Biochemia:

→ nauka dotycząca chemicznych podstaw życia

→ opisuje chemiczne składniki żywych komórek oraz zachodzące w nich reakcje i procesy

→ obejmuje ona wszystkie obszary biologii komórki, molekularnej, genetyki molekularnej

→ jej celem jest poznanie na poziomie molekularnym wszystkich procesów chemicznych związanych z życiem komórki

→ odgrywa zasadniczą rolę w medycynie

→ metody biochemiczne znajdują szerokie zastosowanie w chorobach. Stwarza to możliwość korygowania chorób metabolicznych związanych z przemianami chemicznymi

Porównanie komórki prokariotycznej i eukariotycznej:
→ nie ma wyraźnej przedziałowości w komórce bakteryjnej tzn. poszczególne organella nie mają błon

→ w komórce eukariotycznej wszystkie organella ograniczone są błonami; w związku z tym transport związków jest utrudniony, ponieważ substancje te muszą pokonywać barierę błon

Błona komórkowa:

→ błona komórkowa otacza cytoplazmę umożliwiając utrzymanie stałego środowiska wewnętrznego komórki. Jest ona z reguły nieprzepuszczalna dla wody i wodnych roztworów soli oraz różnego rodzaju innych substancji chemicznych. Niezwykle istotne dla prawidłowego przebiegu procesów biochemicznych w komórkach jest dostarczenie jej substancji pokarmowych ze środowiska zewnątrzkomórkowego. Dlatego błona ta zawiera odpowiednie systemy transportu tych substancji do wnętrza komórki. Z kolei dzięki receptorom błonowym komórka może odbierać ze środowiska zewnętrznego komórki różnego rodzaju sygnałów głównie za pomocą hormonów uwalnianych przez wewnętrzny system wydzielniczy

→ w komórkach eukariotycznych niezwykle istotna dla prawidłowego przebiegu procesów metabolicznych jest tzw. kompartmentność, która zabezpieczana jest przez system wewnętrznych błon biologicznych

→ przedziałowość determinuje kontrolę przenikania metabolitów między komórkami. Do tego służą odpowiednie systemy transportu

→ główny składnik błon to białka i lipidy (najczęściej fosfolipidy)

→ białka można podzielić na integralne i powierzchniowe (pełnią funkcje receptorów)

→ model płynno-mozaikowy, ponieważ błona stanowi mozaikę białek wbudowanych w płynną, gęstą dwuwarstwę lipidową

→ półpłynna postać lipidów ma istotne znaczenie w odniesieniu do organizmu; związków których temperatura ciała zmienia się w zależności od temperatury otoczenia

Rodzaje białek:

→ globularne

• w warstwie lipidowej

• niektóre z tych białek przenikają przez całą grubość błony

• w ten sposób komunikują się ze środowiskiem zewnętrznym

• większość białek posiada komponenty cukrowe (oligosacharydowe)

→ receptorowe

• zakotwiczone są w pewnej warstwie błony

Lipidy w błonie:

→ fosfolipidy

→ glikolipidy

→ cholesterol

Fosfolipidy:

→ fosfatydyloseryna, fosfatydylocholina, fosfatydyloetyloamina

→ fosfatydyloinozytol oprócz funkcji strukturalnej pełni również funkcję uniwersalnego wtórnego przekaźnika informacji komórki; pośredniczy on w działaniu hormonów

Receptory błonowe:

→ jedną z podstawowych funkcji komórki, która warunkuje ich życie jest reagowanie na bodźce zewnętrzne w postaci różnego rodzaju substancji chemicznych

→ substancje te wydzielane mogą być przez jedne komórki, a następnie docierają do innych wywołując określony efekt biochemiczny

→ struktury komórki zdolne są do wychwytywania i wiązania substancji o charakterze informacyjnym, są to tzw. ligandy

→ do ligandów zaliczamy: hormony, substancje drobnocząsteczkowe (jony), pochodne aminokwasów

→ receptory dla tych substancji możemy podzielić na błonowe lub wewnątrz komórkowe

→ receptory są białkami

Układ transdukcji:

→ układy zlokalizowane w błonie komórkowej uczestniczące w przekazywaniu informacji z zewnątrz komórki do wnętrza komórki nazywamy systemami transdukcji np. hipoteza wtórnego przekaźnika, która wyjaśnia mechanizm działania hormonów białkowych i peptydowych na komórkę

→ proces ten przebiega w 4 etapach:

• rozpoznanie informacji – pierwszy przekaźnik – ligand (np. hormon) jest rozpoznawany i selektywnie wiązany przez odpowiedni receptor błonowy. Do substancji oddziaływujących na komórkę poprzez receptor błonowy zaliczamy m. in. hormony peptydowe, prostaglandyny, przeciwciała, toksyny, wirusy i lektyny. To z jakim receptorem wiąże się ligand zależy w dużym stopniu od obecności w nich specyficznych sekwencji aminokwasowych

• przeniesienie informacji – pod wpływem kompleksu ligand-receptor dochodzi do zmiany konformacji białka G, które zdolne jest do aktywacji określonego enzymu (np. cyklazy adenylanowej) zlokalizowanej na wewnętrznej powierzchni plazmolemmy

• transmisja – w tym etapie systemu transdukcji następuje intensywna synteza cAMP, pod wpływem zwiększonej aktywności cyklazy adenylanowej

• odpowiedź komórki – wtórny przekaźnik (cAMP) aktywuje kinazy białkowe A (fosfotransferazy), które katalizują reakcje fosforylacji m. in. enzymów. W wyniku czego wiele z nich zmienia swą aktywność wpływając na regulację metabolizmu komórki

Transport bierny przez błony:

→ transport bierny na drodze dyfuzji prostej zgodnie z gradientem stężeń

→ dyfuzja ułatwiona zachodzi z udziałem różnego rodzaju nośników, które wiążą się w błonie z transportowanym metabolitem

→ drogą dyfuzji prostej przenika nieliczna grupa metabolitów np. amoniak, leki, CO₂

→ w dyfuzji ułatwionej wyróżniamy 2 rodzaje nośników w błonie:

• nieruchome nośniki – kanały, tunele

• ruchome - jonofory – są to polimery o różnej budowie chemicznej. Zaliczyć do nich możemy antybiotyki np. gra jest to liniowy polipeptyd składający się z 15 reszt, który tworzy w błonie poprzeczne kanały. Przez te kanały przenikają jony pokonując w ten sposób barierę błonową

Transport aktywny przez błony:

→ zachodzi wbrew gradientowi stężeń i wymaga wkładu energii swobodnej

→ transport aktywny pierwotny, gdzie przekształceniu ulega nośnik przenoszonego substratu i transport aktywny wtórny tzw. ko-transport – aktywnie przenoszony pierwszy substrat (jony Na⁺, K⁺) ta sytuacja powoduje wytworzenie gradientu elektrochemicznego, który warunkuje przeniesienie innego substratu np. cukru zgodnie z gradientem stężeń

Pompa sodowo-potasowa:

→ w większości komórek zwierzęcych w ich wnętrzu znajduje się duże stężenie K⁺ i niskie stężenie Na⁺

→ ta sytuacja spowodowana jest funkcjonowaniem układu transportu

→ pompa transportuje Na⁺ do środka, wypompowując jednocześnie K⁺

→ ale jednocześnie zużywana jest energia z ATP, która przekształca się do ADP

→ układ ten posiada duże znaczenie fizjologiczne kontrolując objętość komórki i równowagę osmotyczną i warunkuje pobudzanie nerwów i mięśni

→ ta pompa zużywa ogromne ilości energii

→ z pompą sodowo-potasową nierozerwalnie związany jest enzym adenozynotrifosfataza (jest on aktywowany przez Na⁺ i K⁺ i hydrolizuje on wiązanie fosfoestrowe przekształcając ATP do ADP

Wtórny ko-transport:

→ przykład to transport glukozy przez błonę komórkową

→ niektóre procesy transportu nie zużywają bezpośrednio energii podczas hydrolizy ATP

→ w przypadku glukozy jej transport zależy od gradientu jonów Na⁺ po obu stronach błony

→ jeżeli stężenie Na⁺ utrzymywane aktywnością pompy sodowo-potasowej wewnątrz komórki jest małe, a na zewnątrz duże powoduje to napływ jonów do wnętrza komórki zgodnie z gradientem stężeń

→ ta sytuacja wyzwala energię potrzebną do wypompowania glukozy na zewnątrz

→ Na⁺ i glukoza łączą się w obrębie błony ze specyficznym nośnikiem białkowym i wnikają do komórki

→ Na⁺, które wniknęły z glukozą do komórki są wydalane na zewnątrz za pomocą pompy sodowo-potasowej

Jądro komórkowe:

→ największe organellum w cytoplazmie

→ zawiera średnio 10% DNA, 10% białek histonowych, 70% białek niehistonowych, niedużą ilość ale zmienną RNA

→ obecne są węglowodany i lipidy

→ funkcje:

• główne przemiany dotyczące kwasów nukleinowych (DNA i RNA)

• jednym z zasadniczych elementów jądra jest chromatyna. Stanowi ona interfazową postać chromosomów. Zawiera DNA, w którym zapisana jest informacja genetyczna dotycząca struktury I-rzędowej białek (sekwencja aminokwasowa). Chromatyna składa się z 30-40% białek histonowych, 10% białek histonowych, 1-10% RNA

→ histony to białka o masie cząsteczkowe 10-30 kilodaltonów. Te białka połączone są ściśle z DNA

→ białka niehistonowe są bardziej zróżnicowane i stanowią dużą grupę białek o właściwościach fizykochemicznych i biologicznych

→ DNA występuje w jądrze w postaci silnie skondensowanej

→ u człowieka długość całego DNA wynosi 2m

→ takie upakowanie związane jest z organizacją chromatyny

• nukleosom

• solenoid

• struktury wyższego rzę

Nukleosom:

→ podstawowa jednostka chromatyny o średnicy 10nm

→ zbudowany z DNA, białek globularnych i histonowych

→ na te białka nawijane jest DNA

→ białkowy rdzeń histonu jest oktamerem zbudowanym ze wszystkich histonów oprócz H1

→ cząsteczki takie wiążą się między sobą za pomocą łącznikowego DNA składającego się z 30-50 par zasad i tworzą tzw. włókno nukleosomowe

→ natomiast histon H1 wiąże się z łącznikowym DNA stabilizując jego strukturę

→ w komórce eukariotycznej wykryto również skręcenia DNA wyższego rzędu nawiniętego jeszcze bardziej

→ takie upakowanie DNA daje możliwość skrócenia struktury, umieszczenia w jądrze

→ w chromatynie występuje białko niehistonowe luźnie wiążące z DNA np. enzymy, które uczestniczą w procesach metabolicznych zachodzących w jądrze

Matrix jądrowa:

→ wewnętrzny szkielet jądrowy stanowi matrix jądrowa, której zadaniem jest utrzymanie struktury jądra

→ ta struktura uczestniczy w transkrypcji, transporcie DNA jądrowego do cytoplazmy

→ wiąże też receptory hormonów głównie steroidowych

Jąderko:

→ integralną częścią jądra jest jąderko, które stanowi do 40% podstawowej masy jądra

→ liczba jąderek jest różna, zależy od płci i fazy cyklu komórkowego

→ główne składniki to RNA i ok. 200 białek (związane z syntezą rRNA)

→ jądro oddzielone jest błoną w okolicy której jest dużo nukleaz

WYKŁAD 2

Mitochondrium:

• u ssaków mitochondria występują we wszystkich komórkach oprócz erytrocytów

  → nazywane są siłownią komórki, ponieważ właśnie tam zachodzi większość przemian biochemicznych, prowadzących w końcowym efekcie do syntezy energii

• energia ta magazynowana jest głównie w postaci ATP

• podstawową funkcją mitochondriów jest produkcja dwóch form energii swobodnej:

• protonowej siły motorycznej (siły protonomotorycznej)

• ATP

• te dwie formy energii pochodzą z przetworzonego potencjału oksydoredukcyjnego

• w mitochondrium zachodzą procesy związane z pobieraniem tlenu i wydzielaniem energii

• procesy te zachodzą dzięki utlenianiu: węglowodanów, lipidów, białek do CO₂ i H₂O

Przemiany w mitochondriach:

• cykl kwasów trikarboksylowych (Krebsa)

• β-oksydacja kw. tłuszczowych (utlenianie kwasów tłuszczowych)

• dekarboksylacja oksydacyjna 2-oksokwasów

  → częściowo: biosynteza mocznika, biosynteza hemu i kwasów tłuszczowych (w mitochondriach zachodzi wydłużanie kwasów tłuszczowych)

Budowa mitochondrium:

→ mitochondria zawierają pozajądrowy DNA zdolny do replikacji (namnażania), tj. ok. 1% całości DNA w komórce

→ DNA ten posiada informację genetyczną

→ synteza białek na podstawie tego DNA to tzw. dziedziczenie pozachromosomalne

→ tym sposobem syntetyzowana jest nieliczna ilość białek (do 15% całej puli białek komórki)

→ syntetyzowane białka:

• niektóre podjednostki enzymów oksydoredukcyjnych, np. podjednostki F0, F1,

• syntetazy ATP - kluczowego enzymu w procesie fosforylacji oksydacyjnej, czyli w syntezie ATP

• pozostała część białek, która jest w mitochondrium musi być dostarczona tam z cytoplazmy za pomocą odpowiednich systemów transportujących

→ ilość mitochondriów w komórce uzależniona jest od zapotrzebowania energetycznego

→ mitochondria oddzielone są od cytoplazmy za pomocą 2 błon lipidowo-białkowych

→ mitochondria zawierają w stosunku do suchej masy ok. 70% białek (głównie enzymów, gdyż jest tam dużo szlaków metabolicznych)

→ oprócz tych białek jest ok. 25% lipidów, i niewielkie ilości DNA i RNA (w matrix)

→ obie błony zawierają w swym składzie różne ilości białek i lipidów, co determinuje ich różną przepuszczalność dla różnych rodzajów substancji

Błona zewnętrzna:

→ znajdują się tu enzymy odpowiedzialne za wydłużanie łańcucha kw. tłuszczowych a przede wszystkim tzw. receptory importu białek

→ błona ta jest nieprzepuszczalna dla substancji wysokocząsteczkowych

→ natomiast swobodnie przez tą błonę mogą przechodzić substancje o masie cząsteczkowej do 10 kDa

→ substancje te przenoszone są przez kanał utworzony przez porynę (poryna to białko tworzące tunel w miejscu kontaktu obu błon – zewnętrznej i wewnętrznej)

→ miejsca kontaktowe pełnią istotną rolę w metabolizmie, szczególnie przy imporcie białek do mitochondrium oraz ich modyfikacji potranslacyjnych

→ poryna zawiera na n-końcu krótką sekwencję kierującą, a w dalszej części długi fragment hydrofobowy, który stanowi sygnał STOP, co umożliwia gromadzenie tego białka w błonie

Błona wewnętrzna:

→ jest o wiele bardziej selektywna

→ przepuszcza jedynie niektóre związki drobnocząsteczkowe takie jak O₂, H₂O, CO₂, kwas pirogronowy, octowy, acetooctowy

→ w wewnętrznej błonie zlokalizowanych jest wiele różnego rodzaju przenośników, które transportują substancje do matrix mitochondrium

→ takim specyficznym elementem przenośnikowym jest karnityna, pochodna kwasu aminoizomasłowego, która przenosi do matrix długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, gdzie są one utleniane

→ mitochondria odgrywają istotną rolę w inicjacji programowanej śmierci komórki (apoptozy).

Istotą życia jest powielanie (człowiek = 100 bilionów komórek). W ciągu godziny tracimy ok. 50 mld komórek

Cykl komórkowy u eukariota można podzielić na fazy:

→ faza G1 – komórka sprawia wrażenie jakby nic się z nią nie działo, ale ona w tym czasie intensywnie rośnie. Gdy osiągnie odpowiednie rozmiary, przechodzi przez punkt progowy R i już nie ma odwrotu - niezależnie od warunków musi się podzielić. Po drodze czeka ją faza S (jak syntaza)

→ faza S – dochodzi do podwojenia DNA

→ faza G2 – dochodzi do syntetyzowania białek

→ faza M – zachodzi mitoza (dzielenie, gdy jest dużo białek DNA) – komórka się dzieli na dwie komórki

Cykl komórkowy:

→ czas trwania poszczególnych faz cyklu jest różny dla różnych komórek (u ssaków od 10 do 30 godzin)

→ nad sprawnością cyklu komórkowego czuwają określone geny i ich produkty (białka)

→ zaburzenia w kontroli cyklu komórkowego mogą z jednej strony prowadzić do niekontrolowanych podziałów komórkowych (w konsekwencji nowotwór), lub może prowadzić do śmierci komórki. Śmierć komórek jest procesem fizjologicznym (jak proliferacja, czy różnicowanie), zachodzi w każdym żywym organizmie. Na początku lat ’90 okazało się, że śmierć komórki jest procesem bardzo skomplikowanym. Od tego momentu wyróżniamy 2 rodzaje śmierci komórki:

• nekroza

• apoptoza

Nekroza:

→ martwica, nekrotyczna śmierć komórki

→ degradacja DNA nie jest charakterystyczna

→ objętość komórki rośnie

→ uszkodzenie błon cytoplazmatycznych, obrzęk mitochondriów, pękanie komórek, wyciek składników

→ fagocytoza przez makrofagi i inne komórki odczynu zapalnego

→ zawsze występuje odczyn zapalny

→ brak syntezy de novo mRNA i białek

→ czas trwania do kilkunastu minut

Apoptoza:

→ programowana śmierć

→ degradacja DNA jest bardzo precyzyjna

→ objętość komórki maleje

→ struktury cytoplazmatyczne zachowują pełną integralność

→ komórki rozpadają się uwalniając ciałka apoptotyczne, które są fagocytowane przez sąsiednie komórki

→ brak odczynu zapalnego

→ proces kontrolowany genetycznie, zachodzi synteza DNA i białek de novo

→ czas trwania – ok. kilku godzin do kilkunastu dni

Procesy związane z apoptozą:

→ procesy fizjologiczne:

• embrionogeneza

• morfogeneza

• wymiana komórek w tkankach proliferujących (skóra, nabłonki)

• dojrzewanie tymocytów i komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym

• obumieranie komórek w gruczole mlekowym po zakończonej laktacji

• cykl menstruacyjny

• atrezja pęcherzyków jajnikowych

• oogeneza

• spermatogeneza

→ procesy patologiczne:

• AIDS

• choroba Alzheimera

• zamieranie komórek nowotworowych

Molekularne mechanizmy apoptozy - 3 etapy:

→ I - przekazywanie sygnału do indukcji procesu samounicestwienia (komórka musi podjąć decyzję o popełnieniu samobójstwa, zapada ona na podstawie informacji o procesach wewnętrznych zachodzących w komórce oraz sygnałów docierających do niej z otoczenia(należy zaznaczyć, że odpowiedź komórki na te sygnały może być różna))

→ II – uaktywnienie genów, których produkty biorą udział w samounicestwieniu komórki (faza efektorowa)

→ III – zmiany strukturalne prowadzące do śmierci komórki

Czynniki wywołujące apoptozę:

→ fizyczne:

• różnego rodzaju promieniowanie

• szok termiczny

→ chemiczne:

• cytostatyki

• jonofory

• wolne rodniki tlenowe

→ biologiczne:

• glukokortykoidy

• czynnik martwicy nowotwory (TNF – tumor necrosis factor)

• niedobór czynników wzrostowych

Regulacja apoptozy:

→ apoptoza jest regulowana genetycznie

→ programowana śmierć komórki to proces aktywny wymagający ekspresji wielu genów (syntezy mRNA i białek)

→ geny warunkujące proces apoptozy nazwano genami śmierci (CED)

→ do dzisiaj zidentyfikowano kilkanaście różnych genów, których wzrost ekspresji obserwuje się po zadziałaniu czynnika stymulującego apoptozę

→ białka warunkujące apoptozę nie znajdują się w komórce w normalnych warunkach. Są produkowane kiedy dojdzie do stymulacji apoptozy

→ Bcl-2 – blokowanie apoptozy

→ p-53 – zmutowany – blokowanie, niezmutowany – stymuluje

→ ced3, ced4, ced9 – stymulują;

→ TRPM2, geny CIEGS, c-fos, c-jun, c-myc – stymulują;

→ bcl_xl(large) – blokuje;

→ bcl_xs(small) – stymuluje;

→ bax, bak – stymuluje;

Bcl-2

→ pierwotnie wykryty w różnych białaczkach i chłoniakach

→ koduje on 2 białka: pBCL-2α i pBCL-2β

→ produkty genu hamują apoptozę

→ nadaje komórkom odporność na chemioterapię

p-53

→ gen supresorowy nowotworów

→ podwyższona ekspresja w komórkach nowotworowych

→ aktywacja w przypadku uszkodzeń DNA

→ ekspresja tego genu powoduje zatrzymanie podziałów komórkowych w fazie G1

→ jeżeli uszkodzenia DNA są zbyt rozległe, produkt tego genu indukuje komórkę do „popełnienia samobójstwa” w ucieczce przed transformacją nowotworową

→ wzrost ekspresji p53 wpływa specyficznie na aktywację innych genów indukowanych w procesie apoptozy

Enzymy uczestniczące w apoptozie:

→ transglutaminazy – odpowiedzialne za syntezę sieci białkowej ciałek apoptotycznych podczas ich tworzenia, nie dopuszczają do wycieku macierzy komórkowej

