DNA - wielkocząsteczkowy nukleotyd złożony z reszt nukleozydofosforanowych. Nukleozydy składają się z zasad azotowych i cukrów ( w przypadku DNA zasady azotowe: adenina, cytozyna, guanina, tymina). Wolno występująca dezoksyryboza (pentoza), która przy C2 posiada dwa atomy H, nie posiada grup hydroksylowych. Czyli elementem struktury DNA są nukleozydomonofosforany. Są one związane wiązaniem fosfodiestrowym pomiędzy C 3' deoksyrybozy a grupą hydroksylową przy C 5' deoksyrybozy sąsiedniego nukleotydu. Zależnie od gatunku zwierząt, a także zależnie , czy DNA pochodzi z bakterii lub wirusów (prokariotów), posiada różną ilość nukleotydów w cząsteczce. I tak - ilość nukleotydów w DNA wirusowym jest rzędu 103 par nukleotydów, u bakterii - 106 par zasad, a u ssaków - 109 par zasad.
Spiralla DNA - podwójna, prawoskrętna (α - heliks) - główna forma, są jeszcze dwie.
Ilość nukleotydów jest równa wielkości cząsteczki , Długość cząsteczki DNA u wirusów jest rzędu μm, u bakterii - rzędu setek μm (np. e. Colli = 260 μm), podczas gdy DNA wirusowe wirusa SV40 wynosi 17μm. U człowieka długość DNA - 2m. Jest to cząsteczka bardzo długa, złożona z 2 łańcuchów. Jest bardzo upakowana, w połączeniu z białkami tworzy chromatynę.
[RYCINA]
Podwójna spiralla DNA wytwarza się dlatego, że nukleotydy wiążą się wiązaniami wodorowymi (A=T, C≡G).
[RYCINA]
Zasady azotowe znajdują się wewnątrz spiralli, a cukry i reszty fosforanowe - na zewnątrz. Ponieważ reszty fosforanowe są zjonizowane, DNA ma ładunek ujemny i może przez to wiązać się z dodatnio naładowanymi białkami (histonami) tworząc chromatynę.
Związanie cząsteczki DNA z białkami histonowymi tworzy specyficzne struktury - nukleosomy. Zawierają 4 klasy histonów: H2A, H2B, H3, H4, H1 nie wchodzi w skład nukleosomów. Białka histonowe ulegają licznym modyfikacjom kowalencyjnym - fosforylacja, ADP rybozylacja (do białek przyłącza się aktywowana przez ATP ryboza), acetylacja. Histon H2A jest związany kowalencyjnie z białkiem - ubikwityną. Ubikwityna (jej nazwa pochodzi od tego, że występuje ona we wszystkich komórkach) bierze udział w degradacji białek - system zależny od energii, występuje w cytozolu - proteazy uczestniczące w tym procesie tworzą proteasomy, zaznaczają białko do degradacji.
W skład nukleosomów wchodzibiałko - nukleoplazmina. Opisano 3 formy molekularne DNA - B, A oraz Z. Forma B i A - prawoskrętna, forma Z - lewoskrętna. Różnią się one znacznie, średnicą (1 Amstryll = 0,1 nm); średnica B - 20 amstremów. Nukleotydy (zasady)ułożone są nad sobą, ale każda jest obrócona pod kątem 36° (na 1 obrót - 10 zasad). W strukturze formy B możemy wyróżnić rowek większy i rowek mniejszy (głębokość - 34 amstremy). Rowek większy - szeroki i głęboki, rowek mniejszy - wąski i też głęboki). Forma A różni się od B tym, że jest bardziej upakowana, na 1 obrót - 11 zasad - zasady te są skręcone pod kątem 33°, zawiera rowki większe (głęboki i wąski) i mniejsze (płytki i szeroki).
W formie A środek cząsteczki pozostaje wolny, tam mogą gromadzić się cząsteczki wody, część obwodowa - równomiernie wypełniona. Forma B - upakowana.
