywane są w odmienny sposób - Metoda LSCM i metoda TPCM.

W chwili obecnej możliwe jest uzyskanie pojedynczego skanu w czasie poniżej 0,05 s. Pozwala to rejestrować przebieg szybkozmiennych procesów w żywej komórce lub tkance.

Przewagą mikroskopii konfokalnej jest możliwość uzyskania serii przekrojów badanego obiektu na różnych głębokościach. Taka seria przekrojów może być wykorzystana do odtworzenia przestrzennej struktury obiektu w trzech wymiarach. Obrazy z mikroskopu konfokalnego charakteryzują się wysoką rozdzielczością i kontrastem.