→ endonukleazy – odpowiedzialne za fragmentację DNA w komórkach apoptotycznych, (pierwszy nieodwracalny etap w procesie apoptozy)

→ kaspazy – są enzymami należącymi do grupy proteaz cysteinowych, rozszczepiających łańcuch polipeptydowy w pobliżu reszt asparaginowych (substratami kaspaz są liczne białka cytoplazmatyczne i jądrowe, które degradowane są w podczas procesu apoptozy). Tną białka

→ cytochrom C – indukuje kaskadę reakcji prowadzących do aktywacji kaspaz

Etapy apoptozy w mitochondrium dzielimy na:

→ kluczową rolę decyzyjną w apoptozie odgrywa mitochondrium

→ faza mitochondrialną – dochodzi do wzmocnienia sygnału śmierci

→ faza postmitochondrialna - w której uczestniczą białkowe czynniki aktywujące apoptozę takie jak cytochrom C, AIF (apoptose induction factor), kaspazy. Wydostające się z przestrzeni mitochondrialnej białka zapoczątkowują fazę wykonawczą apoptozy. Kaspazy występują w postaci proenzymów (prokaspaz nieaktywne). W apoptozie jedna kaspaza aktywuje następną. Głównych kaspaz jest 9. Kaspazy degradują ważne dla życia komórki białka takie jak: aktyna, enzymy – polimerazy, kinazy, inne białka strukturalne. Czynnikiem warunkującym aktywację kaspaz jest cytochrom C

→ w latach 80 odkryto zjawisko gwałtownej zmiany przepuszczalności mitochondriów pod wpływem jonów Ca, czemu towarzyszyło rozprzężenie energetyczne. Z kolei w latach 90 wykazano istnienie złożonych kompleksów porowych zwanych megakanałami mitochondrialnymi na styku wewnętrznej i zewnętrznej błony komórkowej. Otwarcie takich kanałów indukowane różnymi bodźcami łączy się ze spadkiem potencjału w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej. Dochodzi do uwalniania białek z przestrzeni międzybłonowej. Stwierdzono, że załamanie się potencjału błonowego w mitochondrium jest pierwszym objawem rozpoczynającej się apoptozy w komórce. Wykazano, że spadek potencjału w jednym mitochondrium powoduje równoczesny spadek we wszystkich mitochondriach w komórce

→ cytochrom C oprócz udziału w inicjacji procesu apoptozy jest integralnym składnikiem mitochondrialnego łańcucha oddechowego. W odróżnieniu od wszystkich składników łańcucha oddechowego cytochrom C nie jest na stałe związany z wewnętrzną błoną mitochondrialną, dzięki czemu może wypływać przez megakanał do cytoplazmy i aktywować kaspazy (tną białka)

Podsumowanie apoptozy:

→ apoptoza stanowi aktywną samozagładę nadliczbowych, niewłaściwych i bezużytecznych komórek, zarówno w okresie rozwoju embrionalnego oraz w życiu dorosłego organizmu

→ jest przeciwieństwem mitozy związaną z proliferacją komórek

→ szlaki komórkowe prowadzące do apoptozy i proliferacji zawierają jednak wiele elementów wspólnych

→ można przypuszczać, że w świetle aktualnej wiedzy, że stanowią część tego samego mechanizmu

→ stąd aktualnym zadaniem badawczym jest odkrycie miejsc na tym szlaku, w którym zapada decyzja o „być”, albo „nie być” komórki

WYKŁAD 3

Rybosomy:

→ występują w cytoplazmie komórkowej

→ stanowią zasadniczy element aparatu biosyntezy białka

→ wyróżniamy 2 rodzaje rybosomów

→ występują różnice w budowie rybosomów

• u eukariota 80S (60S – większa podjednostka, 40S) i prokariota 70S (50S, 30S) (70S – występują też w mitochondriach komórek eukariotycznych)

• różnią się stałą sedymentacji – miara masy cząsteczkowej (kwasy nukleinowe są dużymi cząsteczkami)

→ zasadniczym składnikiem rybosomów jest rRNA

→ w małej podjednostce występuje jeden rodzaj rRNA, a w dużej u eukariota 3 rodzaje tego kwasu: 28, 5 i 8S

→ w jąderku występuje kwas o stałej sedymentacji 5S

→ oprócz RNA w rybosomach występują białka zasadowe zbliżone składem do białek histonowych, pełnią one głównie funkcje strukturalne i wykazują zdolność wiązania rRNA.

→ występują tam też białka kwaśne, ale są to głównie białka enzymatyczne, a ich rola związana jest głównie z procesem translacji w biosyntezie białka

→ właściwym aparatem biosyntezy białka jest polisom, który jest zbudowany z mRNA i określonej liczby rybosomów

→ obecność polisomów w komórce jest wyznacznikiem o aktualnie przebiegającym procesie translacji (czyli właściwym procesie biosyntezy białka)

→ polisomy mogą występować w cytozolu, lub mogą być związane z błonami siateczki śródplazmatycznej

→ na strukturze siateczki powstają białka, które są następnie transportowane do innych organelli komórkowych

Retikulum endoplazmatyczne:

→ najbardziej zróżnicowaną morfologicznie strukturą błoniastą komórki jest retikulum endoplazmatyczne

→ błony siateczki śródplazmatycznej stanowią ok. 50% błon całej komórki

→ wyróżniamy dwa rodzaje ER:

• siateczkę szorstką – ziarnistą. Na jej cytoplazmatycznej stronie występują rybosomy w postaci polisomów - RER

• siateczkę gładką – bezziarnistą - SER

→ w siateczce znajduje się wiele enzymów związanych z po(st)translacyjną modyfikacją białek

→ oprócz tych enzymów występują enzymy związane z syntezą lipidów, utlenianiem i redukcją oraz z neutralizacją różnego rodzaju szkodliwych dla komórki substratów

→ w błonach retikulum endoplazmatycznego zidentyfikowano aktywność ATPazy zależnej od jonów wapniowych, która umożliwia transport jonów wapniowych do światła retikulum

→ retikulum obok mitochondriom jest głównym rezerwuarem jonów wapniowych w komórce

→ skład enzymów jest specyficzny komórkowo (różne komórki mają rożne enzymy, w zależności od zachodzących procesów)

Aparat Golgiego:

→ podobnie jak retikulum jest zbudowany z systemu cystern i kanalików

→ główna rola aparatu Golgiego to udział w przepływie składników błon i ich przebudowie oraz glikozylacji (dodanie cukrowców) różnych substratów

→ podczas procesu endocytozy dochodzi do zużycia całych fragmentów błony

→ aparat Golgiego bierze udział w dostarczaniu do plazmolemy nowosyntetyzowanych składników, ale również bierze udział w degradacji lipidów i białek

→ przepływ składników błony z RER przez aparat Golgiego do błony plazmatycznej (plazmolemy) odbywa się za pomocą mikropęcherzyków (pęcherzyki transportujące składniki błon, transportujące wydzielinę, wakuola zagęszczająca i ziarno wydzielnicze)

→ kluczową rolę odgrywa podstawowa struktura aparatu Golgiego – diktiosom (4-8 cystern ułożonych w formie stosów)

→ w diktiosomie zachodzi synteza składników warstwy ochronnej komórki zwierzęcej

→ białka wydzielnicze (glikoproteiny po uprzedniej glikozylacji), wytwarzane w RER, na swej drodze do powierzchni błony przemieszczają się przez diktiosom, w którym zachodzą intensywne przemiany łańcuchów oligosacharydowych

→ w aparacie Golgiego zachodzi też glikozylacja peptydów poprzez wytwarzanie wiązania o-glikozylowego z udziałem grup hydroksylowych seryny i treoniny

Lizosom:

→ ograniczone są pojedynczą błoną i zawierają szereg kwaśnych enzymów hydrolitycznych zdolnych do rozkładu różnych makrocząsteczek biologicznych - najczęściej dotyczy to substratów zbędnych i niepotrzebnych komórce

→ są śmietnikiem komórki – tam są trawione niepotrzebne substancje powstające w procesach degradacyjnych

→ enzymy lizosomalne zdolne są do trawienia substratów egzogennych pobranych na drodze endo- lub fagocytozy jak i substancji endogennych wewnątrz komórki

• nukleazy hydrolizują kwasy nukleinowe

• proteazy hydrolizują białka

• glikozydazy hydrolizują makrocząsteczki z komponentą cukrowcową

• lipazy hydrolizują tluszcze

• fosfatazy odszczepiają reszty ortofosforanowe

• fosfolipazy hydrolizują lipidy zawierające komponenty fosforanowe

→ utrzymanie pH 4,5 jest utrzymywane dzięki pompie protonowej

Peroksysomy:

→ podobnie jak lizosomy otoczone są pojedynczą błoną

→ wykryto w nich ponad 40 enzymów i są to głównie enzymy oksydoredukcyjne

→ biorą udział w utlenianiu biologicznym zużywając na te procesy do 20% tlenu wykorzystywanego przez komórkę

→ oksydazy peroksysomowe:

• oksydaza moczanowa

• oksydaza D-aminokwasów

• oksydaza poliamid

→ enzymy β-oksydacji kwasów tłuszczowych:

• dehydrogenaza acetylo Co-A

• hydrataza enoilo Co-A

• acylotransferaza acetylo Co-A

• dehydrogenaza 3-hydroksyacylo-Co-A

→ enzymy transportu i aktywacji kw tłuszczowych:

• acylotransferaza karnitynowa

• syntetaza (ligaza) acetylo-Co-A

Cytoszkielet:

→ cytoplazma komórek eukariotycznych wykazuje zdolność do ruchu, co jest niezbędne do pobierana przez komórkę i wprowadzania w jej obrębie składników pokarmowych, co jest niezbędne do jej prawidłowego funkcjonowania

→ wewnętrzne przemieszczanie się cytoplazmy umożliwia też wydzielanie różnego rodzaju substancji oraz wyrównywanie ich stężeń

→ cytoszkielet składa się z kilku rodzajów włókien wewnątrzkomórkowych, które dzielimy na 3 grupy:

• mikrotubule – średnica 25 nm – występują we wszystkich komórkach Eukariota, oddziaływają z innymi składnikami cytoplazmy, co wpływa na zdolność do ruchu szczególnie w procesie mitotycznego podziału jądra

• filamenty pośrednie – średnica 10 nm – rozmieszczone głównie około jądra, znaczenie podporowe w obrębie cytoszkieletu

• mikrofilamenty – struktury kurczliwe, średnica 6 nm, zbudowane z aktyny (filamenty aktynowe), lub miozyny i aktyny (filamenty miozynowe

• Gospodarka wodna organizmu:

→ woda to najlepszy rozpuszczalnik dla zw. organicznych i nieorganicznych hydrofobowych

→ dzięki wodzie możliwy jest w komórce transport substancji odżywczych ale też produktów przemiany materii, biokatalizatorów w tym enzymów (ponieważ enzymy są białkami to ich odwodnienie powoduje utratę aktywności)

→ woda bierze udział w regulacji temperatury ciała

→ bardzo ważnym zagadnieniem jest udział wody w działaniu enzymów hydrolitycznych, które posiadają zdolność rozszczepiania różnego rodzaju substratów, m.in. w lizosomach, ale do ich działania niezbędne jest środowisko wodne

→ ciśnienie onkotyczne i osmotyczne zależy od wody

→ na gospodarkę wodną wpływa układ nerwowy i układ wydzielania wewnętrznego, gdzie wydzielane są m.in. hormony

→ ilość wody pobieranej przez organizm jest mniejsza od ilości wody wydalanej, dlatego, że część wody w organizmie powstaje w wyniku utleniania komórkowego (np. w łańcuchu oddechowym)

→ największa ilość wody wydalana jest przez nerki (u ssaków 50%), przez skórę 20-25%, płuca 20%

→ im bardziej intensywna przemiana materii tym większe zapotrzebowanie na wodę

→ ujemny bilans u ssaków występuje głównie w stanach patologicznych (biegunki, wymioty)

Składniki mineralne:

→ metale życia – bez nich komórka i organizm nie mogą istnieć

→ możemy te składniki podzielić na pierwiastki

• główne: Cl, P, Mg, K, S, Na, Ca, Fe, Cu, Zn, Mg, Co, Mb, Se, J, F

• śladowe: Ni, Sn, Pb, Cd

  → zadaniem tych pierwiastków jest aktywacja szeregów białek funkcjonalnych czyli enzymów, hormonów

→ obecność składników mineralnych w formie jonowej jest niezbędna do utrzymania wody w organizmie

→ składniki mineralne dostarczane są przez przewód pokarmowy a wydalane głównie przez nerki i gruczoły potowe

Cl ^- :

→ pełnią szczególną rolę w wytwarzaniu ciśnienia osmotycznego

→ wpływają na aktywność wydzielnicza nerek

→ aktywatory niektórych enzymów (amylaza ślinowa, pepsynogen)

→ biorą udział w wymianie gazowej

→ zmniejszenie ich stężenia w organizmie przy długotrwałych biegunkach i wymiotach, zatruciu ciążowym, przewlekłych stanach zapalnych

P ^- :

→ większość fosforu jest umieszczona w kościach w postaci soli wapniowych i magnezowych

→ ortofosforan nieorganiczny uczestnicy w procesie fosforylacji oksydacyjnej (wytwarzanie ATP), hydrolizie glikogenu i fosforylacji substratowej (wytwarzanie ATP na poziomie substratu)

→ pełnią rolę jako układy buforowe krwi

→ występują w nukleotydach i kwasach nukleinowych

→ ortofosforan jest przenoszony za pomocą fosfotransferaz (kinaz białkowych) ze związków bogato energetycznych na inne

→ bez obecności tych jonów niemożliwa jest fosforylacja i związana z tym aktywacja szeregu enzymów odgrywających kluczową rolę w metabolizmie innych przemianach

→ większość enzymów jest aktywowana w procesach fosforylacji

Mg:

→ aktywator wielu enzymów

→ uczestniczą w wielu procesach biochemicznych takich jak replikacja DNA, biosynteza mocznika, metabolizm węglowodanów, transport z udziałem ATP

→ niedobór może powodować miażdżycę

Na i K:

→ stanowią rezerwę alkaliczną organizmu

→ biorą udział w transporcie substratów przez błony komórkowe (pompa sodowo-potasowa), transport glukozy

→ razem z chlorkami utrzymują ciśnienie osmotyczne

→ przy niedoczynności części korowej nadnerczy dochodzi do nadmiernego wydalania jonów sodu i chlorków i wody też co skutkuje zaburzeniami metabolicznymi

S ^2- :

→ składniki niektórych witamin ( biotyna, tiamina)

→ wpływają na procesy enzymatyczne

→ występują w aminokwasach siarkowych (cysteina, cytyna, metionina – główny dawca grup metylowych w procesach metyzacji)

→ występują w tripeptydzie glutationie (cysteina) - naturalnym układzie oksydoredukcyjnym

→ pochodna cysteiny – tauryna – występuje w kwasach żółciowych

→ pochodna tiolohistydyna – ergotioneina występuje w krwinkach czerwonych i plazmie nasienia

→ reszta cysteiny jest grupą czynną Co-A, który bierze udział w aktywacji kw. tłuszczowych i ich β-oksydacji

Ca ²⁺ :

→ występują we wszystkich tkankach

→ uczestniczą w budowie kości i zębów

→ w ich metabolizmie i wchłanianiu uczestniczy wit D3 przyspieszając syntezę białek wiążących wapń (w proces ten zaangażowane są również parathormon i kalcytonina)

→ uczestniczą w procesie krzepnięcia krwi

→ są aktywatorami wielu enzymów

→ wapń jest wypierany z organizmu przez między innymi magnez

→ nagłe obniżenie poziomu tych jonów skutkuje tężyczką

Zn:

→ pełni rolę w wydzielaniu insuliny

→ są grupą czynną niektórych enzymów

→ biorą udział w regulacji ekspresji genów w eukariota (palec cynkowy)

→ niedobór cynku powoduje zahamowanie wzrostu i zmiany skórne

Fe ²⁺ :

→ do organizmu dostają się w formie jonów dwuwartościowych

→ w połączeniu z białkiem ściany jelita – apoferrytyna - powstaje ferrytyna zawierająca Fe ³⁺ i po odłączeniu jon żelaza przekształca się w Fe ²⁺ i przedostaje się do krwi

→ biorą udział w procesach oddychania i utleniania komórkowego

→ składnik hemoglobiny, mioglobiny i cytochromów łańcucha oddechowego

→ regulator aktywności szeregu enzymów

Cu:

→ udział w syntezie hemoglobiny. Jest składnikiem enzymów oksydoredukcyjnych. Bierze udział w transporcie w cytoplazmie

Mn:

→ aktywatory niektórych enzymów (dehydrogenaza, arginaza)

→ wpływają pozytywnie na rozwój zarodków

→ niedobór wpływa ujemnie na wydzielanie mleka.

F:

→ inaktywują niektóre enzymy , głównie fosfatazy z klasy hydrolaz

Se:

→ wykazują korzystny wpływ na utlenianie komórkowe

→ w organizmie związane są z białkami (selenoproteinami, np. peroksydazy)

→ posiadają właściwości przeciwzapalne

→ chronią błony komórkowe przed uszkodzeniami przez wolne rodniki

→ uczestniczą w naprawie DNA

J:

→ występują głównie w tarczycy jako jodowe pochodne tyrozyny – hormon tarczycy

WYKŁAD 4

Synteza nukleotydów:

→ człowiek i inne ssaki syntetyzują nukleotydy ze związków pośrednich, w ilościach, które wystarczają zarówno do syntezy kwasów nukleinowych, jak i do budowy nukleotydów np. wysokoenergetycznych, cyklicznych

→ kwasy nukleinowe które są uwolnione ze strawionych nukleoprotein ( w wyniku proteolizy w przewodzie pokarmowym) są trawione do mononukleotydów, następnie do nukleozydów a one są albo absorbowane przez organizm, albo dalej degradowane do zasad purynowych i pirymidynowych. (enzymy odpowiedzialne za to, to fosforylazy jelitowe)

Katabolizm zasad purynowych:

→ zachodzi w wątrobie

→ puryny są utleniane w końcowym etapie do kwasu moczowego i wydalane z moczem

→ kwas moczowy jest końcowym produktem u małp człekokształtnych, gadów lądowych, człowieka, ptaków

→ u innych ssaków kwas moczowy pod wpływem oksydazy moczanowej przekształca się do allantoiny

Katabolizm pirymidyn:

→ zachodzi w wątrobie

→ dochodzi do wytworzenia łatwo rozpuszczalnych produktów końcowych (β-alanina, kwas 3-aminoizomasłowy, który przekształca się kwas bursztynowy wchodzący do cyklu Krebsa)

Pochodzenie atomów węgla i azotu tworzących pierścień purynowy (synteza pierścienia purynowego):

C N

^{6 7}

N_{1 5}C

| || ₈C

C_{2 4}C

_{3 9}

N N
H

Różnice między syntezą puryn i pirymidyn:

→ oba procesy zachodzą w wątrobie i obejmują wspólne prekursory: PRPP (fosforybozylo-1-pirofosforan), glutamina, CO2, asparaginian

→ podstawowa różnica polega na tym, że fosforan rybozy jest integralną częścią najwcześniejszego prekursora w syntezie puryn, co oznacza, że synteza puryn odbywa się na pierścieniu rybozy, a w przypadku pirymidyn przyłączenie PRPP do zasady pirymidynowej następuje w późniejszych etapach syntezy

→ procesy syntezy puryn i pirymidyn wymagają znacznego wkładu energetycznego, w tym przypadku pochodzącego z ATP

Szlak syntezy puryn:

→ dołączenie się grupy amidowej glutaminy do PRPP i powstaje aminorybozylo-5-monofosforan

→ do azotu amidowego glutaminy (przy udziale ATP) dołącza się cząsteczka glicyny i rodnika formylowego i powstają elementy pierścienia imidazolowego

→ następnie przy drugiej cząsteczce glutaminy rozpoczyna się synteza pierścienia pirymidynowego

→ powstałe elementy imidazolu łączą się w pierścień imidazolowy

→ do pierścienia imidazolowego, który powstał, w pozycji C5 dołącza się CO₂ a następnie grupa aminowa pochodząca z kwasu asparaginowego

→ do azotu trzeciego (z glutaminy) przyłącza się rodnik formylowy

→ zamknięcie pierścienia, który z resztą imidazolową tworzy pierścień purynowy z wytworzeniem IMP (inozyno-5-monofosforanu)

Szlak syntezy pirymidyn:

→ w syntezie tego pierścienia biorą udział: karbamoilofosforan, który powstaje z dwutlenku węgla i amoniaku oraz asparaginian

→ dochodzi do utworzenia kwasu karbamoiloasparaginowego

→ odłącza się cząsteczka wody i powstaje pierścieniowy kwas dihydroorotowy, który po odwodorowaniu daje kwas orotowy

→ on łączy się z PRPP, tworzy się OMP , które po dekarboksylacji tworzy UMP, które po wzbogaceniu w energię daje UTP, reaguje z glutaminą dając CTP

Cykl nukleotydów purynowych:

→ przemiana AMP w IMP

→ regulacja tego procesu nukleotydów purynowych odbywa się na etapie deaminazy

→ u ludzi, u których występuje brak tego enzymu następuje nagromadzenie AMP i objawami klinicznymi są skurcze i bóle mięśni

→ wykazano, że niedobór tego enzymu zaburza przebieg cyklu odtwarzania IMP z AMP i powoduje upośledzenie wytwarzania energii. Wynikiem tego jest zmęczenie mięśni, które wolniej regenerują energię