Forma Z DNA - lewoskrętna, średnica - 18 amstremów (najcieńsza nić), natomiast na 1 skręt przypada 12 zasad (o 2 więcej niż w B). Rowek większy jest płaski, mniejszy - płytki i głęboki (obserwujemy tylko rowek mniejszy).
Znaczenie tych struktur - rowki stanowią miejsce wiązania białek w procesie replikacji i transkrypcji DNA - wiązanie białek zależne od kolejności nukleotydów w obszarze tworzącym rowek. Natomiast w obszarze, w którym nie ma rowków, białka nie są wiązane.
Białka wiążące się: receptory hormonów (głównie steroidowych - płciowe męskie - androgeny, płciowe żeńskie - estrogeny, progesteron, glukokortykosteroidy, mineralokortykosteroidy - kontrolują gospodarkę Ca2+, hormone które powstają w wyniku hydroksylacji witaminy D3 w skórze, hormony tarczycy), izoprenoidy, pochodne karotenu (retinol, kwas retinoiowy.
Sekwencje, z którymi wiążą się te hormony to „elementy odpowiedzi”. Z nimi wiążą się także białka aktywowane w odpowiedzi na estrogeny środowiskowe i ksenobiotyki (niektóre leki).
Prokariotyczny DNA - kolisty
[RYCINA]
Występuje w 3 postaciach:
forma rozluźniona
forma ściśnięta
forma supracoiled, przypominająca 8, liczba skrętów może być większa - i wtedy cząsteczka ta jest jeszcze bardziej upakowana.
[Ryc. 1]
„O” - origin - decyduje o początku replikacji , „T” - kończące replikację - przyłączają się tu specyficzne białka. U prokariotów replikacja odbywa się w obu kierunkach, równocześnie w obu niciach DNA. W wyniku replikacji z komórki macierzystej powstają 2 komórki potomne o tej samej sekwencji.
U prokariotów występuje 1 miejsce inicjacji replikacji (ori), natomiast u eukariotów (np. człowiek) bardzo wiele miejsc replikacji - sekwencje ARS (sekwencje replikujące się autonomicznie_.
Replikacja rozpoczyna się jednocześnie w wielu miejscach - powstaje druga nić o tej samej sekwencji.
[Ryc. 2]
W mitochondriach występuje DNA podobne do bakterii. Przebieg replikacji DNA jądrowego nie jest poznany dokładnie - dlatego tłumaczymy na przykładzie DNA prokariotycznego.
[Ryc. 3]
Sekwencje ori C - początkowe. W ramach tego miejsca występuje 13 odcinków DNA o identycznej sekwencji, zapoczątkowana tą samą obecnością nukleotydów. Oprócz tych 13 sekwencji występuje także 9 identycznych sekwencji - stanowią one miejsce wiązania białka - DnaA.
Przyłączenie DnaA do odcinków zawierających 9 nukleotydów powoduje zminy strukturalne DNA, następnie przyłączają się kolejne cząsteczki - w sumie około 40 i powstaje kompleks inicjujący (I etap replikacji). Kompleks I składa się z DNA (matryca i 20 - 30 cząsteczek białek DnaA. Kolejny etap stanowi lokalne rozłączenie obu nici z wytworzeniem oczka replikacyjnego. W dalszej kolejności przyłącza się białko DnaB - występuje w formie heksameru - 6 cząsteczek. DnaB wiąże się ze sobą i ten heksamer łączy się z drugim heksamerem - DnaC. Przyłączenie ich wymaga energii i DnaT. Tworzy się kompleks otwarty (II etap replikacji., DnaB posiada aktywność helikazy DNA - rozplatanie nico.
Kolejny etap - związanie białek z jednoniciowym DNA - SSB. Bańka replikacyjna powiększa się, tworzą się widełki replikacyjne (wygląd widelca). Do widełek przyłącza się kompleks 2 białek - prymaza oraz PriA. Występują one w kompleksie priB i priC. Kompleks ten ulega dysopcjacji i priA z primazą łączą się po obu stronach. Kompleks primaza + dnaB tworzy primosom. Tworzeniu primosomu towarzyszy odłączenie DnaA od cząsteczki DNA.
