Genomika porównawcza – to dział genomiki zajmujący się poszukiwaniem podobieństw i różnic między genomami różnych gatunków, co umożliwia: -wyjaśnienie zależności ewolucyjnych;
- rozbudowę wiedzy o genomie jednego gatunku w oparciu o wiedzę na temat genomu drugiego gatunku.
Technika porównawcza malowania chromosomów:
-jej istotą jest wykorzystanie sond specyficznych dla konkretnego chromosomu (tzw. sond malujących) jednego gatunku w procedurze fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) na preparatach cytogenetycznych pochodzących od innego gatunku.
Technika porównawcza malowana:
-FISH z sondą specyficzną dla konkretnego chromosomu jednego gatunku na preparacie chromosomowym reprezentującym inny gatunek.
Porównawcze malowanie chromosomów umożliwia identyfikację konserwatywnych fragmentów chromosomów w genomach różnych gatunków. 3 człowieka mają podobne sekwencje co do 16 i 19 konia.
Porównawcze malowanie chromosomów pozwala na:
-identyfikację rearanżacji chromosomowych, które zaszły w trakcie ewolucji genomów
-przewidywanie, jakie geny znajdują się we fragmentach chromosomowych badanego gatunku, które są „pomalowane” sondą chromosomu, którego sekwencja nukleotydowa i mapa genowa jest poznana.
Technika porównawczego malowania chromosomów ma jednak pewne ograniczenia:
-jej rozdzielczość jest na poziomie kilku milionów par zasad
-nie wykrywa rearanżacji wewnątrzchromosomowych (np. inwersji)
Sondy locus specyficzne :
-sondy pochodzące z klonowania molekularnego w wektorach: plazmidowych, kosmidowych, sztucznych chromosomach bakteryjnych
-sondy wyprodukowane techniką PCR
Sondy specyficzne dla chromosomów bądź ich fragmentów, utworzone na bazie DNA reprezentującym konkretny chromosom:
-sortowanie chromosomów w cytometrze przepływowowym
Sortowanie chromosomów:
-pozyskanie jednorodnej frakcji zawierającej jeden chromosom z zawiesiny pochodzącej z hodowli in vitro
-wykorzystanie cytometru przepływowego zintegrowanego z sorterem
-amplifikacja sekwencji unikalnych dla danego chromosomu PCR – przygotowanie sondy
Kariotyp „przepływowy” człowieka:
Określenie profilu DNA danego chromosomu pod względem:
-ilości DNA (długość cząsteczki) – wielkość chromosomu
-udział par AT i GC w DNA
Mikrodysekcja chromosomów:
-pozyskanie chromosomu za pomocą mikromanipulatora lub lasera z preparatu mikroskopowego
-amplifikacja (DOP-PCR) sekwencji unikalnych – przygotowanie sondy.
Porównawcze mapy genomowe u psowatych:
-sondy locus-specyficzne wyprowadzone z genomu psa wykorzystywane są do konstruowania map genomowych innych gatunków psowatych
-technika porównawczego mapowania sond pozwala na badanie ewolucji kariotypów
-lokalizacja fizyczna loci markerowych w genomach badanych gatunków umożliwia identyfikację wewnątrzchromosomowych rearanżacji.
Porównawcza lokalizacja sond pochodzących z biblioteki genomowej psa w chromosomach jenota chińskiego, psa i lisa pospolitego.
Technika porównawczej hybrydyzacji genomowej – wykorzystywana do identyfikacja regionów chromosomów, w których nastąpiła utrata (delecja) bądź amplifikacja genomowego DNA w komórkach nowotworowych.
Analiza porównawcza genomów na poziomie sekwencji nukleotydowych:
-poszczególne sekwencje są porównywane za pomocą algorytmów FASTA lub BALAST w celu znalezienia charakterystycznych regionów – motywów lub domen oraz rozpoznawania sekwencji homologicznych (od wspólnego przodka).
Analiza sekwencji nukleotydowych:
-umożliwia przeniesienie przypisanej funkcji lub innych informacji z jednej sekwencji na inną na bazie ich podobieństw
-porównywanie sekwencji z wielu genomów ułatwia wyznaczenie genu i określenie jego struktury (eksony i introny).
-umożliwia zidentyfikowanie nieznanych regionów regulatorowych, motywów i domen w sekwencjach.
Analiza porównawcza genomów na poziomie sekwencji aminokwasów:
-ułatwiają klasyfikowanie białek i ich struktur w różne grupy – rodziny, nadrodziny, ortologi i para logi.
Genomy są bardzo polimorficzne:
-wykorzystywanie w analizie genetycznej: sekwencji mikrosatelitarnych; -markery SNP
-niektóre polimorfizmy mogą mieć znaczenie funkcjonalne.
Identyfikacja milionów miejsc polimorficznych SNP umożliwia stworzenie nowego narzędzia badawczego – mikromacierze SNP.
Mikromacierz – procedura:
-izolacja genomowego DNA
-trawienie enzymem restrykcyjnym
-wiązanie z sekwencją adaptorową rozpoznającą 4-nukloetydowe lepkie końce
-amplifikacja PCR przy pomocy startera rozpoznającego sekwencje adaptera
-trawienie zamplifikowanych fragmentów DNA-za i dołączenie biotyny na końcu fragmentu
-hybrydyzacja na mikormacierzy
-skanowanie
-ustalenie genotypu.
Identyfikacja genów (polimorfizmów) odpowiedzialnych (lub sprzężonych) za daną cechę:
-analiza segregacji markerów genetycznych i alleli badanego genu w celu identyfikacji sprzężenia: marker – gen
-mikromacierze SNP – podstawowe narzędzie
GWAS – powszechnie stosowana procedura, wykorzystująca mikromacierze SNP:
-ustalenie genotypu w tysiącach SNP w dwóch grupach zwierząt: chorych i zdrowych
-porównanie częstości występowania wariantów markerów SNP
-osobniki chore są homozygotami w nieznanym sprawczym locus oraz w blisko leżących miejscach SNP.
Procedura GWAS jest również wykorzystywana do poszukiwania loci, których polimorfizm jest związany ze zmiennością cech ilościowych – np. otyłość ludzi.
Porównanie genu grup:
Osoby otyłe (BMI>30) wersus osoby z normalnym BMI (28 – 25).