Przepływ informacji w komórce:

→ replikacja – pierwszy etap przepływu informacji w komórce (powielenie materiału genetycznego)

→ transkrypcja – przepisywanie informacji genetycznej z DNA na mRNA

→ dojrzewanie mRNA – obróbka potranskrypcyjna, zabezpieczenie pierwotnego transkryptu przed działaniem enzymów

→ translacja – biosynteza białka - w cytoplazmie na rybosomach

Organizacja genomu:

→ genom - całość kwasu nukleinowego, który zawiera informację genetyczną

→ gen – odcinek DNA stanowiący matrycę do syntezy ciągłego łańcucha RNA (np. mRNA), a w dalszej kolejności polipeptydu czyli białka

→ każda komórka organizmu wielokomórkowego zawiera tę samą informację genetyczną w postaci takich samych sekwencji DNA

→ ludzki genom haploidalny każdej komórki składa się z 3,3 miliarda par zasad podzielonych na 23 chromosomy

→ większość DNA, które znajduje się w komórce nie jest DNA kodującym, czyli oznacza to, że zawarta w DNA informacja nigdy nie jest tłumaczona na sekwencję aminokwasów

→ u eukariota DNA występuje oprócz w jądrze również w mitochondriach

→ regiony kodujące w DNA czyli eksony przedzielone są zazwyczaj sekwencjami niekodującymi czyli intronami

→ dlatego pierwotne transkrypty (pre-mRNA, pre-tRNA, pre-rRNA) muszą podlegać w jądrze tzw. obróbce potranskrypcyjnej, czy też dojrzewaniu

Chromatyna:

→ podstawową jednostką chromatyny jest fibryla zbudowana z wtórnie skręconej cząsteczki DNA, związanej z białkami histonowymi (czyli nukleosom)

→ ze względu na stopień kondensacji fibryn chromatynowych wyróżniamy

• heterochromatyna – silnie skondensowana, nie ulega rozluźnieniu w cyklu komórkowym. Występuje tu satelitarny DNA, który nigdy nie ulega transkrypcji

• euchromatyna – może występować w formie zdekondensowanej i wówczas przejawia aktywność genetyczną (transkrypcyjną), lub skondensowanej – nie wykazuje tej aktywności

→ cały genom ssaka replikuje się w ciągu 9 godzin

Replikacja:

→ rozpoczyna się w fazie S cyklu komórkowego

→ replikacja dzieli się na trzy etapy:

• rozdzielenie dwóch nici DNA i zabezpieczenie pojedynczej nici DNA przed atakiem nukleaz

• synteza DNA w kierunku od końca 5’ do 3’ nowej nici, gdyż nie ma enzymu zdolnego do polimeryzowania DNA w odwrotnym kierunku

• zabezpieczanie przed błędami w replikacji poprzez sprawdzenie, czy właściwa zasada jest dołączona do łańcucha polinukletydowego

→ we wszystkich tych etapach biorą udział odpowiednie białka:

• helikaza – rozplata podwójną helisę; biorące udział w replikacji, białka destabilizujące spiralę, rozrywają wiązania wodorowe między parami zasad w łańcuchu DNA

• prymaza – syntetyzuje starterowy odcinek RNA; polimeraza RNA, która katalizuje syntezę starterów

• białka SSB – stabilizuje rejony jednoniciowe; białka wiążące się z pojedynczymi łańcuchami DNA, które stabilizują je

• gyraza DNA – topoizomeraza, wprowadza ujemne skręty superhelikalne; katalizuje przemianę luźnej cząsteczki DNA w strukturę super zwiniętą. Posiada zdolność zarówno do relaksacji (rozluźniania) i spajania (tworzenia struktury) pasm DNA

• holoenzym polimerazy DNA III – syntetyzuje DNA

• polimeraza DNA I – usuwa startery i wypełnia brakujące fragmenty nici DNA

• ligaza DNA – łączy końce DNA

→ replikacja jest procesem semikonserwatywnym tzn. że cząsteczki potomne są tylko w połowie nowe, matrycę stanowi stara nić DNA

→ proces replikacji poprzedzony jest dekondensacją chromatyny

→ w czasie inicjacji replikacji następuje rozwinięcie podwójnej spirali DNA w specyficznym punkcie zwanym miejscem inicjacji replikacji (ori)

→ w czasie inicjacji replikacji niezbędna jest synteza krótkich odcinków RNA, które mają długość ok. 10 nukleotydów (startery), są one syntetyzowane przez odpowiednią polimerazę RNA zależną od DNA

→ te startery są niezbędne do rozpoczęcia inicjacji replikacji

→ ten fakt skłania do myślenia, że w teorii genezy życia to RNA a nie DNA jest pierwotnym materiałem genetycznym

→ synteza DNA rozpoczyna się w obu kierunkach, dochodzi do wytworzenia widełek replikacyjnych, gdzie powstają nowe łańcuchy DNA

→ oczko replikacyjne jest wynikiem przesuwania się widełek replikacyjnych w przeciwnych kierunkach

→ jednostką genomu, w obrębie którego zachodzi replikacja to replikon

→ proces replikacji przeprowadzany jest przez wieloenzymatyczny kompleks zwany replisomem

→ replisom tworzy się w obrębie widełek replikacyjnych i zawiera kompleks enzymów służących do replikacji

→ w procesie replikacji jedna nić jest syntetyzowana ciągle (od 5’ do 3’), a druga nić jest syntetyzowana w formie fragmentów okazaki (nić opóźniona). Fragmenty okazaki zawierają od 100 do 1000 nukleotydów, i są łączone następnie poprzez ligazę

→ u Escherichia coli (prokariota) występują 3 polimerazy (I, II, III). III jest głównym enzymem odpowiedzialnym za replikację (syntezę nowego łancucha)

→ u eukariota mamy 5 polimeraz DNA (α, β, γ, δ, epsilon). Odpowiednikiem polimerazy III jest delta. Epsilon i pozostałe – uczestniczą w procesach naprawczych

Cykl komórkowy:

→ G1 – komórka sprawia wrażenie, jakby nic się w niej nie działo, następuje intensywny wzrost komórki. Gdy komórka osiągnie odpowiednie rozmiary, przechodzi przez punkt restrykcyjny (kontrolny). Jak już przejdzie przez ten punkt, musi się podzielić

→ S – replikacja DNA

→ G2 – syntetyzowanie białek

→ M – mitoza – podział komórki na dwie potomne

WYKŁAD 5

Prokariotyczne polimerazy DNA:

• polimeraza I – usuwa startery i wypełnia brakujące fragmenty DNA, posiada ona aktywność endonukleazy, czyli ma możliwość wycinania pewnych fragmentów, naprawia i łata DNA (egzonukleaza 5’-3’)

• polimeraza II – współdziała przy naprawie DNA

• polimeraza III – jest głównym enzymem odpowiedzialnym za syntezę nowego łańcucha DNA (odpowiada za proces replikacji)

Replikacja:

→ replikacja przebiega podobnie we wszystkich organizmach.

→ u eukariota DNA przed replikacją musi być odwinięty od nukleosomów, w procesie tym uczestniczy enzym rozluźniający

→ w związku z tym opóźnione jest przesuwanie widełek replikacyjnych i sam proces replikacji u eukariota przebiega ok. 10-krotnie wolniej w porównaniu z komórką bakteryjną

→ w trakcie replikacji u eukariota występują różne problemy. Okazuje się, że ostatni fragment okazaki na nici opóźnionej nie może być zsyntetyzowany, ponieważ jego startery znajdują się przeciętnie o 200 nukleotydów od miejsca inicjacji. W przypadku gdy zsyntetyzowany odcinek nici opóźnionej jest krótszy niż 200 nukleotydów, nie ma miejsca na syntezę nowego startera. Taka sytuacja spowodowałaby, że nić opóźniona byłaby krótsza od wiodącej, a następne cykle replikacji powodowałyby jeszcze bardziej skracanie nici opóźnionej i w efekcie syntetyzowane byłyby coraz krótsze potomne nici DNA. W związku z tym nie byłaby zachowana pełna informacja genetyczna organizmu w nowopowstających komórkach

→ okazało się, że zakończenie chromosomów, czyli telomery (telos – gr. koniec) mogą być syntetyzowane przez odwrotną transkryptazę. Enzym ten odkryty w 70 roku, a w 75r. dwóch badaczy dostało za to Nobla. Odwrotna transkryptaza syntetyzuje DNA na bazie RNA. Po raz pierwszy enzym ten został wykryty w wirusach onkogennych. W tym przypadku mamy do czynienia z telomerazą przy czym rola telomeru i telomerazy nie jest jasna

→ aktywność telomerazy stwierdzono m.in. w komórkach zarodkowych ulegających ciągłym podziałom

→ zadaniem telomerazy jest niedopuszczenie do skracania DNA w trakcie replikacji. Wykazano, że jeżeli skracanie obejmuje obszary DNA zawierające informacje o syntezie białka – komórka umiera

→ telomery komórek z wiekiem stają się coraz krótsze. Za pomocą analizy telomerów możemy stwierdzić wiek danej komórki. Jeżeli telomery są krótkie - z wiekiem - zanika też aktywność telomerazy

→ w komórkach nowotworowych obserwuje się wzrost aktywności telomerazy, co może powodować ich nieśmiertelność. Dlatego w walce z rakiem prowadzi się badania nad hamowaniem aktywności telomerazy w kom. nowotworowych

Mutacja i naprawa uszkodzeń DNA:

→ ogromnym problemem dla życia organizmów jest utrzymanie niezmienności genetycznej w komórkach DNA

→ nieprawidłowo włączony nukleotyd w DNA zdarza się nie częściej niż raz na miliard

→ komórka wykształciła systemy i mechanizmy naprawy uszkodzeń struktury DNA

→ jeżeli nastąpi mutacja w jednej komórce to z dużym prawdopodobieństwem będzie występowała w komórkach potomnych (jeżeli nie zostanie naprawiona ta mutacja)

Rodzaje mutacji:

→ substytucja – podstawienie jednej pary zasad zamiast innej. Dwa rodzaje:

• tranzycja – podstawienie jednej puryny w miejsce innej, lub pirymidyny w miejsce innej pirymidyny

• transwersja – polega na zamianie puryny na pirymidynę i odwrotnie

→ delecja – usunięcie jednej lub większej liczby par zasad

→ insercja - wstawienie jednej lub większej liczby par zasad

→ w wyniku insercji i delecji dochodzi do mutacji zmiany ramki odczytu (prowadzi do syntezy polipeptydów o zmienionym składzie aminokwasów)

→ przesunięcie ramki odczytu np. w genie kodującym białko enzymatyczne prowadzi najczęściej do utraty aktywności tego enzymu

→ w innym przypadku może dojść do zmiany kodonu STOP, co spowoduje wydłużenie łańcucha polipeptydowego, następnie dojdzie w łańcuchu do większego pofałdowania i w końcu do zmniejszenia aktywności. Kodony STOP – trójki nukleotydów, które wyznaczają miejsce zakończenia procesu translacji, czyli miejsce zakończenia syntezy łańcucha polipeptydowego

→ większość mutacji może być naprawiana, ponieważ informacja genetyczna przechowywana jest w obu niciach DNA. W związku z tym utrata informacji z jednej nici może być odtworzona na podstawie drugiej – prawidłowej

→ jednym z najlepiej poznanym mechanizmów naprawy DNA jest usuwanie dimerów pirymidynowych. Powstają one gdy DNA wystawione jest na działanie światła UV. Sąsiadujące ze sobą w łańcuchu DNA reszty pirymidynowe mogą zostać w tych warunkach połączone dodatkowym wiązaniem kowalencyjnym. Powstały dimer pirymidynowy zaburza strukturę dwuniciowej helisy, co powoduje zablokowanie zarówno replikacji jak i ekspresji genu (syntezy białka) do czasu usunięcia uszkodzenia (fOcIe Z MiNaKoWsKiEgO fizjol patolog dimer tyminy)

→ innym systemem naprawy DNA jest uruchomienie tzw. odpowiedzi S.O.S podczas rekombinacji homologicznej gdzie rodzicielskie dupleksy DNA przylegają do siebie rejonami o podobnych sekwencjach. W tym przypadku nowe cząsteczki DNA powstają przez zerwanie a następnie przyłączenie homologicznych fragmentów czy segmentów

Mechanizm działania białka recA:

→ w rekombinacji homologicznej pośredniczy białko enzymatyczne aktywowane przez ATP (recA), które umożliwia jednoniciowemu DNA przeszukiwanie podwójnej nici DNA w celu znalezienia identycznych bądź podobnych sekwencji

→ następnie białko to katalizuje wymianę nici w miejscu największej homologii

→ w warunkach normalnych (fizjologicznych) w komórce znajduje się kilkaset kopii tego białka, natomiast po uszkodzeniu DNA ilość tego białka gwałtownie wzrasta

→ uszkodzenie DNA wywołuje dodatkowo indukcję syntezy innych białek biorących udział w naprawie. Te zdarzenia to odpowiedź S.O.S.

→ w warunkach fizjologicznych, zawartość białek (w jądrze) biorących udział w odpowiedzi S.O.S. jest niska, bo ich synteza blokowana jest przez białko hamujące (represorowe) tzw. lexA

→ występowanie dużych ilości jednoniciowego zmutowanego DNA znosi aktywność białka lexA, które ulega proteolizie (rozpadowi) i dochodzi do aktywacji genów kodujących białka naprawcze

→ wiele chorób nowotworowych powstaje w skutek zaburzeń systemów naprawczych DNA a nie bezpośrednio w wyniku mutacji, która może być usunięta

→ mało wydajne systemy naprawcze lub ich uszkodzenia prowadzić mogą do zachowania danej mutacji a następnie do jej dziedziczenia, co w konsekwencji prowadzi do śmierci komórki

Zespoły nieprawidłowej naprawy DNA (progerie – ludzie wyglądają staro i umierają za młodu na choroby wieku starczego):

→ xeroderma pigmentosum – nadwrażliwość na światło słoneczne, objawiające się zwiększoną częstością występowania nowotworów skóry i przedwczesnym starzeniem się. Przyczyną tej choroby uszkodzenie 7 genów

→ zespół cockayne’a – nadwrażliwość na UV i związki chemiczne

→ trichotiodystrofia – wrażliwa skóra, łamliwe włosy i paznokcie

→ zespół Wernera – przedwczesne starzenie i niskorosłość

→ zespół blooma – nadwrażliwośc na światło słoneczne, zwiększona zachorowalność na nowotwory, szczególnie białaczka

→ ataksja (teleangiektazja) – nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące i niektóre zw, chemiczne

→ zespół Nijmegen

→ niedokrwistość fanconiego

→ dziedziczny rak sutka

→ dziedziczny rak jelita grubego

Czynniki wywołujące mutacje (mutageny):

→ analogi zasad purynowych i pirymidynowych oraz barwniki akrydynowe – do DNA mogą być wbudowane analogi zasad takie jak 5-bromouracyl, 2-aminopuryna, akrydyny posiadające płaskie pierścienie aromatyczne, wbudowują się pomiędzy sąsiadujące pary zasad rozsuwając je co uniemożliwia insercję innej zasady

→ związki alkilujące – działają na puryny w DNA. Alkilacja powoduje osłabienie wiązania pomiędzy puryną i deoksyrybozą , w konsekwencji dochodzi do jego rozerwania

→ promieniowanie jonizujące (X – Roentgena, α, β, γ) – powoduje wybijanie elektronów z napotkanych cząsteczek, czyli ich jonizację. Powstałe wolne rodniki ulegają wówczas spontanicznemu rozkładowi, a uwolniona energia powoduje uszkodzenia DNA

→ światło UV – powoduje stan wzbudzony atomów, dzięki czemu cząsteczki DNA stają się bardziej reaktywne. Może dochodzić np. do powstawania nowych wiązań C-C między zasadami leżącymi obok siebie w łańcuchu DNA (np. dimery tyminy)

→ mutacje chromosomów – (delecja – utrata chromosomu, translokacja – przemieszczenie fragmentu chromosomu z jednego na drugi, inwersja – odwrócenie chromosomu o 180⁰)

→ uszkodzenia oksydacyjne – do uszkodzeń tych dochodzi w normalnych warunkach, bo we wszystkich komórkach tlenowych występują reaktywne formy tlenu. W pewnych warunkach może dochodzić do ich nagromadzenia. Zaliczamy do nich wolnorodnikowy anion ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru, oraz rodnik hydroksylenowy. Formy te powstają przy okazji różnego rodzaju stresów, skutkiem czego może być powstawanie utlenionych zasad: 2-oksoadenian, 8-oksoguanina, 5-hydroksymetylouracyl

WYKŁAD 6

Proces ekspresji genów:

→ wynikiem procesu ekspresji genów jest białko

→ procesy transkrypcji i translacji są ze sobą integralnie związane w procesie biosyntezy białka

→ transkrypcja to proces syntezy wszystkich rodzajów RNA na matrycy DNA

→ enzymem odpowiedzialnym za syntezę RNA jest DNA-zależna polimeraza RNA

→ bakteryjna polimeraza występuje w postaci cząsteczki białka, zbudowana jest z 4 podjednostek, w skład wchodzą 2 identyczne podjednostki alfa oraz beta i beta’

→ polimeraza ta zawiera w swej cząsteczce 2 atomy cynku

→ rdzeń polimerazy posługuje się swoistym czynnikiem sigma

→ czynnik ten rozpoznaje i pomaga rdzeniowi enzymu dołączyć się do swoistej sekwencji promotorowej

→ sekwencja promotorowa, niezależnie czy są to geny bakteryjne czy eukariotyczne, to jest ta sekwencja od której rozpoczyna się proces transkrypcji, a dokładnie inicjacja procesu transkrypcji

→ bakteryjne polimerazy zawierają wiele czynników sigma, z których każdy działa jako białko regulatorowe

→ czynnik ten modyfikuje swoistość rozpoznawania promotora przez polimerazę

→ komórki ssaków posiadają liczne zależne od DNA polimerazy RNA:

• polimeraza I (A) - syntetyzuje rRNA, a oprócz tego 28S, 18S, 5,8S (S - stała sedymentacji, określająca masę cząsteczkową)

• polimeraza II (B) - syntetyzuje hnRNA-heterogenny RNA i mRNA, snRNA – niskocząsteczkowy, miRNA; transkrybuje ona wszystkie geny kodujące białka

• polimeraza III (C)– tRNA, 5s RNA, snoRNA – małe, jąderkowe RNA oraz scRNA – małe, cytoplazmatyczne RNA

Synteza RNA: (MINIAK LUB HAPER)

→ obejmuję inicjację, elongację i terminację

→ inicjacja: następuje związanie cząsteczki polimerazy do matrycy w miejscu promotorowym. Następuje wówczas zmiana konformacji enzymu i wiązanie pierwszego zwykle purynowego nukleotydu do podjednostki β. Czynnikiem rozpoznającym cząsteczkę DNA – czynnik sigma

→ elongacja: w obecności 4 różnych nukleotydów polimeraza przemieszcza się do drugiej zasady na matrycy i tworzy się pierwsze wiązanie fosfodiestrowe. Inicjacja tworzenia RNA na końcu 5’ następuje z jednoczesnym oddzieleniem czynnika sigma (służy tylko do przyłączenia), natomiast elongacja cząsteczki RNA biegnie przeciwlegle do jej matrycy (w kierunku 5’ do 3’). Polimeryzacja, czyli tworzenie nici RNA odbywa się zgodnie z sekwencją nukleotydów dyktowaną przez pasmo DNA

→ terminacja syntezy cząsteczki jest wyznaczana podobnie jak inicjacja przez swoistą sekwencję cząsteczki DNA. Sekwencja terminacyjna rozpoznawana jest przez białko terminacyjne tzw. czynnik Ro. Po ukończeniu syntezy cząsteczki RNA rdzeń enzymu, czyli polimeraza oddziela się od matrycy DNA, a w obecności innego czynnika sigma enzym rozpoznaje inny promotor i synteza nowej cząsteczki rozpoczyna się ponownie

Transkrypcja u eukariota:

→ u eukaryota proces transkrypcji jest o wiele bardziej skomplikowany i uczestniczy w nim kilkadziesiąt różnego rodzaju białek regulacyjnych

→ wśród nich wyróżnić możemy kilka grup białek: czynniki podstawowe, koaktywatory, aktywatory i represory (inhibitory). Największe znaczenie ma zagadnienie transkrypcji genów kodujących cząst. mRNA, ponieważ ma to zasadnicze znaczenie jakie białko będzie syntetyzowane na ich bazie

→ transkrypcja tych genów oprócz polimerazy II wymaga obecności kilku podstawowych czynników transkrypcyjnych oznaczonych jako: A, B, E, F, H. Wchodzą one w skład kompleksu białkowego, który jest niezbędny razem z polimerazą II do zainicjowania transkrypcji. Czynniki te nazwano TF2

Regulacja procesu transkrypcji:

– istotnym zagadnieniem jest to, w jaki sposób polimeraza rozpoznaje specyficzne miejsca w inicjacji transkrypcji

→ u Escherichia coli takich miejsc inicjacji jest w genomie ok. 2000, a sam genom zawiera ok. 4 mln par zasad

→ u ludzi i innych ssaków, miejsc inicjacji transkrypcji jest ok. 100 tys. i ponad 3 mld par zasad

→ polimeraza może przeszukiwać sekwencje na DNA w poszukiwaniu miejsca inicjacji transkrypcji z prędkością 1000 par zasad na sekundę do momentu aż znajdzie sekwencję, z którą wiąże się z dużym powinowactwem

→ ta sekwencja zwana jest regionem promotorowym

→ u prokariota znana jest charakterystyczna sekwencja tzw. ramka Pribnowa – sekwencja – TATAAT i znajduje się ona 10 par zasad w lewo od miejsca inicjacji transkrypcji, drugą sekwencją jest TTGACA znajdująca się 35 par zasad w lewo

→ bardziej skomplikowana sprawa jest u Eukariota: występują tu również sekwencje charakterystyczne dla inicjacji, ale dochodzi również regulacja hormonalna procesu transkrypcji

→ u eukariota sekwencją podobną do Pribnowa jest sekwencja TATA

→ mutacja tej sekwencji zmniejsza w dużym stopniu aktywność promotorową i w konsekwencji hamuje proces transkrypcji, czyli proces ekspresji genów

→ sekwencja TATA występuje prawie we wszystkich genach kodujących mRNA

→ sekwencja TATA jest niezbędna, ale nie wystarczająca do pełnej aktywności promotora

→ dodatkowe elementy regulacyjne są jeszcze bardziej oddalone od regionu promotorowego i są to: powtarzająca się sekwencja GC oddalona o 40 par w lewo, oraz sekwencja CAAT oddalona o 110 par w lewo

→ ważną rolę w procesie regulacji inicjacji transkrypcji pełnią rożnego rodzaju białka wiążące się do sekwencji TATA (np. TBP m. ok 30kDA)

→ związanie się TBP z TATA znacznie przyspiesza proces inicjacji transkrypcji

→ sekwencja TATA posiada zdolność wiązania innego czynnika TF2D, którego najważniejszym elementem jest TBP

→ wiązanie się czynnika TF2D z sekwencja TATA ułatwiane jest z kolei przez inny czynnik białkowy TF2A

→ ten czynnik TF2A zapobiega wiązaniu się inhibitorów do czynnika TF2B

→ po połączeniu do sekwencji TATA czynnika TF2A i TF2B dochodzi do przyłączania polimerazy tRNA drugiej

→ następnie dochodzi do wiązania 3 innych czynników w określonej kolejności i są to: TF2E, TF2H i TF2J

→ dopiero utworzony w ten sposób kompleks białkowy zwany jest kompleksem inicjacji transkrypcji u ssaków

→ po utworzeniu tego kompleksu rozpoczyna się proces zapoczątkowania transkrypcji około 25 par zasad w prawo (lub w górę)

→ w genach eukariotycznych występuje jeszcze trzecia grupa sekwencji sygnałowych, są to elementy wzmacniające, czyli enhancery i wyciszające, silencery

→ do tej sekwencji mogą wiązać się albo aktywatory (do wzmacniającej) albo inhibitory i represory (do wyciszającej) i w ten sposób jest dodatkowo regulowany proces transkrypcji

→ takie sekwencje wzmacniające bądź wyciszające mogą występować zarówno w górę jak i w dół od miejsca inicjacji transkrypcji

→ mogą być oddalone znacznie od promotora nawet od kilkaset do kilku tysięcy par zasad

→ bardzo często sygnałami dla tych sekwencji wyciszających lub wzmacniających są hormony, w DNA i występują swoiste sekwencji HRE – sekwencje odpowiedzi hormonalnej

→ po transkrypcji otrzymujemy formy prekursorowe kwasów RNA, może być to hn RNA, prerRNA, premRNA, czy pretRNA

→ każdy kwas RNA powstały w jądrze musi ulec dojrzewaniu w tym jądrze, czyli musi ulec obróbce potranskrypcyjnej i dopiero później transportowany jest do cytoplazmy gdzie bierze udział w procesie translacji czyli w procesie syntezy białka

→ dojrzewanie kwasu ma na celu z jednej strony przygotowanie ich do udziału w translacji, z drugiej strony natomiast chroni te kwasy przed atakiem enzymów nukleolitycznych, które mogłyby uszkodzić je w czasie transportu przez błonę jądrową

→ w czasie dojrzewania mRNA w pierwszym etapie dochodzi do powstania pre-mRNA z heterogennego RNA poprzez wycięcie fragmentu stranskrybowanego, dzięki enzymom nukleolitycznym

→ następnie na końcu 5’ dochodzi do czapeczkowania, tj. przyłącznie 7-metyloGTP, co chroni ten koniec przed atakiem nukleaz w czasie transportu przez błonę jądrową, ale również w procesie translacji, a właściwie inicjacji translacji czapeczka rozpoznaje specyficzne miejsce i łączy się z mniejszą podjednostką rybosomu

→ następnie zabezpieczany jest koniec 3’, dochodzi do tzw. poliadenylacji – przyłączenie ok. 150-200 nukleotydów adenylowych

→ ponieważ w czasie transkrypcji transkrybowany jest cały fragment DNA, czyli introny i eksony, musi dojść do usunięcia intronów, które nie zawierają informacji dla syntezy białka, wycinane są one przez odpowiednie nukleazy, z udziałem licznych białek regulatorowych oraz snRNA

→ można powiedzieć, ze snRNA wskazuje odpowiedniej nukleazie miejsce cięcia

→ następnie dzięki ligazie dochodzi do połączenia eksonów w całość

→ w końcowym etapie do tak dojrzałego mRNA przyłączane są białka informoferowe

→ powstaje informosom i w takiej formie mRNA pokonuje barierę błony jądrowej i transportowany jest do cytoplazmy

→ czapeczkowanie i poliadenylacja chronią mRNA przed atakiem egzonukleaz, natomiast dołączenia białek informoferowych chroni mRNA przed atakiem endonukleaz

Dojrzewanie mRNA:

→ proces wycinania intronów i składania eksonów nosi nazwę splicingu

→ w procesie tym bierze udział swoista struktura zwana spliceosomem (STRYER)

→ jest to wielopodjednostkowy kompleks o stałej sedymentacji 60S, na którym odbywa się usuwanie intronów z pre-mRNA

→ w procesie tym uczestniczą małe, jądrowe cząsteczki rybonukleoproteinowe tzw. snRNPs

→ w skład tych snRNPs wchodzi snRNA

→ istnieje kilka rodzajów snRNPs (U1,U2,U3,U4,U5,U6)

→ każdy z tych rodzajów pełni określoną funkcję w procesie splicingu

• U1 - 165 - wiąże się do miejsca splicingowego najpierw 5’, a następnie 3’

• U2 - 185 - wiąże się do miejsca rozgałęzienia, tworzy część centrum katalitycznego

• U5 – 116 - wiąże się do miejsca splicingowego 5’

• U4 – 145 - maskuje katalityczna aktywność 46

• U6 – 106 - katalizuje spilicing

→ w procesie splicingu uczestniczą swoiste sekwencje znajdujące się zarówno wewnątrz jak i po obu stronach intronu(HARPER)

→ pomimo, że sekwencje w intronach eukariotycznych są heterogenne to ograniczone są takimi samymi sekwencjami – zaczynają się od GU, a kończą się na AG – to znacznie ułatwia rozpoznawanie tych sekwencji

→ w procesie splicingu uczestniczą głownie snRNPs

→ ich obecność powoduje zwinięcie pre-mRNA w strukturę odpowiednią do składania

→ w trakcie tego procesu tworzy się struktura w kształcie lassa

→ po przecięciu lewego końca tworzy się pętla przy końcu 5’ intronu

→ z kolei nacięcie prawego końca powoduje uwolnienie pętli, która jest następnie trawiona enzymatycznie

→ eksony łączone są za pomocą ligazy

→ należy zaznaczyć, że w komórkach eukariotycznych około 75% pierwotnego transkryptu genu musi być usunięte przy tworzeniu matrycy

→ istnieje kilka hipotez co do przydatności intronów teoretycznie bezużytecznych

• jedna z nich zakłada, że białka pomimo, że są syntetyzowane w postaci ciągłej mają budowę modularną, tzn. utworzone są z charakterystycznych pełniących różne funkcje regionów zwanych domenami np. centrum aktywne enzymu stanowić może jedną domenę, a inna domena umożliwia wiązanie się enzymu z substratem

WYKŁAD 7

Modyfikacje tRNA:

→ cząsteczki tRNA zawierają liczne modyfikacje zasad podstawowych

→ niektóre z zasad ulegają metylacji (dawcą grupy metylowej jest aktywna metionina – S-adenozylometionina). Ta metylacja w warunkach in vivo chroni kwasy RNA przez nukleazami (przed enzymami które mogłyby je pociąć)

→ niektóre zasady mają przekształcone wiązania glikozydowe

→ cząsteczki tRNA są przepisywane w czasie transkrypcji w postaci dużych cząsteczek prekursorowych, zawierających więcej niż jeden tRNA

→ następnie podobnie jak w mRNA są przekształcane nukleolityczne

→ dalsze modyfikacje tRNA to m.in. dołączenie na końcu 3 prim końcówki CCA

(rysunek koniczyny z minakowskiego)

→ ramię akceptorowe (aminokwasowe) - ramię, przy którym przyłączany jest określony aminokwas

→ naprzeciwlegle ramie antykodonowi – rozpoznawany jest odpowiedni kodon na nici mRNA (musi pasować komplementarnie do kodonu). Kolejność przyłączania aminokwasów jest uzależniona od kolejności wysterowania kodonów

→ ramię D – współdziała z kluczowym enzymem procesu inicjacji translacji – syntetazą aminoacylotRNA. Pomaga w przyłączeniu aminokwasów do ramienia aminokwasowego

→ ramię naprzeciwległe – współdziała z ramieniem antykodonowym, tym ramieniem tRNA zakotwicza się w mniejszej podjednostce rybosomy

Modyfikacje rRNA:

→ w komórkach ssaków prawie wszystkie cząsteczki rRNA są przepisywane jako część pojedynczej dużej cząsteczki prekursorowej

→ cząsteczka prekursorowa jest następnie na terenie jąderka przekształcana w wyniku czego powstają składowe rRNA dla poszczególnych podjednostek rybosomów, które znajdują się w cytoplazmie

→ cząsteczka prekursorowa 45sRNA przekształcana jest nukleolitycznie na 18S, 28S i 5,8S (MINIAK I HARPER)

→ przekształcenie odbywa się na drodze swoistego mechanizmu, innego, odmiennego aniżeli przekształcanie hnRNA do mRNA

→ w tym przypadku prawie połowa prekursora 45S jest degradowana

→ w czasie przekształceń zachodzi m.in. metylacja oraz łączenie podjednostki 28S z białkami rybosomalnymi i tworzenie większej podjednostki rybosomu

→ analogicznie zachodzi łączenie podjednostki 18S z białkami rybosomalnymi i tworzenie mniejszej podjednostki rybosomu

Synteza białka kodu genetycznego:

→ kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym jest tłumaczona na podstawie kolejności zasad występujących w DNA

→ służy do tego kod genetyczny

→ jednostką kodu genetycznego jest kodon, inaczej triplet, czyli trójka zasad

→ taki kodon koduje jeden aminokwas

→ kod trójkowy daje 64 możliwe kombinacje

→ biorąc pod uwagę istnienie 20 aminokwasów białkowych liczba kombinacji kodu jest w nadmiarze. Co jest istotą? Rożne kodony mogą kodować ten sam aminokwas, ponieważ najistotniejsze w kodonie są dwie pierwsze zasady, trzecia może się różnić

Cechy kodu genetycznego:

→ trójkowy – trzem kolejnym nukleotydom w mRNA odpowiada jeden aminokwas w syntetyzowanym łańcuchu polipeptydowym

→ zdegenerowany – rożne kodony kodują ten sam aminokwas, dwa pierwsze nukleotydy odpowiadają za syntezę określonego aminokwasu

→ jednoznaczny – dany swoisty kodon jest przypisany do pojedynczego aminokwasu

→ nienakładający się (niezachodzący) – odczytywanie kodu w trakcie syntezy białek nie obejmuje żadnych kodonów nakładających się

→ bezprzystankowy – od momentu, od którego zacznie się odczytywanie swoistego kodonu nie ma znaków przystankowych (kończy się kodonem STOP)

→ współliniowy – kolejności kodonów w mRNA odpowiada kolejności aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym

→ uniwersalny – tzn. taki sam w całym świecie istot żywych (od bakterii do człowieka). Istnieją odstępstwa od uniwersalności (mitochondria potrzebują tylko 22 rodzaje tRNA aby odczytać swój kod genetyczny, podczas gdy system translacji cytoplazmatycznej wymaga 31 rodzajów tRNA

Translacja:

→ proces tłumaczenia języka nukleotydów na język aminokwasów

→ zachodzi w cytoplazmie komórkowej

→ na pełny aparat biosyntezy białka składają się:

• rybosomy

• mRNA

• zaktywowane aminokwasy (aminoacylo-tRNA)

• białka enzymatyczne i regulatorowe

→ translacja, podobnie jak transkrypcja składa się z trzech etapów: inicjacji, elongacji i terminacji

Inicjacja translacji:

→ w procesie inicjacji musi dojść do aktywacji aminokwasów (przed procesem inicjacji)- musi dojść do aktywacji aminokwasów – dojść do przyłączenia aminokwasy do końca 3’tRNA (CCA). Proces ten wymaga nakładu energetycznego w postaci ATP (proces biosyntezy białka jest najbardziej energiobiorczym procesem w komórce)

• aminokwas +ATP aminoacylo-AMP + PP

• aminoacylo-AMP + tRNA aminoacylo-tRNA + AMP

• aminokwas + ATP + tRNA aminoacylo-tRNA + AMP + PP

• enzymem jest syntetaza aminoacylo tRNA

→ inicjacja translacji – kodonem inicjującym każdy łańcuch polipeptydowy jest kodon AUG. W procesie inicjacji biorą udział różne czynniki białkowe. U eukariota są to EIF4A, EIF4B EIF4F. Zadaniem tych czynników jest modyfikacja mniejszej podjednostki rybosomów oraz czynniki IF1, IF2, IF3. Zapoczątkowanie translacji wymaga wytworzenia kompleksu inicjującego. Pierwszą reakcją inicjacji jest dysocjacja rybosomów na dwie podjednostki (duża i mała), w której uczestniczy czynnik IF1. Mała podjednostka stabilizowana jest przez czynnik IF3, który działa jako czynnik antyasocjacyjny, natomiast IF2 stymuluje wiązanie inicjatorowego aminoacylo-tRNA z miejscem P na rybosomie

→ kolejność:

• 1. Połączenie mRNA z mniejsza podjednostka rybosomu

• 2. Odsłania się kodon inicjujący AUG

• 3. Przyłączanie pierwszego aminoacylo-tRNA – u eukariota jest to metionylo-tRNA, u prokariota jest to formylometionylo-tRNA, ponieważ aminokwasem inicjującym każdy łańcuch polipeptydowy u eukariota jest zawsze metionina, a u prokariota formylometionina

• 4. Przyłączenie większej podjednostki rybosomu – w tym momencie tworzą się dwa miejsca na mniejszej podjednostce – aminokwasowe(A) i peptydowe (P)

• 5. Inicjacja kończy się kiedy metionylo-tRNA znajduje się w miejscu P

Elongacja translacji:

→ elongacja – w procesie elongacji uczestniczy kilka istotnych białek enzymatycznych:

• peptydylotransferza

• translokaza

• wiele czynników elongacyjnych

• EFTU – tworzy kompleks z GTP i nowowchodzącym aminoacylo-tRNA umieszczając go w miejscu A

• EFTS – bierze udział w wiązaniu aminoacylo-tRNA w miejscu A umożliwiając dysocjację GDP z kompleksu inicjującego

• EFG (translokaza) – bierze udział w translokacji, czyli przeniesieniu aminoacylo-tRNA lub peptydylo-tRNA z miejsca A do P z udziałem GTP, w procesie translacji najwięcej energii jest z GTP

→ kolejność C.D

• 1. Po zakończeniu procesu inicjacji w miejscu A odsłaniany jest kodon

• 2. Do tego kodonu dzięki czynnikom białkowym i energii z GTP dołączany jest następny aminoacylo-tRNA (np. alanylo-tRNA)

• 3. W tym momencie zajęte są oba miejsca (A i P) i elongacja translacji nie mogłaby zachodzić

• 4. W związku z tym dzięki transferazie peptydylowej (przy jej udziale), dochodzi do wytworzenia pierwszego wiązania peptydowego miedzy metioniną i alaniną

  • pęka wiązanie między metionina a tRNA

  • metionina przerzucana jest na alaninę

  • metionina będzie N-końcowym aminokwasem nowotworzonego peptydu

• 5. Proces translokacji w obecności czynnika EFG (translokazy)

  • metionyloalanylo-tRNA dzięki EFG i GTP przesuwany jest do miejsca P, a znajdujący się w tym miejscu tRNA usuwany jest do cytoplazmy i tam ulega degradacji

• 6. Pierwszy obrót cyklu – w dalszym etapie elongacji ten cykl się powtarza

  • metionyloalanina dzieki transferazie peptydylowej przerzucana jest na aminokwas, który został wprowadzony dzięki tRNA na miejsce A

• 7. Elongacja trwa do momentu odsłonięcia w miejscu A kodonu nonsensownego, czyli kdonu STOP, to jest taki kodon, który nie posiada odpowiednika w antykodonach tRNA (UAA, UAG i UGA kodony STOP)

Terminacja translacji:

→ w procesie terminacji uczestniczą czynniki uwalniające, zdolne do rozpoznania sygnału terminacji w miejscu A

→ czynnik uwalniający w polaczeniu z GTP i transferazą peptydylową powoduje hydrolizę wiązania pomiędzy peptydem a tRNA w miejscu P

→ w wyniku tego procesu do cytoplazmy uwalniane są peptyd i tRNA

→ u prokariota po tym czasie z kodonem STOP łączą się białkowe czynniki uwalniające – RF1, RF2, RF3

→ u eukariota tylko jeden czynnik eRF

→ po uwolnieniu peptydu rybosomy dysocjują na podjednostki i mogą być wykorzystywane w następnych cyklach syntezy białek

→ w procesie translacji tej samej cząsteczki mRNA może brać udział jednocześnie wiele rybosomów i są to tak zwane polirybosomy – polisomy

→ z kolei każdy z rybosomów posiada przyłączony polipeptyd

→ kompleks rybosomów z RNA i z łańcuchami polipeptydów nazywamy polisomem

→ z jedną cząsteczką mRNA może być połączonych około 50 rybosomów

Transport białek i przekształcenia potranslacyjne:

→ białka wytworzone w procesie translacji zawierają odpowiednie sygnały określające ich ostateczne umiejscowienie (np. mogą być kierowane do błony, przestrzeni międzybłonowych lub określonych organelli komórkowych, ale również mogą być kierowane do środowiska zewnątrzkomórkowego)

→ te sygnały to sekwencje liderowe bądź sygnałowe

→ u eukariota gdy tworzące się białko nie zawiera takich sekwencji synteza tego białka odbywa się zawsze w cytoplazmie

→ istnienie sekwencji liderowej powoduje skierowanie rybosomu do retikulum endoplazmatycznego

→ białka tworzone przez polisomy związane z błonami są przenoszone w poprzek błony retikulum, natomiast w retikulum endoplazmatycznym białka ulegają rożnego rodzaju modyfikacjom chemicznym

→ pamiętać należy, ze białka sekrecyjne (wydzielnicze) dzięki sekwencji liderowej (sygnałowej) już na początku syntezy kierowane są do retikulum

→ następnie ulegają translokacji (przeniesieniu) przez błonę retikulum do światła szorstkiego retikulum, a następnie przez aparat Golgiego przenoszone są do błony komórkowej

Mechanizm translokacji przez błonę retiikulum:

→ 1. Sekwencja liderowa umiejscowiona jest na N-końcu danego białka – jest syntetyzowana w procesie translacji na samym początku

→ 2. Sekwencja taka jest natychmiast rozpoznawana przez cząsteczkę rozpoznająca sygnał (SRP), która przyłącza się do kompleksu rybosomu z nowo tworzącym się peptydem

→ 3. Ta sytuacja wstrzymuje dalszą elongację łańcucha

→ 4. W błonie retikulum znajdują się receptory SRP – są to tzw. białka dokujące

→ 5. Do tych białek dokujących przyłącza się kompleks złożony z cytoplazmatycznego rybosomu i SRP

→ 6. Następnie z użyciem energii z GTP rybosom zostaje przyłączony do białek w błonie retikulum, białka te tworzą por przemieszczający polipeptyd (translokon → por)

→ 7. SRP jest uwalniane do cytoplazmy w celu ponownego wykorzystania

→ 8. Z porem związana jest peptydaza sygnałowa (grupa hydrolaz)– enzym przecinający łańcuch polipeptydowy, który odcina peptyd sygnałowy

→ 9. W świetle retikulum dochodzi do fałdowania się białek przy udziale innych białek tzw. chaperonów

→ 10. Przeniesienie białek pomiędzy retikulum, a aparatem Golgiego odbywa się za pomocą małych przedziałów – tzw. pęcherzyków transportujących

→ 11. Pęcherzyki te odpączkowują z przedziałów wyjściowych i ulegają fuzji z przedziałami docelowymi

WYKŁAD 8

Degradacja białek:

→ białka mogą być również transportowane do miejsc ich degradacji

→ polega to na połączeniu ich z konserwatywnym białkiem ubikwityną (małe białko, 76 aminokwasów, staje się ono znacznikiem do zniszczenia białka, które przyłącza)

→ białka połączone z ubikwityną trawione są przez kompleks enzymów proteolitycznych zależnych od ATP

→ do trawienia białek dochodzi tuż po ich syntezie, ponieważ:

• niemożliwa jest absolutna dokładność translacji. W związku z tym mogą być syntetyzowane białka o zmienionym składzie aminokwasowym, co może być przyczyną ich nieprawidłowego fałdowania i w konsekwencji wytworzenia nieprawidłowych struktur

• zniszczone muszą być białka, które uległy zniszczeniom chemicznym (np. stres oksydacyjny – prowadzi do zmiany struktur i aktywności biologicznej białek). Przed nieprawidłowym fałdowaniem białek chronią je tzw. białka opiekuńcze - chaperony. Mechanizm ich działania (chaperonów) polega na tym, że otaczają one białko, które ma ulec pofałdowaniu. Chaperony przez czerpanie energii z ATP zapobiegają przed wytworzeniem nieprawidłowych wiązań oraz wywołują dysocjację powstałych już agregatów. Chaperony wiążą się z białkami w sposób odwracalny z niepofałdowanym odcinkiem danego polipeptydu. Ten niepofałdowany odcinek mógłby służyć jako ośrodek nieprawidłowego pofałdowania lub agregacji. Chaperony wiążą się z częściowo zwiniętymi łańcuchami umożliwiając im kontynuację zwijania w sposób najkorzystniejszy energetycznie tzn. pomagają białkom w uporządkowanym tworzeniu ich struktury przestrzennej. Przykładem chaperonów są tzw. białka szoku termicznego . Wiążą się one intensywnie i są intensywnie syntetyzowane po szoku termicznym w celu ochrony komórki. Należą one do rodziny HSP (70 i 60)

Potranslacyjne modyfikacje białek:

→ po translacji, białka syntetyzowane są w postaci pojedynczych łańcuchów polipeptydowych

→ wiemy, że białka posiadają swoje struktury (I-V rzędowa)

→ te struktury muszą być wytworzone w czasie tzw. obróbki potranslacyjnej (np. enzymy proteolityczne, czy niektóre hormony)

→ do obróbki potranslacyjnej zaliczamy :

• odcinanie peptydu sygnałowego przez proteazy

• przyłączenie do nowopowstałego peptydu innych substancji (kofaktory)

• wytwarzanie nowych wiązań chemicznych (mostki disiarczkowe z reszt cysteiny)

→ polipeptyd powstały po translacji ulega różnym modyfikacjom chemicznym:

• glikozylacja białek (powstają glikoproteiny) – przyłączenie przez wiązania kowalencyjne jednej lub kilku reszt węglowodanowych. Glikozylacja zachodzi najczęściej w obrębie siateczki śródplazmatycznej. W ten sposób powstają glikoproteiny osocza, płynów tkankowych, śluzu i glikoprotein błon komórkowych

→ modyfikacje potranslacyjne mają na celu takie przekształcenie polipeptydu, aby mógł on spełnić swoją funkcję biologiczną (rysunek z Minakowskiego – potranslacyjne modyfikacje białek hymotrypsyna).

Priony:

→ pełnią istotną rolę w chorobie szalonych krów

→ choroby wywoływane przez priony są też związane z procesem fałdowania się białek

→ do grupy tych zaliczamy chorobę szalonych krów (Kreutzwelda-Jackoba):

• wywołuje śmiertelne gąbczaste zwyrodnienie mózgu

• stwierdzono, że ta choroba jest odporna na proteazę białka prionowego, które znaleziono w mózgu

• element wywołujący chorobę nazwano prionem, natomiast białko wywołujące chorobę to PrP^Sc

• natomiast normalny odpowiednik to PrP^c

• oba białka są takimi samymi polipeptydami, bo są kodowane przez ten sam gen, ale posiadają różne pofałdowania (konformację)

• PrP^sc w nieznany sposób zmienia normalne białko w formę nieprawidłową

• chorobotwórcza odmiana białka PrP^sc skupia się w trudno rozpuszczalne agregaty, które są odporne na temperaturę i promieniowanie

• komórki wyposażone są w systemy usuwania białek o zmienionej strukturze

• jeżeli dochodzi do zaburzeń w funkcjonowaniu białek prionowych, zwiększa się stężenie PrP^sc, co powoduje rozpad komórek i powstanie w mózgu złogów białek jednocześnie ubytków w strukturze mózgu. Struktura przypomina gąbkę

• uważa się, że mutacja genu kodującego prawidłową cząsteczkę tego białka może zwiększać prawdopodobieństwo w zmianach przemian potranslacyjnych, czyli prowadzi do powstawania struktury nieprawidłowej

• możliwe jest wykrywanie chorobotwórczych prionów w tkance za pomocą przeciwciał rozpoznających zarówno fizjologiczne jak i patologioczne stany

• okazuje się, że białko PrP^Sc występuje też poza mózgiem i może być monitorowane we krwi

→ choroba kuru

Regulacja ekspresji genów:

→ jest to uwidocznienie zapisu genetycznego w postaci zsyntetyzowanego białka

→ sam proces ekspresji genów jest regulowany na kilku poziomach

→ operon laktozowy i arabinozowy

Operon laktozowy:

→ klasycznym przykładem regulacji ekspresji genów u prokariota jest operon laktozowy

→ jest to przykład represji katabolicznej

→ obecność w pożywce bakteryjnej laktozy powoduje uaktywnienie operonu laktozowego

→ glukoza zmniejsza stężenie cAMP w komórkach, a cAMP jest stymulatorem indukcji w wielu operonach, powodując inicjację transkrypcji

→ cAMP służy jako sygnał głodu u bakterii i ssaków

→ laktoza zwiększa stężenie cAMP i powoduje inicjację transkrypcji

→ operon laktozowy składa się z kilku genów

• gen regulator

• gen promotor – miejsce przyczepu polimerazy RNA

• gen operator – pod jego kontrolą znajdują się geny struktury (strefa informacyjna operonu, czyli zawiera ona informację dla syntezy 3 enzymów niezbędnych do przekształcenia laktozy w dwie cząsteczki glukozy (pozostałe dwie to strefa regulatorowa)

→ bakterie potrafią wykorzystywać cukry jako źródło węgla i energii w postaci cukrów prostych

→ enzymy:

• permeaza laktozowa (odpowiada za transport)

• β- galaktozydaza

• transacetylaza

→ te enzymy są przykładem enzymów adaptacyjnych, tzn są wytwarzane tylko wtedy, gdy komórka ich potrzebuje – kiedy w komórce znajdują się substraty dla tych enzymów

→ w przeciwieństwie do enzymów konstytutywnych (u eukariota), które wytwarzane są ciągle a ich aktywność regulowana jest modyfikacjami chemicznymi (fosforylacje i defosforylacje)

→ jeżeli w komórce bakteryjnej nie ma laktozy, gen regulatorowy ulega transkrypcji i wytwarzane jest białko represorowe, które blokuje gen operator nie dopuszczając w ten sposób do transkrypcji genów struktury (operon jest zablokowany)

→ jeżeli w pożywce znajduje się laktoza to staje się ona swoistym induktorem odblokowując gen operatorowy przez uwolnienie z niego represora

→ wówczas dochodzi do ekspresji genów struktury i wytwarzane są 3 enzymy przekształcające laktozę w dwie cząsteczki glukozy

→ jeżeli zapas laktozy zostanie wyczerpany, to znów gen regulatorowy będzie wytwarzał represor i dojdzie do zablokowania genów struktury (budowa i działanie operonu laktozowego – Minakowski).

Operon arabinozowy:

→ drugim przykładem operonu jest operon arabinozowy

→ jest w nim zapisana informacja dla przekształcenia arabinozy w ksylulozo-5-fosforan. Arabinoza – rybulozo-5-fosforan- ksylulozo-5-fosforan

→ miejsca wiążące białka regulatorowe nie muszą sąsiadować z kontrolowanymi przez siebie genami

→ białko może kontrolować własną syntezę przez represję transkrypcji (hamowanie) własnego genu i wiązanie cząsteczki sygnałowej co powoduje przekształcenie białka regulatorowego z inhibitora w aktywator lub odwrotnie

→ w przypadku tego operonu, kompleks białka c z arabinozą aktywuje transkrypcję, natomiast samo białko c hamuje ją

→ enzymy: kinaza, izomeraza, epimeraza (odpowiednio ARA1, ARA2, ARA3)

→ bakteria może korzystać z arabinozy jako źródła energii, po przekształceniu jej w ksylulozo-5-fosforan

→ operon ten zawiera 3 geny struktury niezbędne do syntezy trzech enzymów które przekształcają arabinozę w ksylulozo-5-fosforan

→ posiada więcej białek regulatorowych – od laktozowego (głównym białkiem jest ARAC, oprócz tego ARA01, ARA02, ARA I)

→ operon ten jak i inne operon kataboliczne podlega podwójnej kontroli, gdzie do wydajnej transkrypcji potrzebne są dwa sygnały (kompleks cAMP i arabinoza związana z białkiem c)

→ generalnie najbardziej wydajna transkrypcja zachodzi w wysokim stężeniu cAMP i arabinozy (sztrejer – focie)

Regulacja u eukariota:

→ to, ze jest tak skomplikowana zależy od różnic w budowie DNA, ponieważ u eukariota znajdują się w DNA zarówno eksony i introny, ale zależy to też od ilości DNA (u człowieka 1000x więcej niż u bakterii)

→ z drugiej strony dla organizmów eukariotycznych zbudowanych z wielu komórek (100 bilionów), nie wszystkie istniejące geny w genomie muszą być czynne

→ aktywacja wielu genów u eukariota związana jest z przyłączeniem różnych białek do miejsc regulatorowych w DNA

→ istotną rolę w regulacji genów u eukariota pełnią histony

→ przynajmniej jeden z histonów może indukować inicjację transkrypcji

→ regulacja ekspresji genów (podobnie jak u prokariota) kontrolowana jest zarówno na etapie transkrypcji jak i translacji

→ kontrola ta polega przede wszystkim na kombinacyjnym łączeniu się wielu białek ze strukturą DNA

→ aktywatory transkrypcji zawierają dwa główne rejony:

• domenę wiążącą się z DNA

• domenę aktywacyjną, która pomaga w składaniu się kompleksu transkrypcyjnego przy kasecie TA-TA

→ stwierdzono jednocześnie, że transkrypcję mogą regulować białka wiążące się z sekwencjami DNA oddalonymi o kilka tysięcy par zasad od kasety TA-TA, ponieważ DNA jest elastyczną cząsteczką, która może tworzyć pętle

→ białka regulatorowe muszą charakteryzować się dużym powinowactwem do DNA

→ są trzy unikalne motywy w strukturze takich białek

• palec cynkowy (focie z Minakowskiego)

• suwak leucynowy

• heliks zwrot heliks

→ w niektórych aktywatorach znajduje się wielokrotny motyw palca cynkowego (miniak)

• jest to pętla wytworzona z fragmentu łańcucha polipeptydowego utworzonego przez jon cynkowy taka struktura umożliwia wciskanie się białka w rowek podwójnej spirali DNA

• w tych palcach musi być taki sam skład aminokwasów,

• dzięki wiązaniu białka (wiązanie następuje ze specyficzną parą zasad) z tym motywem do DNA umożliwia czynnikowi inicjującemu transkrypcję kontakt z docelowym genem

• istnieje też inny model, w którym białka regulatorowe nie łączą się bezpośrednio z DNA, ale z innymi białkami regulatorowymi i to wywołuje wpływ na ekspresję określonego genu

→ zamek leucynowy

• istotą białek suwaka (zamka) jest to, że zawierają one w co siódmej pozycji w łańcuchu polipeptydowym leucynę

• białka te tworzą dimery złożone z dwóch skręconych ze sobą łańcuchów o strukturze superhelisy

• sekwencja suwaka posiada dodatkowo rejon zasadowy (ok. 30 aminokwasów), służący do wiązania z DNA

• rolą suwaka leucynowego jest połączenie dwóch elementów wiążących DNA tak, aby mogły wiązać się z dwoma sekwencjami DNA

• u wyższych eukariota białka suwaka pośredniczą w oddziaływaniu cAMP na transkrypcję

→ w odróżnieniu od prokariota istotną rolę w regulacji ekspresji genów pełnią hormony (zdjęcie)

→ hormony spełniają swą funkcję przez wpływ na czynniki transkrypcyjne

→ hormony steroidowe działają bezpośrednio na DNA bo są małymi cząsteczkami i wnikają bezpośrednio do jądra

→ tam łączą się z tzw. sekwencją odpowiedzi hormonalnej HRE i regulują proces transkrypcji

→ inaczej działają hormony peptydowe i białkowe – są dużymi cząsteczkami i oddziaływują przez system wtórnych przekaźników

→ istotną rolę pełni tu cAMP i kinaza białkowa A, która jest zależna od niego

→ promotory genów, które są tak regulowane posiadają odpowiedni element DNA (CRE), który w odpowiedzi na cAMP wiąże się z odpowiednim białkiem aktywującym transkrypcję (Focia z Minaka).

→ CRE po związaniu z tym białkiem przekształca się w kompleks CREB, który pod wpływem kinazy A, która powoduje jego fosforylację, aktywuje transkrypcję

→ okazuje się, że u człowieka ok. 98% DNA nie koduje białek

→ z tego niekodującego DNA powstaje bardzo aktywny RNA, który spełnia swoją rolę jako regulator aktywności innych genów

→ wiele sekwencji intronowych jest usuwana z pierwotnego transkryptu, ale w części z nich zawarte są aktywne czynniki, tzw. mikroRNA, które regulują aktywność określonych genów

→ istotną rolę w regulacjij ekspresji genów pełnią niskocząsteczkowe kwasy RNA:

• siRNA – interferujący RNA – dwuniciowe cząsteczki RNA (pierwotny, nieaktywny, DICER musi go przeciąć) o długości ok. 20-25 par zasad, które powodują wyciszanie ekspresji genów o homologicznej sekwencji. Takie wyciszanie to interferencja RNA. SiRNA powstają przez pocięcie dwuniciowego RNA przez enzym DICER na fragmenty odpowiedniej długości. DICER jest wielodomenową rybonukleazą, należącą do RNAazy gr. 3. Krótkie siRNA wiążą się z kompleksem białkowym o aktywności rybonukleazy RISK. Aktywny kompleks jest zbudowany z białek i RNA. Kompleks ten wiąże się z komplementarną do siRNA cząsteczką mRNA i tnie ją na kawałki, uniemożliwiając w ten sposób powstanie kodowanego przez ten odcinek mRNA określonego białka. Zazwyczaj w przeciwieństwie do miRNA sekwencja siRNA jest w 100% homologiczna do określonej sekwencji mRNA. Rośliny wykorzystują mechanizm interferencji mRNA, ale też zwierzęta do ochrony przed wirusami. Powstaje najpierw dwuniciowy dsRNA, dicer przecina go i powstaje jednoniciowy siRNA, który łączy się z sekwencją komplementarną (przy obecności RISC)i dochodzi do degradacji. Interferon jest wektorem za pomocą którego siRNA można wprowadzić do komórki nowotworowej – tnie mRNA komórek nowotworowych

• miRNA – jednoniciowe cząsteczki RNA (21-23 nukleotydy), działają podobnie jak siRNA, ale nie tak precyzyjnie, bo nie posiadają 100% homologii z mRNA. Wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących (podobnie jak siRNA) specyficznie translację mRNA. Ich obróbka jest podobna do siRNA. Ocenia się że aktywność 30 % ludzkich genów jest m.in. regulowana przez miRNA

→ geny kodujące białka nie stanowią jedynej informacji, z której korzysta komórka

→ oprócz 30 tys genów, które kodują białka ssaków, niezwykle istotne znaczenie ma niekodujący DNA, oraz histony, ich chemiczne modyfikacje oraz stan kondensacji chromatyny jądrowej

→ ilość genów kodujących białka ma znaczenie drugorzędowe

→ istotą jest oddziaływanie pomiędzy sobą poszczególnych genów i ich produktów

WYKŁAD 9

Rekombinacja:

→ wymiana odcinków między cząsteczkami DNA

→ może ona zachodzić np. pomiędzy cząsteczkami 2 chromosomów, które są homologiczne czyli pochodzą od jednego z rodziców

→ rekombinacja jest to podstawowe narzędzie wymiany genów pomiędzy chromosomami i to pozwala na zwiększenie różnorodności komórek

→ natomiast przenoszenie genów pomiędzy komórkami umożliwiają wirusy poprzez rekombinację DNA chromosomalnego i wirusowego

→ przemieszczanie DNA może następować w obrębie jednego genomu

→ odcinki DNA, przemieszczające się z jednego miejsca w inne w obrębie jednego genomu nazywamy transpozonami (wykryte w kukurydzy w 1947r. Nobel w 1983r.)

→ odcinki DNA ulegające transpozycji mogą wywoływać duże zmiany w genach (np. insercje, delecje itp.), co skutkować może syntezą innych polipeptydów

→ należy zaznaczyć, że wycinanie i integracja transpozonów jest skutkiem rekombinacji między niehomologicznymi sekwencjami występującymi w transpozonach jest to rekombinacja nieuprawniona, w przeciwieństwie do uprawnionej gdzie dochodzi do rekombinacji między odcinkami homologicznymi DNA

Odwrotna transkryptaza:

→ wykryta w 1970r.

→ występuje w wirusach onkogennych. Występuje też u retrowirusów , czyli takich, w których jest odwrócony kierunek przepływu informacji genetycznej, u wirusów te genomy występują w wirionie w formie jednoniciowego RNA, a w komórce gospodarza w postaci dwuniciowego DNA. Wprowadzona do organizmu gospodarza odwrotna transkryptaza tworzy dwuniciowy DNA na matrycy RNA

→ enzym ten może robić:

• synteza DNA na matrycy RNA (cDNA)

• synteza DNA na matrycy DNA

• hydroliza RNA

→ wprowadzeniu retrowirusowego DNA do genomu gospodarza towarzyszy białko integracyjne IN wprowadzane do bakterii przez wirusa

→ do retrowirusów zaliczamy HIV (obrazek 2)

→ retrowirusy wywołują nowotwory, bo zawierają onkogeny, które są zdolne do transkrypcji i tworzą komórki nowotworowe (cykl życiowy wirusa HIV)

Technologia rekombinacji in vitro:

→ technologia rekombinacji in vitro obejmuje izolację i manipulację DNA, w celu uzyskania cząsteczek chimerycznych, a co za tym idzie nowych organizmów

→ do podstawowych narzędzi tej technologii należą:

• enzymy restrykcyjne

• liaza faga λ

• polimeraza Taq

• wektory

→ narzędzia te pozwalają na klonowanie DNA

Enzymy restrykcyjne:

→ endonukleazy (pochodzenia bakteryjnego) przecinające DNA w swoistych sekwencjach w obrębie cząsteczki

→ najczęściej zastosowanie znajdują endonukleazy z grupy II, które nie wymagają obecności ATP, ani S-adenozylometioniny, a tylko jonów Mg²⁺

→ enzymy te wraz z towarzyszącymi im specyficznymi metylazami, tworzą w komórkach bakteryjnych systemy modyfikacji i restrykcji

→ endonukleazy stanowią ochronę przed inwazją obcych cząsteczek DNA, zwłaszcza genomów fagowych

→ enzymy restrykcyjne przecinają DNA w swoistych sekwencjach palindromowych, czyli takich, których sekwencja nici jest taka sama jak sekwencja nici komplementarnej, ale czytanej w odwrotnym kierunku

→ przecięta cząsteczka DNA jest następnie łączona przez ligazy DNA

→ po zadziałaniu endonukleaz można te fragmenty restrykcyjne, które powstały po przecięciu DNA można identyfikować elektroforetycznie (sporządza się mapę restrykcyjną DNA)

→ dotychczas opisano kilkaset różnych nukleaz grupy II. W efekcie działania tych enzymów powstają fragmenty DNA o odmiennych charakterystycznych dla nukleaz końcach:

• tępe końce – endonukleazy, które je tworzą są rzadziej stosowane

• lepkie końce – zawierają niesparowane sekwencje DNA. Mogą tworzyć wiązania wodorowe, które są zgodne z zasadą komplementarności z lepkimi końcami każdego innego fragmentu DNA powstałego w wyniku działania tej samej endonukleazy

Ligaza faga T₄:

→ różne fragmenty DNA powstałe w wyniku trawienia przez endonukleazy restrykcyjne, pozostawiające takie same lepkie końce, można łatwo ze sobą łączyć kowalencyjnie stosując ligazę DNA faga T₄, która jest enzymem odtwarzającym w obecności ATP wiązania fosfodiestrowe

→ warunkiem działania tego enzymu jest obecność grupy fosforanowej na końcu 5’ łańcucha DNA

Polimeraza Taq:

→ termostabilna polimeraza DNA kodowana w genomie bakterii Thermus aquaticus

→ optymalna temperatura polimeryzacji dla tego enzymu to 70-75⁰C

→ enzym zachowuje zdolność do polimeryzacji po wielokrotnym ogrzewaniu w temp. 95⁰C (temperatura denaturacji dwuniciowego DNA)

→ dzięki tym właściwościom proces powielania DNA udało się zautoryzować stosując metodę PCR

Wektor

→ plazmid lub bakteriofag do którego może być wprowadzony obcy DNA w celu sklonowania

→ plazmidy to małe, koliste cząsteczki DNA, których naturalną funkcją jest nadawanie komórce gospodarza odporności na antybiotyki. Poza tym posiadają wiele właściwości, które są przydatne do konstrukcji wektorów. Istnieją one jako pojedyncze, bądź liczne kopie

→ mogą się replikować niezależnie od bakteryjnego DNA

→ plazmidy są mniejsze niż chromosom bakteryjny i dzięki temu można je łatwo oddzielić od DNA bakteryjnego (rysunek plazmidu)

→ kolejnym wektorem jest Faq

• zawierają cząsteczki liniowego DNA, do których może być włączony obcy DNA w licznych miejscach restrykcyjnych

→ kolejne wektory to kosmidy

• posiadają najlepsze cechy plazmidu i faga

Klonowanie DNA:

→ klonowanie można otrzymać przez syntezę enzymatyczną, która ma miejsce na DNA z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy

→ w wyniku działania odwrotnej transkryptazy otrzymujemy cDNA, w którym zawarta jest informacja o syntezie danego białka

→ ze względu na introny jest trudność na uzyskanie ekspresji DNA genów u eukariota, a w przypadku syntezy enzymatycznej stosuje się z cDNA, który syntetyzowany jest na matrycy bez intronów (dojrzałego mRNA)

Hybrydyzacja:

→ hybrydyzacja kwasów nukleinowych jest stosowana, gdy nie mamy ekspresji genów dla jego identyfikacji

→ polega na tworzeniu struktur dwuniciowych z cząsteczek posiadających komplementarne sekwencje nukleotydowe

→ do wykrywania poszukiwanego fragmentu DNA stosuje się sondy molekularne

→ taka sonda to oznakowany np. radioaktywnie fragment RNA lub jednoniciowego DNA, które jest komplementarne do jednej z nici poszukiwanego genu

→ po hybrydyzacji stosuje się techniki identyfikacji tych fragmentów, które nas interesują (Southern, Northern, Western) – przenoszenie plam

• southern – identyfikacja DNA – do identyfikacji chorób genetycznych

• northern – identyfikacja RNA

• western – identyfikacja białek

→ wszędzie elektroforeza żelowa, przeniesienie na bibułę, dodać sondę cDNA (DNA, RNA), przeciwciało (białka), autoradiogram

Mikromacierze:

→ opracowano szybką i wydajną technologię mikromacierzy DNA, która pozwala na badanie sekwencji kwasów nukleinowych w krótkim czasie (pojawiły się w 1996r.)

→ można przebadać tysiące genów

→ jest to szklana lub sylikonowa płytka 2x2cm i jest tam dużo oligonukleotydów i elementy barwi się fluorescencyjnie

→ fragmenty, które uległy hybrydyzacji oglądamy pod mikroskopem fluorescencyjnym (są obecne w genie)

→ wyniki pozwalają na określenie stanu molekularno-metabolicznego komórki

→ ma to zastosowanie w diagnostyce

→ wykonuje się mikromacierze białek, które określają rodzaj, ilość i oddziaływanie pomiędzy sobą w komórkach

→ oparte są na reakcjach białko-antygen-przeciwciało

Cechy idealnego wektora:

→ łatwość izolacji

→ zdolność do samodzielnej amplifikacji (namnażania) niezależnie od amplifikacji DNA gospodarza

→ znajomość mapy restrykcyjnej

→ wektor musi posiadać markery selekcyjne

Zastosowanie technologii rekombinacji DNA in vitro:

→ mapowanie genów umożliwia ich umiejscowienie w określonych chromosomach (mapa genomu ludzkiego)

→ biomedycyna (diagnozowanie chorób genetycznych, produkcja insuliny przez bakterie)

→ terapia genowa – choroby wywołane niedoborem produktu genowego mogą być odpowiednie do leczenia genowego

→ strategia takiego leczenia polega na sklonowaniu genu w wektorze, który może być pobrany przez komórkę gospodarza i włączony do genomu

→ wprowadzony geny może kierować ekspresję swego produktu białkowego i w ten sposób naprawiać ubytek w komórce gospodarza np. określony enzym

Somatyczna terapia genowa:

→ w odróżnieniu do wprowadzania odpowiednich genów do zapłodnionej komórki jajowej, polega na wprowadzeniu kopii prawidłowych genów tylko do niektórych komórek ciała (tylko somatycznych)

→ takie zastąpienie genu w komórce somatycznej nie może być oczywiście dziedziczone przez potomstwo

→ przykładem może być tzw. naprawienie leukocytów – leukocyty zmienione genetycznie posiadają bardzo niską aktywność deaminazy adenozylowej; pobrane od chorego komórki poddaje się in vitro transformacji genetycznej, a następnie wszczepia się ponownie choremu

→ pierwszą terapię genową przeprowadzono w USSA w 1990r.

Rośliny transgeniczne:

→ pierwsze otrzymano w 1984r. (w sklepach od 1994r.)

→ prowadzi się badania nad roślinami odpornymi na warunki środowiskowe (susza, temperatura), odporne na choroby, dające większe plony, posiadające w swych komórkach białka powodujące odporność ludzi na niektóre schorzenia

→ obecnie odkryte już rośliny transgeniczne prawie wszystkich dwuliściennych i większa część jednoliściennych

Zwierzęta transgeniczne:

→ myszy z hormonem wzrostu szczura (1980)

→ karpie z hormonem wzrostu człowieka

→ krowy, które mogłyby produkować mleko z odpowiednimi, pożądanymi białkami np. leczniczymi, które mogłyby być wykorzystane w leczeniu wielu chorób lub nadającymi odporność na choroby itp.

→ otrzymuje się je zwykle przez wprowadzenie nowego genu do jądra zapłodnionej komórki jajowej przez mikroiniekcję w okolicy męskiego przedjądra – powstałego z plemnika

→ następnie taką komórkę implantuje się do macicy

→ takie zwierzęta wykorzystuje się do analizy ekspresji genów chorób genetycznych u człowieka

Reakcja PCR:

→ w 1984r. Kary Mulis wynalazł bardzo pomysłową metodę nazywaną reakcją łańcuchową polimerazy, za pomocą której można powielać określone sekwencje DNA

→ PCR przeprowadza się dodając do roztworów następujące składniki: parę starterów (primerów), trifosforany wszystkich deoksyrybonukleotydów, polimeraza DNA (niewrażliwa na temp, która jest narzędziem w rekombinacji)

→ 1. Etap – oddzielenie nici DNA (denaturacja) – ogrzewanie w temperaturze 95⁰C przez 15 sek

→ 2. Etap – hybrydyzacja odcinków starterowych czyli przyłączania primerów (20-30 nukleotydów) do odpowiednich sekwencji DNA, temp 54⁰C , kilkadziesiąt sekund

→ 3. Etap – synteza DNA – elongacja – przebiega w temp 72⁰C optymalnej dla polimerazy Taq. Teoretycznie po n cyklach odpowiednia sekwencja zostaje powielona w ilości 2n. Czas trwania to mniej niż 1 godzina

→ zastosowanie reakcji PCR:

• wykrywanie wirusów i bakterii

• ustalenie ojcostwa

• profil DNA mumii

• kryminalistyka

• wykrywanie niektórych odmian raka

WYKŁAD 10

Nowe dziedziny biologii:

→ bioinformatyka – zajmuje się gromadzeniem, przechowywaniem i porównywaniem informacji biologicznych dotyczących m, In. DNA, komplementarnego DNA oraz sekwencji aminokwasowych

→ genomika - zajmuje się uogólnieniem wiedzy na temat budowy genomów

→ transktyptomika – mając do dyspozycji jedynie sekwencje DNA niewiele możemy powiedzieć, co aktualnie dzieje się w komórce, znacznie precyzyjniejsze informacje uzyskać możemy na podstawie analizy transktyptomu, czyli ogółu cząsteczek mRNA

→ proteomika – zajmuje się analizą i identyfikacją proteomu, czyli ogółu białek syntetyzowanych na bazie transkryptomu; podstawowe narzędzie proteomiki to: elektroforeza dwukierunkowa (2-D) oraz spektrometria mas (MS)

Budowa genomu:

→ do niedawna uważano, że genom ludzki zawiera ok. 100 000 genów

→ w 2001r. ustalono sekwencje nukleotydów ludzkiego genomu i okazało się, że tych genów jest ok. 30-40 tys

→ niektóre rośliny (np. rzodkiewnik) posiadają 26 tys. genów

→ nie liczba genów, ale syntetyzowane na bazie genów białka oraz ich budowa, architektura determinują ich funkcje w organizmie

→ okazuje się, że w genomie człowieka istnieje wyjątkowo duża liczba odcinków DNA, które nie kodują bezpośrednio białek, ale wpływają na regulację ekspresji genów (regulują wytwarzanie większości białek)

→ wynika z tego, że nie liczba genów ale architektura białek ich kodujących oraz sposób regulacji ich odczytywania decydują o skomplikowaniu organizmu

→ w organizmie człowieka jest syntetyzowanych ponad milion różnych białek, z których każda pełni określoną funkcję (strukturalne, regulacyjne, metaboliczne)

→ dzięki tym substancjom możliwa jest przede wszystkim przemiana materii i energii w komórce (enzymy, hormony)

→ białka pełnią też określone funkcje strukturalne, transportowe i regulacyjne (ciśnienie wewnątrzkomórkowe, utrzymanie stałego pH, krzepnięcie krwi i wiele innych)

Analiza transktyptomu:

→ w każdej komórce organizmu wielokomórkowego znajduje się kompletny genom a więc wszystkie jego geny

→ zestawy genów, które są odczytywane, czyli ulegają transkrypcji w poszczególnych komórkach a nawet tkankach są inne. Takie zestawy nazywamy profilami transkrypcyjnymi

→ różnice te wynikają m. in. z rodzaju tkanki i komórki jak również zależą od etapu rozwoju organizmu

→ profil transkrypcyjny płodu, noworodka i dorosłego człowieka jest inny - wynika to z potrzeb rozwoju organizmu

→ organizm jest sumą bardzo wielu profili transkrypcyjnych swojego genomu, rozłożonego zarówno w przestrzeni (tkanki, komórki) jak również w czasie (różne etapy rozwoju ale także stany patologiczne)

→ pojedynczy profil określa się stanem transkrypcyjnym komórki lub tkanki

→ odpowiada mu pewien zestaw transkryptów (zbiór różnych mRNA)

→ odczytywanie transkryptomu jest niewspółmiernie trudniejsze niż odczytywanie genomu (odczyt genomu – DNA, transkryptomu –mRNA)

→ technologia umożliwiająca odczyt transkryptomu nosi nazwę mikromacierzy DNA

Odmiany analizy transkryptomu:

→ ich podstawą są szklane lub nylonowe mikropłytki, na które nanosi się na stałe setki a nawet tysiące jednoniciowych fragmentów DNA odpowiadających różnym genom. W ten sposób można uzyskać płytki zawierające wszystkie geny roślin, zwierząt i także człowieka. Każdy gen na takiej płytce to jest mała kolorowa plamka. DNA dosłownie nadrukowuje się na podłoże jak litery na kartkę papieru. Urządzenia, które do tego służą działają jak drukarki atramentowe. Każdy gen na płytce ma przypisaną pozycję, która zapisywana jest w odpowiednim programie komputerowym (bioinformatyka), służącym do opracowania wyników

→ podstawowa funkcja płytek to pokazanie zawartości poszczególnych genów w całkowitym RNA, który otrzymuje się z dowolnego fragmentu materiału biologicznego, z którego pochodzą umieszczone na płytce fragmenty DNA

→ płytki takie inkubuje się z roztworem zawierającym kopię wszystkich rodzajów mRNA (transkryptomów) znajdujących się w całkowitym RNA, który wydzielany jest z określonej tkanki czy komórki

→ jeśli w roztworze tym występuje mRNA określonego genu, połączy się on na zasadzie komplementarności do odpowiedniej mu sekwencji DNA (czyli do określonej plamki na płytce). To zjawisko nosi nazwę hybrydyzacji

→ dzięki możliwości znakowania kopii mRNA barwnikami fluoryzującymi taka plamka z przyłączoną kopią świeci w świetle UV (280nm) i można ją za pomocą odpowiedniego czytnika bardzo łatwo zidentyfikować

→ w taki sposób możemy uzyskać informacje, które geny w tkance w stanie chorobowym są transkrybowane ze zmniejszoną lub zwiększoną aktywnością w porównaniu do komórek fizjologicznych

→ reasumując, dzięki technologii mikromacierzy DNA możemy uzyskać globalny obraz aktywności genów (wszystkich genów znajdujących się w genomie) w dowolnym obszarze i dowolnym stanie organizmu

Analiza proteomu (analiza białek):

→ aktywność transkrypcyjna genów, czyli wytwarzanie odpowiednich mRNA ma kluczowe znaczenie dla określenia cech morfologicznych i fizjologicznych komórek

→ świadczy o tym chociażby to, że system kontroli aparatu transkrypcyjnego jest jednym z najbardziej skomplikowanych systemów molekularnych w przyrodzie

→ wytworzenie transkryptomów to nie wszystko

→ aby wywrzeć jakikolwiek wpływ na losy komórki transkryptomy muszą być przetłumaczone na odpowiednie białka

→ pojawienie się określonego transkryptu w komórce nie oznacza, że będzie on natychmiast i w całości wykorzystywany do produkcji białek

→ w cząsteczce mRNA jest zawartych wiele skomplikowanych motywów strukturalnych, które odbierają sygnały o stanie komórki

→ w zależności od sumy tych sygnałów dany mRNA może być wykorzystywany do syntezy bardzo wielu lub tylko jednej kopii kodowanych przez siebie białek, albo może być również natychmiast zniszczony, gdy nie ma potrzeby syntezy tego białka

→ aby dowiedzieć się, jaki jest końcowy efekt konkretnego stanu transkrypcyjnego komórki bądź tkanki musimy poznać wszystkie zawarte w niej białka

→ profil wszystkich białek organizmu nosi nazwę proteomu. Proteom jest jeszcze bardziej skomplikowany niż transkrypton, bo białka czy cząsteczki probiałek już po syntezie ulegają różnorodnym modyfikacjom potranslacyjnym (glikozylacja, fosforylacja, metylacja). Jedno i to samo białko może być modyfikowane na wiele różnych sposobów. W zależności od tego jakim modyfikacjom ulega białko, tak zmieniają się jego właściwości

Różne sposoby przeprowadzania analizy proteomu:

→ dwie podstawowe metody to elektroforeza dwukierunkowa i spektrometria mas

→ cząsteczki białek można fragmentować trawiąc je przede wszystkim trypsyną (enzym proteolityczny)

→ enzym ten przecina wiązania peptydowe tylko pomiędzy określonymi aminokwasami

→ w związku z tym każde białko ma specyficzny dla siebie wzór po trawieniu trypsyną

→ tym wzorem są określone fragmenty łańcucha polipeptydowego o określonej masie cząsteczkowej

→ taki wzór jest czymś w rodzaju niepowtarzalnej sygnatury danego białka (nie ma dwóch identycznych białek po trawieniu trypsyną)

→ dostępność informacji o sekwencji genów, a nawet genomów oznacza, że dla wszystkich zakodowanych w nich białek możemy teoretycznie przewidzieć masy cząsteczkowe peptydów powstałych po trawieniu trypsyną

→ w przypadku organizmów o sekwencjonowanych genomach (np. człowiek) wystarczy wyznaczyć masy peptydów powstałych po trawieniu trypsyną określonych rzeczywistych białek i porównać je do teoretycznie przewidywanych, niepowtarzalnych wzorów zgromadzonych w komputerowej bazie danych, aby natychmiast dowiedzieć się, z jakimi białkami mamy do czynienia

→ od dłuższego czasu potrafimy rozdzielać mieszaninę białek za pomocą elektroforezy dwukierunkowej (2-D)

→ metoda ta pozwala uwidocznić na podłożu (żel poliakrylamidowy) tysiące plamek peptydów, gdzie każda odpowiada danemu białku

→ pomimo, że ilość białka po rozdziale w pojedynczej plamce jest bardzo mała, to możliwa jest identyfikacja peptydu dzięki spektrometrii mas

→ spektrometry mas korzystają z baz bioinformatycznych i potrafią w bardzo krótkim czasie zanalizować i ocenić z jakim białkiem mamy do czynienia

Przykłady i funkcje białek:

→ w organizmie zwierzęcym syntetyzowane jest ponad milion białek

→ białka chromatyny – funkcja w kondensacji chromatyny

→ białka mleka

• kazeiny, laktoalbuminy, laktoglobuliny; enzymy: fosfatazy, lipazy, amylazy, oksydazy, lizozym, peroksydazy

• kazeina jest fosfoproteiną. W największej ilości występuje α- kazeina (60% ogółu białek), β ok. 25% i kappa kazeina, która razem z α- i β-kazeiną i jonami wapnia tworzą micele kazeinowe (widoczne dobrze w TEM)

→ białka włosów

• keratyny

• występują we włosach paznokciach, kopytach, piórach, w skórze. Posiadają strukturę alfa helisy. Bogate są w cystynę (15%), dzięki jej obecności utrzymywana jest m. in. struktura włosa (zależy ona od mostków siarczkowych). 10% keratyn (głównie arginina)

→ białka mięśni

• miozyna

• aktyna

• kolagen

→ białka osocza krwi – albuminy, globuliny

Hormony peptydowe i białkowe:

→ kluczową rolę w wydzielaniu hormonów odgrywa podwzgórze. Tu pod wpływem impulsów nerwowych są wydzielane hormony (RH – releasing hormone lub RF – releasing factor) zwane również libertynami, które regulują wytwarzanie hormonów tropowych części gruczołowej przysadki. Z kolei te hormony tropowe wywierają funkcje wydzielnicze na korę nadnerczy, tarczycę, czy gruczoly płciowe, gdzie są wydzielane już odpowiednie hormony

→ niektóre hormony podwzgórza:

• CRH (koprtykoliberyna) – czynnik uwalniający kortykotropinę

• TRF – uwalnia tyreotropinę

• LHRF – uwalnia luliberynę

• GNRH – uwalnie gonadotropinę

• GHRH - somatoliberyna - uwalnia hormon wzrostu

• GHRIH – somatoliberyna – hamuje uwalnianie hormonu wzrostu

• LH – liberyna - uwalnia gonadotropiny

• PID – uwalnia prolaktynę

• PIF – prolaktostatyna – hamuje wydzielanie prolaktyny

→ hormony oligopeptydowe:

• oksytocyny – powoduje skurcz mięśni gładkich, wpływa na owulację, transport nasienia

• leptyna – okryta w 1994r. produkowana przez komórki tłuszczowe (adipocyty). Uważana jest za jeden z podstawowych sygnałów obwodowych wpływających na pobieranie pokarmu i co za tym idzie masę ciała. Leptyna obniża apetyt i reguluje nadmierną otyłość. Składa się ze 167 aminokwasów. Gen kodujący ten hormon zlokalizowany jest na 7 chromosomie człowieka. Zbudowany z 3 egzonów i 2 intronów. Synteza i uwalnianie leptyny stymulowane jest przez insulinę, glikokortykoidy i cytokiny. W przypadku cukrzyc może dojść do zaburzeń wydzielania tego hormonu

• oreksyna -1998r. Odkryte 2 neuropeptydy A i B, które są stymulatorami łaknienia i regulują gospodarkę energetyczną organizmu. Produkowane są przez neurony podwzgórza. Powstają z prekursora preprooreksyny. Stymuluje pobieranie pokarmu, wydzielanie soku żołądkowego, kontroluje procesy snu i stanu czuwania organizmu

Enzymologia:

→ wszystkie reakcje biochemiczne zachodzące w komórkach zwierząt katalizowane są przez biokatalizatory – enzymy

→ zdecydowana większość enzymów to białka (nieliczne wyjątki to cząsteczki katalitycznego RNA – rybozyny lub kompleksy złożone z RNA i białka)

→ jedną z podstawowych funkcji enzymów jest uwalnianie potencjalnej energii chemicznej znajdującej się w wiązaniach kowalencyjnych cząsteczek (enzymy zmniejszają energię aktywacji potrzebną do zapoczątkowania reakcji)

→ większość enzymów posiada złożoną budowę chemiczną które oprócz części białkowej zwanej apoenzymem, zawierają w swej budowie część niebiałkową – koenzymy, grupy prostetyczne

→ koenzymy rozpuszczalne wiążą się w enzymem jak substraty, ulegają reakcjom chemicznym i są uwalniane

→ grupy prostetyczne są to koenzymy silnie związane (kowalencyjnie) z cząsteczką enzymu, podczas reakcji nie są odłączane

→ koenzymami są zazwyczaj drobnocząsteczkowe związki organiczne głownie witamy lub jony nieorganiczne (głównie dwuwartościowe)

→ ich obecność w centrum aktywnym enzymu jest konieczna do związania substratu i przeprowadzenia reakcji chemicznej

→ funkcję katalityczną w enzymach pełnią tzw. centra aktywne, bądź centra katalityczne, gdzie dochodzi do związania i przekształcenia substratu w produkt

→ miarą szybkości reakcji enzymatycznych jest albo ubytek substratu w jednostce czasu, albo przyrost produktu w jednostce czasu

→ w obrębie centrum aktywnego (katalitycznego) wyróżniamy tzw. grupy kontaktowe, za pomocą których enzym wiąże substrat. Najczęściej są to aminokwasy (reszty aminokwasów) posiadające dodatkowe grupy funkcyjne np. aminokwasy kwaśne, zasadowe

Budowa centrum aktywnego – rysunek (Harper)

→ wyróżniamy 3 typy budowy centrum aktywnego

• najprostszy typ – w skład centrum wchodzą tylko aminokwasy (białka proste – hydrolazy – enzymy restrykcyjne, enzymy proteolityczne, nukleazy)

• w skład centrum wchodzą aminokwasy i koenzymy

• w skład centrum wchodzą aminokwasy, koenzymy i jony metali

→ ponad 25% wszystkich znanych enzymów zawiera silnie związane jony metali są to tzw. metaloenzymy. W wielu przypadkach metal wiąże się nie bezpośrednio z białkiem enzymatycznym, lecz ze specyficznym ugrupowaniem enzymatycznym. Wymienić tu można m. in. hemoproteiny (katalazy, peroksydazy, cytochromy) cynkoproteiny (dehydrogenaza alkoholowa i mleczanowa, karboksypeptydaza)

Specyficzność substratowa

→ znane są enzymy wykazujące małą specyficzność substratową, to znaczy reagujące z dużą liczbą substratów, ale katalizujące ten sam typ reakcji (różny substrat, jeden typ reakcji) np. lipazy, fosfatazy

→ istnieją enzymy o dużej specyficzności (wysokospecyficzne), które mogą reagować tylko z jednym substratem. Przykładem takiego enzymu jest ureaza, która rozkłada mocznik do CO2 i amoniaku

→ specyficzność enzymów związana jest z budową centrum aktywnego i konfiguracją przestrzenną grup kontaktowych

WYKŁAD 11

Mechanizm działania enzymów:

→ reakcja enzymatyczna przebiega w następujący sposób:

enzym + substrat -> kompleks enzym-substrat

→ potem kompleks enzym-produkt i w końcowym efekcie uwalniany jest produkt i enzym, który potem może wchodzić w kolejne reakcje

E-enzym

A, B – substraty

C, D - produkty

→ miarą aktywności enzymu jest przyrost produktu w jednostce czasu lub ubytek substratu w jednostce czasu

Teorie katalizy enzymatycznej:

→ teoria Fischera (teoria sztywnego centrum, teoria zamka i klucza) zakładająca, że ani w obrębie substratu ani w obrębie centrum aktywnego enzymu nie dochodzi do zmian konformacyjnych (substrat musi pasować idealnie jak klucz do zamka). Gdyby tak było, jeden enzym mógłby reagować tylko z jednym substratem. Wszystkie enzymy musiałyby być wysoce specyficzne. Występują enzymy mniej specyficzne przeprowadzające ten sam typ reakcji z różnymi substratami

→ teoria Koshlanda (teoria indukcyjnego dopasowania, teoria giętkiego centrum, teoria ręki i rękawiczki) zakładająca, że w momencie łączenia się substratu z centrum aktywnym enzymu dochodzi do zmian konformacyjnych w obrębie głównie centrum aktywnego, ale również w obrębie substratu (substrat i enzym i centrum aktywne dopasowują się do siebie wzajemnie – ręka do rękawiczki)(HARPER)

Jednostki szybkość reakcji enzymatycznych:

→ szybkość reakcji enzymatycznych jest różna, dlatego wprowadzono różnego rodzaju jednostki

→ jednostka enzymatyczna to taka ilość enzymu, która w określonych warunkach przy stałym pH i temperaturze 30⁰C katalizuje przekształcenie 1 mikromola substratu w ciągu jednej minuty

→ w przypadku enzymów oczyszczonych, wyodrębnionych z komórek stosuje się pojęcie aktywności właściwej. Określa ona ilość jednostek enzymu na 1 mg białka

→ aktywność molekularna określa liczbę cząsteczek substratu przy optymalnym jego stężeniu przekształconych przez jedną cząsteczkę enzymów w ciągu jednej minuty

Numer enzymów:

→ enzymy sklasyfikowane są w postaci 6 klas. Każdy enzym posiada swój określony numer.

→ np. 1.4.12.10

→ 1- numer klasy enzymów

→ 4- czwarta podklasa

→ 12- numer podpodklasy

→ 10- określa numer enzymu w podpodklasie

Wyróżniamy 6 klas enzymów:

→ 1) Oksydoreduktazy – reakcje oksydoredukcyjne: dehydrogenazy, oksygenazy, peroksydazy, reduktazy, monooksygenazy, dioksygenazy. Koenzymami tej klasy enzymów są: NAD, NADP, FNM, FAD (wychwytywanie określonych jonów, elektronów)

→ 2) Transferazy – przenoszą rodnik bądź określoną grupę funkcyjną z jednego związku na drugi. To, co przenoszą determinuje ich nazwę: aminotransferazy, metylotransferazy, formylotransferazy itd. Koenzymy: CoA (koenzym acylotransferaz, przenosi grupy acylowe), difosforan tiaminy (przenosi aldehydy z ketozwiązków , bierze udział w dekarboksylacji oksydacyjnej 2-oksokwasów), fosforan pirydoksalu (ufosforylowana forma witaminy B6, koenzym aminotransferaz), kwas tetrahydrofoliowy THFA, koenzym formylotransferaz, hydroksymetylenotransferaz, formiminotransferaz; przenosi fragmenty jednowęglowe), biotyna (koenzym karboksyfransferaz, przenosi CO2 przy udziale ATP), fosforany nukleozydów (nukleotydy wysokoenergetyczne): ATP, GTP, CTP, UTP, koenzymy fosfotransferaz (kinaz) przenoszą reszty ortofosforanowe

→ 3) Hydrolazy – jedyna klasa enzymów nie posiadająca koenzymów (są to białka proste). Hydrolazy katalizują rozbicie wiązań chemicznych z udziałem wody. Nazwy tych enzymów tworzymy w zależności od tego, na jakie wiązania działają: peptydazy, esterazy, glikozydazy itd. Do tej klasy enzymów zaliczamy także nukleazy, w tym enzymy restrykcyjne, które przecinają w określonych pozycjach łańcuchy kwasów nukleinowych

→ 4) Liazy – katalizują rozbicie wiązań z udziałem węgla takich jak C-C, C-O, C-N, C-S. Powodują one uwalnianie z substratów, na które działają substancji drobnocząsteczkowych np. CO2 (podczas dekarboksylacji), H2O. Przykłady enzymów to dekarboksylazy, dehydratazy, desulfhydratazy. W odróżnieniu od hydrolaz nie wymagają one do swego działania środowiska wodnego. Mają koenzymy, ale nie są to koenzymy przypisane do tej klasy. Są to witamina B1, biotyna, ATP, GTP, CTP, UTP itd.

→ 5) Izomerazy (mini transferazy) – katalizują one przekształcenia wewnątrzcząsteczkowe: epimerazy, izomerazy cis trans, mutazy. Głównym koenzymem tej klasy jest witamina B12

→ 6) Ligazy (syntetazy) – katalizują syntezę nowych wiązań m. in. karboksylazy (dołączenie CO2 w syntezie kwasów tłuszczowych, gdzie Ac-CoA przekształca się w malonylo-CoA, β-oksydacja kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla, gdzie dochodzi do przekształcenia propionylo-CoA w metylomalonylo-CoA a następnie w sukcynylo-CoA; inicjacja biosyntezy mocznika – powstawanie karbamoilofosforanu. Karboksylazy czerpią CO2 z różnego rodzaju przemian, z których jest on uwalniany (endogenny dwutlenek węgla). Najczęściej uwalniany jest w procesie dekarboksylacji oksydacyjnej a źródłem CO2 jest m.in. cykl pentozo fosforanowy (utlenianie glukozy w warunkach tlenowych)

Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężenia substratu:

→ stała Michaelisa – takie stężenie substratu, przy którym prędkość reakcji enzymatycznej równa się połowie prędkości maksymalnej(w każdym)

→ świadczy ona o powinowactwie enzymu do substratu (im mniejsza wartość stałej Michaelisa (wyrażana w molach) tym większe powinowactwo enzymu do substratu)

Enzymy izosteryczne:

→ regulatory (aktywatory i inhibitory) oddziaływują bezpośrednio na centrum aktywne enzymu

Enzymy allosteryczne:

→ posiadają dodatkowe centra (centra regulacyjne), efektory (inhibitory bądź aktywatory) działają w pierwszej kolejności na centrum regulacyjne, co powoduje zmianę ich konformacji

→ dopiero centrum regulacyjne oddziaływuje na centrum aktywne przyspieszając lub hamując przyłączanie substratu

Sposoby aktywacji enzymów:

→ ograniczona proteoliza - dotyczy to przede wszystkim enzymów proteolitycznych (hydrolizujących łańcuchy polipeptydowe). Ograniczona proteoliza to przecięcie łańcucha polipeptydowego w jednym lub kilku miejscach, w przeciwieństwie do proteolizy totalnej, gdzie łańcuch jest cięty na aminokwasy. Ograniczona proteoliza ma na celu takie przekształcenie cząsteczki proenzymu, aby nabył on pełną aktywność enzymatyczną. Enzymy te muszą być nieaktywne, ponieważ doszłoby do samostrawienia. Sposoby: aktywacja pepsynogenu-pepsyny, aktywacja trypsynogenu-trypsyny (rysunek)

→ modyfikacje kowalencyjne - polegają przede wszystkim na procesach fosforylacji i defosforylacji enzymów. Większość enzymów jest aktywna w postaci ufosforylowanej. Wyjątkiem są enzymy, które są aktywne w postaci defosforylowanej: fosforylaza glikogenowa (hydrolizuje glikogen na n-cząsteczek glukozy, jest aktywna w postaci ufosforylowanej), syntetaza glikogenowa (odpowiada za syntezę glikogenu z cząsteczek glukozy, aktywna w postaci defosforylowanej)

→ modyfikacje niekowalencyjne - zachodzą w czasie przyłączenia substratu lub koenzymu

Hamowanie aktywności enzymów:

→ hamowanie autosteryczne:

• hamowanie kompetycyjne (konkurencyjne) – konkurencja pomiędzy inhibitorem i substratem o centrum aktywne. Inhibitory i substraty mają podobną budowę. Jest to hamowanie odwracalne. Jeśli reakcja enzymatyczna zostanie zahamowana, to poprzez zwiększenie stężenia substratu dochodzi do wyparcia inhibitora z centrum aktywnego i reakcja zachodzi dalej

  E+S+I->(EI) +S

• hamowanie niekompetycyjne (nieodwracalne) – substrat i inhibitor posiadają różną budowę i łączą się z centrum aktywnym enzymu w różnych miejscach, tworząc kompleks enzym-substrat-inhibitor. Prowadzi to do takich zmian konformacyjnych enzymu, że substrat nie może być przekształcony w produkt

→ hamowane allosteryczne

Enzymatyka stosowana klinicznie:

→ izoenzymy – różne formy molekularne tego samego enzymu, uwarunkowane genetycznie, katalizujące tę samą reakcję chemiczną, występujące w różnych narządach bądź tkankach tego samego organizmu. Izoenzymy różnią się właściwościami fizykochemicznymi (ruchliwość elektroforetyczna – diagnostyka, optimum pH, pI, wrażliwość na inhibitory itp.)

→ heteroenzymy – różne formy molekularne tego samego enzymu występujące u różnych gatunków

→ sztandarowy enzym stosowany klinicznie: dehydrogenaza mleczanowa (progronian -> mleczan w warunkach beztlenowych). Jest umiejscowiona w różnych narządach. Dehydrogenaza mięśniowa posiada 4 takie same podjednostki, wątrobowa 3, mózgowa 1

→ w warunkach fizjologicznych we krwi nie obserwuje się aktywności enzymów zamkniętych w komórkach odpowiednich narządów

→ natomiast przy uszkodzeniu jakiegoś narządu dochodzi do wzrostu aktywności określonej formy molekularnej enzymu (np. dehydrogenazy), co świadczy o stanie patologicznym narządu, dla którego dana forma molekularna jest charakterystyczna

→ jeśli chodzi o dehydrogenazę mleczanową, to za pomocą tego enzymu możemy diagnozować stan fizjologiczny mięśni szkieletowych, mięśnia sercowego, mózgu i wątroby

→ przy zawałach mięśnia sercowego pojawia się we krwi bardzo dużo tego enzymu

WYKŁAD 12

Bioenergetyka:

→ termodynamika biochemiczna

→ zajmuje się badaniem zmian energetycznych towarzyszących reakcjom biochemicznym

→ dostarcza ona podstawowych reguł wyjaśniających dlaczego niektóre reakcje mogą zajść, a inne nie mogą

→ układy niebiologiczne mogą wykorzystywać energię cieplną do wykonywania pracy

→ układy biologiczne są zasadniczo izotermiczne i używają energię chemiczną do napędzania procesów życiowych

→ paliwem dostarczającym energii potrzebnej do prawidłowego przebiegu procesów życiowych są węglowodany, lipidy i białka

→ znajomość sposobu w jaki czerpie energię z pożywienia jest podstawą zrozumienia prawidłowego odżywiania organizmu

→ jeśli te rezerwy ulegają wyczerpaniu, dochodzi do śmierci głodowej

→ gdy energia jest magazynowana w nadmiarze prowadzi do otyłości

Energia swobodna:

→ energią użyteczną układu jest energia swobodna (Δ G) – energia uwalniana podczas reakcji samorzutnych (spontanicznych)

→ zmiana energii swobodnej jest tą częścią zmiany energii całkowitej układu, która jest wykorzystywana do wykonania pracy, tzn. jest energią użyteczną, zwaną w układach chemicznych jako potencjał chemiczny

→ sprzężenie reakcji egzotermicznej z endotermiczną. Energia uwalniana jest z 1 reakcji aby służyć do rozpoczęcia drugiej

→ procesy życiowe np. reakcji syntez, aktywny transport czerpią energię swobodną z reakcji oksydoredukcyjnych

Metabolizm:

→ katabolizm + anabolizm=metabolizm

→ przemiana metaboliczna A w B zachodzi z uwolnieniem energii swobodnej i jest to reakcja egzoergiczna lub katabolizm. Przemiana ta sprzężona jest z inną reakcją, która wymaga energii swobodnej. Dotyczy to przekształcenia metabolitu C w D. Ta reakcja jest reakcją endoergiczną, czyli anabolizmem

→ metabolizm jest to zintegrowane działanie licznych zestawów wieloenzymatycznych współuczestniczących w dokonywaniu wymiany materii i energii między komórką a jej środowiskiem

→ alternatywną drogą sprzęgania procesów endoergicznych i egzoergicznych jest synteza związków bogatoenergetycznych (ATP, GTP, itd.). Wytworzenie związków wysokoenergetycznych wykorzystywane jest w reakcjach endoergicznych

Funkcje metabolizmu

→ uzyskiwanie energii chemicznej ze środowiska

→ przekształcenie substancji pokarmowych w cząsteczki budulcowe lub prekursorowe do wielocząsteczkowych składników komórki

→ zestawienie jednostek budulcowych w białka, kwasy nukleinowe, lipidy i inne składniki komórki

→ wytwarzanie i rozkładanie biomolekuł niezbędnych w wyspecjalizowanych funkcjach komórek

Kierunki metabolizmu:

→ anabolizm – enzymatyczne procesy syntezy z prostych cząstek prekursorowych dużych cząstek składników komórkowych. Wymaga to wkładu energii swobodnej, której dostarcza dostępna energia wiązań fosforanowych ATP.

→ katabolizm – enzymatyczne procesy rozkładu (głownie w wyniku reakcji utleniania) dużych cząstek pokarmowych z wytwarzaniem cząstek prostych. Procesom tym towarzyszy wyzwalanie energii swobodnej, która jest magazynowana w formie ATP

Wiązania wysokoenergetyczne:

→ metodą sprzęgania procesów egzoergicznych z endoegricznymi jest synteza związku bogatoenergetycznego, który powstaje w reakcji egzoergicznej

→ jednak zanim ta energia swobodna zostanie zużyta musi być zmagazynowana w związkach chemicznych

→ w komórkach organizmu proces ten połączony jest z powstawaniem związków ufosforylowanych

→ związki te zawierają wiązania wysokoenergetyczne (makroegriczne, bogatoenergetyczne)

→ w żywych komórkach najważniejszym związkiem wysokoenergetycznym jest ATP

→ energia swobodna magazynowana jest w związkach ufosforylowanych, które zawierają wiązania makroergiczne

→ w przypadku trifosforanów nukleozydów posiadających 2 wiązania wysokoenergetyczne

→ wyjątkiem są metabolity glikolizy (1,3-bisfosfoglicerynian), kwas fosfoenolopirogronowy, fosfageny mięśniowe (fosfokreatyna)

→ wiązanie wysokoenergetyczne jest wtedy, gdy jego hydroliza uwalnia ponad 25J/mol

→ fosforany wysokoenergetyczne odgrywają rolę w przyjmowaniu i przenoszeniu energii w układach biologicznych

→ pośrednia wartość energii swobodnej dla hydrolizy ATP w porównaniu z innymi fosforanami organizmu ma istotne znaczenie biologiczne

→ zmiany entalpii swobodnej hydrolizowanych związków energetycznych (HARPER)

Fosforan organiczny	ΔG^0
	kJ/mol
Fosfoenoloporogronian Karbomoilofosforan 1,3-Bifosforoglicerynian (do 3-fosfoglicerynian) Fosfokreatyna ATP -> ADP + Pi ADP -> AMP + Pi Pirofosforan Glukozo-1-fosforan Fruktozo-6-fosforan AMP Glukozo-6-fosforan Glicerolo-3-fosforan	-61,9 -51,4 -49,3 -43,1 -30,5 -27,6 -27,6 -20,9 -15,9 -14,2 -13,8 -9,2

→ środkowa pozycja ATP pośród fosforanów organizmu powoduje, że ADP może przyjmować wiązania bogatoenergetyczne od fosforanów powyżej ATP: taki typ reakcji to fosforylacja substratowa

• przekształcenie 1,3 bisfosfoglicerynianu w 3-fosfoglicerynian (z wytworzeniem ATP)

• przekształcenie fosfoenolopirogronianu w pirogranian (ADP w ATP)

• cykl Krebsa: sukcynylo-CoA w kwas bursztynowy (GDP w GTP)

• fermentacja octowa w żwaczu – acetylofosforan

→ poniżej mogą przyjmować reszty fosforanowe z ATP z udziałem fosfotransferaz (kinaz białkowych)

→ są niezbędne dla przebiegu określonych ciągów metabolicznych (glikoliza, cykl pentozofosforanowy), w procesach regulacyjnych; przy udziale hormonów białkowych i peptydowych

→ fosfageny – grupa związków bogatoenergetycznych stanowiących zapasową formę fosforanów bogatoenergetycznych (fosfokretyna występująca w mięśniach kręgowców i fosfoarginina występująca w mięśniach bezkręgowców). Funkcja:

• w warunkach fizjologicznych pozwalają utrzymać odpowiednie stężenie ATP w mięśniach w sytuacji, gdy jest ona szybko zużywana

• gdy jest dużo ATP to zwiększa się stężenie fosfagenów

Utleniania komórkowe:

→ usuwanie elektronów

→ głównym procesem zużywającym tlen jest oddychanie tkankowe (utlenianie tkankowe, komórowe), które można określić jako proces kontrolowanej reakcji wodoru z tlenem i tworzenia wody, w którym komórka uzyskuje energię w postaci ATP

→ usuwaniu elektronów zawsze towarzyszy redukcja biorcy elektronów

→ taka reguła utleniania i redukcji obowiązuje też w układach biologicznych i jest zasadniczym elementem pozwalającym zrozumieć istotę utlenień biologicznych (wiele utlenień może zachodzić bez udziału tlenu). Dotyczy to m. in. reakcji odwodorowania

→ w reakcjach obejmujących utlenianie i redukcję wymiana energii swobodnej jest proporcjonalna do skłonności związków reagujących do oddawania lub pobierania elektronów

→ dlatego oprócz wyrażania zmian energii swobodnej ΔG kJ/kcal możliwe jest również analogiczne wyrażenie ich liczbowo jako potencjał oksydoredukcyjny

→ na podstawie przedstawionych w tabeli wartości potencjałów oksydoredukcyjnych można przewidzieć kierunek przepływu elektronów z jednej pary oksydoredukcyjnej do drugiej

Bursztynian / α-ketoglutaran	-0,67
H^+ / H2	-0,42
NAD^+ / NADH	-0,32
Liponian / Dihydroliponian	-0,29
Acetooctan / β-hydroksymaślan	-0,27
Pirogronian / Mleczan	-0,19
Szczawiooctan / Jabłczan	-0,17
Flawoproteina – stary, żółty enzym utl/zred	-0,12
Fumaran / Bursztynian	+0,03
Cyt b; Fe^3+ / Fe^2+	+0,08
Ubichinion / Ubichinol	+0,1
Cyt c; Fe^3+ / Fe^2+	+0,22
Cyt a; Fe^3+ / Fe^2+	+0,29
Tlan / Woda	+0,82

Kluczowa rola ATP w przemianie materii:

→ transport

→ praca mechaniczna

→ energia świetlna

→ energia elektryczna

→ katabolizm

→ anabolizm

Enzymy uczestniczące w utlenianiu i redukcji (oksyreduktazy):

→ oksydazy – katalizują oderwanie wodorów z substratu w reakcji, w której tlen jest biorcą wodoru (oksydaza cytochromowa)

→ dehydrogenazy – przenoszą wodory z jednego substratu na drugi w sprzężonej reakcji oksydoredukcyjnej, współdziałające z NAD i FAD jako bezpośredni biorcy atomów wodoru, oraz reduktazy, gdzie NADP jest donorem wodoru (z wyjątkiem oksydazy cytochromowej wszystkie cytochromy są dehydrogenazami)

→ peroksydazy – używają H₂O₂ jako substratów

→ oksygenazy – katalizują bezpośrednie przeniesienie i przyłączenie tlenu do cząsteczki substratu.

Łańcuch oddechowy:

→ mitochondiurm określa się mianem siłowni komórki, bo wewnątrz tego organellum zachodzi wytwarzanie większości energii pochodzącej z utlenień biologicznych

→ mitochondrialny proces wytwarzania ATP, sprzężony z oddychaniem określa się mianem fosforylacji oksydacyjnej

→ umożliwia ona organizmom tlenowym związać znacznie większą część dostępnej energii swobodnej substratów oddechowych w porównaniu z organizmami beztlenowymi

→ cała energia, która jest uwalniana podczas utleniania kwasów tłuszczowych, aminokwasów, węglowodanów jest dostępna w postaci równoważników redukujących w obrębie mitochondrium

→ na wewnętrznej stronie błony znajdują się zespoły katalizatorów, w którego skład wchodzą enzymy i koenzymy nazywane łańcuchem oddechowym

→ łańcuch zbiera i przenosi równoważniki (wodory i elektrony) i kieruje je do ostatecznej reakcji z tlenem, gdzie powstaje woda

→ mitochondria także zawierają układ enzymatyczny gromadzący energię swobodną w postaci wysokoenergetycznego wiązania fosforanowego

→ główny szlak katabolizmu acetylo-CoA w organizmach żyjących w warunkach tlenowych to cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa)

Składniki łańcucha oddechowego:

→ kompleks 1 – reduktaza NADH-ubichinion – katalizuje przeniesienie elektronów i protonów z NADH na CoQ; zawiera 16 kompleksów białkowych Fe₂S₂ i Fe₄S₄

→ kompleks 2 – reduktaza bursztynian-ubichinion – przenosi wodór i elektrony z bursztynianu na CoQ; zawiera dehydrogenazę bursztynianową, FAD i białka typu Fe₄S₄

→ kompleks 3 – reduktaza ubichinon-cytochrom C – przenosi elektrony z CoQ na Cyt c; zawiera cytochromy oraz białka typu Fe₂S₂

→ kompleks 4 – oksydaza cytochromowa – końcowe ogniwo łańcucha oddechowego i katalizuje redukcję tlenu do 2 cząst wody (4e+4H⁺+O₂=2H₂O). Donorem elektronów jest cytochrom c; zbudowany jest z wielu podjednostek i zawiera 4

Kompleks 5 – synteza ATP. Po raz pierwszy gdy określono enzym ATP odkryto w nim aktywność liazy (zdolność hydrolizy ATP), enzym ten może syntetyzować ATP

→ składniki łańcucha ułożone są tak, że wzrasta potencjał. Łańcuch oddechowy katalizuje ciąg reakcji przebiegających od dehydrogenaz, które współdziałają z NAD przez flawoproteiny i cytochromy do tlenu cząsteczkowego. W łańcuchu znajduje się dodatkowy przenośnik – koenzym Q (ubichinion), stanowiący punkt zbiorczy dla równoważników redukujących pochodzących z innych substratów.

Do koenzymu Q transportowane są zarówno protony i elektrony, a dalej już tylko elektrony. Uwarunkowane jest to potencjałem składników łańcucha

Cytochrom c (w przestrzeni międzybłonowej) i oksydaza cytochromowa:

→ cytochromy są to białka hemowe przenoszące elektrony

→ wyróżniamy cytochromy a, b, c i d.

→ cytochromy a, b i c występują w mitochondriach zwierzęcych i roślinnych i odgrywają zasadniczą rolę w utlenianiu komórkowym

→ cytochrom a₁ jest cytochromem bakteryjnym i przenosi elektrony zarówno na tlen jak i na azotyny

→ cytochrom a₃ (składnik oksydazy cytochromowej) zawiera w swojej budowie 6 pierścieni hemowych i od 1 do 3 atomów miedzi

→ kompleks a i a₃ to duże białko o masie 200kD

→ cytochrom b₅ uczestniczy w procesie hydroksylacji, głównie w utlenianiu pozamitochondrialnym przy neutralizacji ksenobiotyków, a jego grupą prostetyczną jest sam hem

→ cytochrom c podobnie jak ubichinion (CoQ) nie stanowi części określonego kompleksu, jest tylko częścią pomocniczą, zawiera żelazo. Jest białkiem rozpuszczalnym w wodzie i jest on luźno związany z wewnętrzną błoną mitochondrialną. Można go spotkać w przestrzeni międzybłonowej

→ oksydaza cytochromowa (aa₃) – kompleks 4 łańcucha oddechowego, końcowe jego ogniwo i katalizuje redukcję tlenu do dwóch cząsteczek tlenu (reakcja czteroelektrodowa):

4e^- + 4H⁺ + O₂ -> 2H₂O

→ donorem elektronów w tej reakcji jest cytochrom c.

→ kompleks IV zbudowany jest z wielu podjednostek i zawiera cztery jednoelektrodowe grupy oksydoredukcyjne (2 hemy i 2 atomy miedzi)

Pompowanie protonów:

→ wszystkie kompleksy łańcucha (z wyjątkiem II) działają jak pompy protonowe

→ pompują protony wodorowe na zewnątrz błony wewnętrznej mitochondium

→ ma to znaczenie w procesie fosforylacji oksydacyjnej, czyli w procesie tworzenia ATP w mitochondriach

→ w przypadku kompleksu II standardowy potencjał redukcyjny dla przenoszenia elektronów z FADH₂ na ubichinion jest +0,113V – niższy niż w pozostałych kompleksach. Ta mała zmiana energii nie pozwala oksydoreduktazie bursztynian-ubichinion pompować protonów wewnętrzną błonę mitochondrialną. Nie wytwarza się gradient protonowy na błonie, który jest niezbędny do syntezy ATP. Wymagana różnica potencjałów to +0,16

Proponowane miejsca hamowania łańcucha – naturalne inhibitory łańcucha:

→ związki hamujące oksydoreduktazę NAD⁺ oraz ubichinion. Należą do nich: rotenon – substancja pochodzenia roślinnego, potężny insektocyd, stosowany przez niektórych Indian w Ameryce południowej jako trucizna dla ryb, amytal (antybiotyk zbudowany podobnie do ubichinionu działający na zasadzie kompetencji)

→ związki hamujące transport elektronów pomiędzy cytochromem b i c np. antymycyna – antybiotyk ze Streptomyces griseus

→ związki hamujące transport z oksydazy cytochromowej (a+a₃) na tlen np. cyjanki (KCN), azydki (N^3-), tlenek węgla – nawet jako składnik dymu papierosowego i innych skażeń powietrznych. Wiążą się one z grupami hemowymi i są niezwykle trujące (schemat)

Hipotezy mechanizmu syntezy ATP w komórce zwierzęcej:

→ enzymem odpowiedzialnym bezpośrednio za syntezę ATP w mitochondriach jest syntaza ATP. Jest to kompleks V łańcucha oddechowego (F₀-F₁, czynnik sprzęgający syntezę ATP z dyfuzją protonów). Nosi on też nazwę mitochondrialnej ATPazy (bo wykryto go najpierw na podstawie hydrolizy ATP, a później stwierdzono jego zdolność do fosforylowania ADP z ATP

→ hipoteza chemiczna – zakłada, że przepływ elektronów przez łańcuch oddechowy prowadzi do utworzenia wysokoenergetycznego substratu, który miałby służyć jako prekursor ATP. Miałoby to miejsce tylko wtedy, gdy zachodziłaby reakcja fosforylacji substratowej. Przypuszczano, że energia swobodna jest wychwytywana przez białka, które przejmują aktywność i są zdolne do syntezy ATP. Do chwili obecnej nie znaleziono takich białek

→ hipoteza chemioosmotyczna Mitchella –1961 – odmienny mechanizm, w którym transport elektronów i synteza ATP są sprzężone przez gradient protonowy, a nie przez intermedia wysokoenergetyczny. Przepływ elektronów przez łańcuch oddechowy powoduje jednoczesne przepompowywanie protonów na zewnątrz błony wewnętrznej (sprzęgającej) mitochondium (przez kompleksy I,III i IV). Stężenie protonów rośnie po stronie cytoplazmatycznej, która ładuje się dodatnio, a spada po przeciwstawnej wytworzonej w poprzek błony od gradientu stężenia protonów. Dodatkowo przepływ elektronów ładuje siła protonomotoryczna, na którą składa się gradient pH i potencjał. <schemat z minakowskiego>!!! Siła zużywana jest do napędzania aktywności sytnetazy ATP, czyli łańcucha przez elektrony oddziaływuje z syntetazą ATP za pomocą potencjału błonowego.

Wytworzenie gradientu protonowego wymaga spełnienia co najmniej 3 warunków:

→ przenośniki elektronów oraz syntetazy ATP muszą być odpowiednio uorganizowane i wektorowo zorientowane względem obu powierzchni wewnętrznej błony mitochondrialnej. Wyjątek stanowi cyt c, który jest luźno związany z mitochondrium

→ nieprzepuszczalność błony wewnętrznej mitochondrialnej dla protonów

→ zamknięcie błoną określonego przedziału komórki

→ podstawowy procesem umożliwiającym wychwytywanie i zachowanie energii podczas utleniania komórkowego jest przepływ protonów w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej. W miarę przepływu elektronów i na początku łańcucha proton z NADH do tlenu przez łańcuch oddechowy w 3 miejscach: kompleks I, III, IV , następuje pompowanie protonów w poprzek błony gradientu protonu wytwarzającym w każdym z 3 miejsc w skutek przepływu pary elektronów z 1 cząst NADH jest wykorzystywany do syntezy 1 cząst ATP. Utlenieniu 1 cząst NADH towarzyszy uformowanie się gradientu protonowego na wszystkich 3 wymienionych obszarach i syntetyzowania 3 cząst ATP

WYKŁAD 13

Regulacja przebiegu łańcucha oddechowego:

→ intensywność i tempo wytwarzania ATP w komórkach zwierzęcych uzależnione jest od potrzeb energetycznych komórki

→ jeżeli procesy życiowe zachodzą intensywnie wówczas metabolizm skierowany jest na drogę katabolizmu, czyli degradacji związków z wytworzeniem ATP

→ jeżeli komórka jest w stanie spoczynku wówczas odkładane są substancje zapasowe w postaci węglowodanów, lipidów i białek

→ kolejność zużywania składników pokarmowych jest następująca: w pierwszej kolejności zużywane są węglowodany, jeśli ich brak, metabolizowane są lipidy, a gdy brak dwóch poprzednich metabolizowane są białka

→ wyznacznikiem stanu energetycznego komórki i co za tym idzie wyznacznikiem tempa łańcucha oddechowego jest ładunek energetyczny komórki, który mówi o zależności reakcji wytwarzających i zużywających ATP

→ w warunkach fizjologicznych ten ładunek wynosi ok. 0,8. Wartości poniżej 0,8 świadczą o procesach degradacyjnych, komórka zamiera. Powyżej 0,8 świadczą o zaburzeniach procesów metabolicznych

→ im więcej ATP w komórce, tym mniejsze procesy kataboliczne

→ ładunek elektryczny = $\frac{0,5\left\lbrack \text{ADP} \right\rbrack + \ \lbrack ATP\rbrack}{\left\lbrack \text{AMP} \right\rbrack + \ \left\lbrack \text{ADP} \right\rbrack + \ \lbrack ATP\rbrack}$

→ zależność reakcji generujących ATP i reakcji zużywających ATP od ładunku elektrycznego komórki w układzie ATP

Zmiana energii w układzie ATP

--- zużycie ATP

- generacja ATP

Kontrola cyklu oddychania:

→ są 2 rodzaje reakcji: sprzęgające (prowadzące do wytworzenia ATP) występujące wówczas, gdy komórka wymaga ATP:

• sprzęganie działania dehydrogenaz m.in. w cyklu Krebsa, β-oksydacji z łańcuchem oddechowym, ponieważ dehydrogenazy dostarczają protonów wodorowych na łańcuch oddechowy

• sprzęganie – proces transportu protonów i elektronów w łańcuchu z syntezą ATP

→ reakcje rozprzęgające (prowadzące do degradacji ATP). Rozprzęganie następuje poprzez inhibitory łańcucha jak również wytwarzanie ciepła

Utlenianie pozamitochondrialne:

→ oprócz utleniania prowadzącego do fosforylacji oksydacyjnej i syntezy energii, w komórkach zachodzą liczne reakcje oksydoredukcyjne poza mitochondrium powodujące utlenianie substratów w obecności tlenu cząsteczkowego

→ reakcje te przebiegają m. in. z udziałem takich enzymów jak: oksygenazy, hydroksylazy, katalazy, peroksydazy i inne (z klasy oksydoreduktaz)

→ przemiany z udziałem tych enzymów nie są związane z syntezą energii w komórce, a raczej z syntezą lub degradacją różnego rodzaju związków

→ oprócz mitochondriów, także błony retikulum endoplazmatycznego zawierają łańcuch transportu elektronów

→ podczas homogenizacji komórek i tkanek dochodzi do rozerwania błony retikulum i utworzenia frakcji mikrosomalnej

→ frakcja ta zawiera głównie mieszaninę gładkiego i szorstkiego retikulum – są to błony połączone z rybosomami ale również frakcja zawiera wolne rybosomy. Dlatego enzymy zawarte w błonach retikulum nazywamy enzymami mikrosomalnymi

→ głównym enzymem jest cytochrom b₅, jest składnikiem transportu elektronów złożonego z flawoproteiny i desaturazy acylo-CoA. Elektrony pochodzą z NADH

→ układ ten katalizuje wprowadzenie podwójnego wiązania do łańcucha kwasu tłuszczowego – dochodzi do tzw. peroksydacji

→ inne enzymy to: monooksygenazy (hydroksylazy) i te układy monooksygenaz zawierają cytochrom P-450, który bierze udział m. in. w procesach hydroksylacji

→ kilka przykładów reakcji:

• 2,3-dioksygenaza tryptofanowa. Żelazoproteina i zarazem miedzioproteina, która katalizuje reakcję rozerwania pierścienia indolowego tryptofanu z wytworzeniem N-formylokinureniny. Jest to reakcja zapoczątkowująca przemianę tryptofanu do kwasu nikotynowego, a następnie przez amid tego kwasu (amid kwasu nikotynowego) powstają nukleotydy NAD i NADP – fosforan tego nukleotydu (koenzymy enzymów z klasy oksydoreduktaz szczególnie dehydrogenaz). NAD bierze udział w utlenieniu acetylo-CoA, cyklu Krebsa, utlenianiu kwasów tłuszczowych i jest dawcą protonów, elektronów wodorowych na łańcuch oddechowy

  

• 4-monooksygenaza fenyloalaninowa – katalizuje przemianę fenyloalaniny w tyrozynę zapoczątkowując syntezę amin biogennych katecholowych takich jak DOPA, norepinefryna, adrenalina, noradrenalina, dopamina. Brak tego enzymu jest przyczyną fenyloketonurii. Hydroksylacja przy udziale monooksygenaz to wprowadzenie atomu tlenu pomiędzy atom wodoru i węgla z wytworzeniem grupy OH

Cyt p-450:

→ układ występuje w mikrosomach wątroby

→ źródłem elektronów do redukcji cytochromu są NADH i NADPH

→ z kolei cytochromy utleniane są przez substraty w wieloetapowym procesie zwanym cyklem hydroksylującym

→ zadaniem cytochromu p-450 jest związanie tlenu a także zaktywowanie go przez przeniesienie elektronów tak aby substrat uległ hydroksylacji

→ substratami są zazwyczaj steroidy

→ cytochrom ma w swojej budowie żelazo

Przebieg hydroksylacji:

→ mechanizm hydroksylacji na cyt p-450 rozpoczyna się od przyłączenia substratu (najczęściej steroid) do centrum aktywnego enzymu

→ po związaniu elektronów, którego dawcą może być NADH lub NADPH żelazo hemowe na +3 stopniu utlenienia (Fe³⁺) staje się bardziej reaktywne i wiąże tlen cząsteczkowy

→ kompleks Fe²⁺ i O₂ wiąże następny elektron przechodząc w bardzo reaktywny anionorodnik ponadtlenkowy, który rozpada się następnie z wytworzeniem cząsteczki wody i rodnika hydroksylowego przyłączonego do substratu

→ żelazo hemowe wraca na +3 stopień utleniania aby mógł wziąć udział w następnym cyklu hydroksylacyjnym

Funkcja cyt p-450:

→ jedną z zasadniczych biochemicznych funkcji cytochromu P-450 jest udział w przebiegającej w nadnerczu przemianie cholesterolu w hormony steroidowe. Przemiana ta polega m.in. na wielokrotnej hydroksylacji substratów

→ odrębną funkcją cytochromu P-450 frakcji mikrosomalnej, szczególnie wątroby, jest udział w usuwaniu substancji toksycznych, obcych dla organizmu (ksenobiotyków), do których należą leki, pestycydy, kancerogenne węglowodory aromatyczne np. benzopiren

Ksenobiotyk:

→ z gr. ksenos – obcy i bioticos

→ związek chemiczny występujący w organizmie, który ani go nie produkuje, ani też w normalnych warunkach nie przyjmuje z pożywieniem

→ definicja ta obejmuje substancje obce dla organizmu docelowego. Określa się nią większość trucizn i leków

→ ważną grupę ksenobiotyków stanowią związki chemiczne otrzymane przez człowieka, o strukturze chemicznej niewystępującej w przyrodzie, do których organizmy nie przystosowały się na drodze wcześniejszej ewolucji:

• leki (np. niektóre antybiotyki)

• trucizny (np. dioksyna)

• pestycydy

Główne mechanizmy działania antybiotyków:

→ zakłócenie syntezy ściany komórkowej bakterii (penicylina)

→ upośledzenie przepuszczalności błony komórkowej bakterii (gramicydyna)

→ zakłócanie syntezy kwasów nukleinowych:

• hamowanie biosyntezy folianów niezbędnych do syntezy DNA

• hamowanie na różnych etapach (trimetoprim)

• hamowanie działania topoizomeraz (ciprofloksacyna)

→ zakłócanie syntezy białek (streptomycyna)

Dioksyny

→ pochodne oksantrenu

→ składają się z dwóch pierścieni benzenowych połączonych przez dwa atomy tlenu oraz są wysycone 1 do 8 atomami chloru, które są przyłączane w różnych pozycjach

→ są to jedne z najbardziej toksycznych związków otrzymanych w wyniku syntezy

→ w śladowych ilościach wydzielane są przy spalaniu drewna (uwaga przy kominkach !) np. TCDD

Fazy metabolizmu ksenobiotyków:

→ I - utlenianie, redukcja, hydroliza – wytworzenie związków pośrednich w procesach utleniania, redukcji i hydrolizy, powstają wówczas związki bardziej polarne, lepiej rozpuszczalne w wodzie, dzięki czemu łatwiej wydalane są z organizmu. Bierze tu udział cytochrom P-450

→ II - reakcje sprzęgania – produkty końcowe, które są sprzęgane z kwasem glukuronowym, siarkowym, glutationem, glicyną, bądź ulegają acetylacji lub metylacji

→ reakcje pierwszej fazy biotransformacji ksenobiotyków zachodzą przede wszystkim dzięki enzymom z klasy oksydoreduktaz i hydrolaz

→ enzymami drugiej fazy są transferazy katalizujące reakcje sprzęgania np . UDP, glukuronylotransferaza (w mikrosomach), enzymy cytozolowe (s-transferaza glutationowa, sulfotransferaza). Najważniejszą grupę stanowią monooksygenazy. Substratami dla monooksygenaz są przede wszystkim steroidy i kwasy tłuszczowe. Oprócz tego jeszcze hydrolazy; oksydazy pomieszanych funkcji. Enzymy tworzą grupę hydroksylową (wprowadzają tlen między C i H)

Reaktywne formy tlenu:

→ niektóre reaktywne formy tlenu mogą być toksyczne dla organizmu

→ do niedawna wydawało się że najbardziej toksyczny jest nadtlenek wodoru, ale jego toksyczność związana jest z jego przemianą w ponadtlenek (wolny anionorodnik ponadtlenkowy). Wolny anionorodnik ponadtlenkowy powstaje z tlenu cząsteczkowego podczas jednoelektronowych utlenień w łańcuchu oddechowym. Ponadtlenki wytwarzane są w erytrocytach w wyniku autooksydacji (samoutlenienia) hemoglobiny do methemoglobiny

→ w tworzenie różnych reaktywnych form tlenu zaangażowane są cytochrom P-450 i oksydaza ksantynowa

→ natomiast w neutralizację ponadtlenku zaangażowana jest dysmutaza ponadtlenkowa. Rolą tego enzymu jest ochrona organizmu przed wpływem reaktywnych form tlenu

→ dysmutaza cytoplazmatyczna posiada w swej budowie po 1 at. Cu i Zn

→ dysmutaza mitochondrialna posiada dodatkowo mangan

→ jony dwuwartościowe biorą udział zarówno w wiązaniu substratu jak również w przenoszeniu elektronów

→ innym enzymem chroniącym organizm przed wpływem reaktywnych form tlenu jest katalaza. Przekształca ona nadtlenek wodoru do wody i tlenu

→ reakcje enzymatyczne dysmutazy anionu nadtlenku zachodzi:

• w I etapie anion jest utleniany a Cu²⁺ ulega redukcji i jest Cu⁺

Enzym-Cu²⁺ + O₂^- -> enzym-Cu⁺ + O₂

• w II etapie anion jest redukowany, a utleniany jest atom Cu

Enzym-Cu⁺ + O₂^- -> enzym-Cu²⁺ + H₂O₂

• ponieważ H₂O₂ jest toksyczny to w reakcję wchodzi katalaza

2H₂O₂ -> H₂O + O₂

1 – dysmutaza

2 – katalaza