Kolejny etap - przyłączenie starterów. Na jednej z nici DNA - prowadzącej przyłącza się tylko 1 starter, natomiast na nici komplementarnej (opóźnionej) przyłącza się wiele starterów. Startery - cząsteczki RNA o długości około 10 nukleotydów (krótkie odcinki RNA.
Kolejny etap - polimeraza III. Kompleks polimeraza I i DNA - ligazy oraz 2 białek przyłącza się przed widełkami replikacyjnymi - topoizomerazy I i II - gieraza.
Dwie podjednostki polimerazy III tworzą klamrę oplatającą 1 nić cząsteczki DNA - z każdą z nici łączy się dimer podjednostki polimerazy III.
Ta podjednostka - dnaN - jest to białko o dużym ciężarze cząsteczkowym, które posiada też funkcje naprawcze i nukleacyjne - nukleazy 3' i 5'. Polimeraza I, która występuje w kompleksie z ligazą DNA oprócz funkcji polimeryzacyjnej, ma też funkcję egzonukleazy 3' 5' oraz 5' 3'. Spełnia rolę w syntezie i usuwaniu starterów oraz pełni funkcję naprawy DNA.
Funkcja polimerazy II nie została wyjaśniona.
Funkcja poszczególnych białek w replisomie
W tym kompleksie występują: helikaza, prymaza oraz priA, a także podjednostka β polimerazy DNA I, a także białka wiążące się z 1 - niciowym DNA,
- Funkcja helikazy - rozplatanie podwójnej spiralli. Wymaga to energii - ATP.
- PriA - usuwanie białek wiążących się z jednoniciowym DNA (sB)
- Podjednostka β - dodawanie nukleotydów do startera
- Prymaza syntetyzuje sterter - primer
- Polimeraza I - usuwanie primera
Część nukleotydów dobudowywana do startera - fragmenty Okazaki - wydłuża się on do momentu, gdy 2 fragmenty Okazaki zetkną się. Następnie polimeraza I usuwa nukleotydy primera i w ich miejsce dodaje deoksynukleotydy. Połączenie dwóch fragmentów Okazaki następuje dzięki DNA - ligazie. Łączy ona oba fragmenty - z grupą - OH 3' jednej i z wolną grupą przy 5' dezoksyrybozy. Połączenie wymaga ATP lub NAD (u eukariotów wyłącznie NAD).
W 1 etapie - ligaza jest adenylowana z ATP enzym (AMP i nieorganiczny monofosforan). Adenylacja na lizynie, która występuje w cząsteczce DNA - ligazy. Adenylowany enzym przekazuje AMP na 5'DNA - powstaje adenylowany 5' - staje się bardziej reaktywny. I ten reaktywny 5' reaguje z 3' wiązanie fosfodiestrowe i połączenie.
Funkcja DNA - ligazy - połączenie 2 fragmentów Okazaki pozbawionych nukleotydów.
[Ryc. 5]
W replikacji uczestniczą też topoizomerazy I i II.
Topoizomeraza I zapobiega tworzeniu się bardzo gęstych skrętów DNA.
[Ryc. 6]
Pierwszym etapem - połączenie z cząsteczką DNA, potem - przecięcie jednej z nici, następnie rotacja wolnego końca 3' wokół osi, po czym - ligacja (utworzenie wiązań fosfodiestrowych) i odłączenie cząsteczki.
Inhibitorem jest camptotecyna - np. w zakażeniach bakteryjnych.
Topoizomeraza II - przerywa obie nici. Jest to dimer złożony z 2 podjednostek A i B. Jej działanie wymaga ATP. Działanie topoizomerazy II (gyrazy) - zamiana pozytywnej superhelisy na negatywną superhlisę. Umożliwia to prawidłowy przebieg replikacji. Inhibitory - leki przeciwbakteryjne.
[Ryc. 7]
Replikacja przebiega do momentu, gdy z jednej cząsteczki macierzystej powstają dwie potomne. Terminacja - proces aktywny, wymaga sekwencji terminujących - TA, TB, TC, TD - miejsce wiązania białek Tus.
[Ryc. 8]
W konsekwencji z 1 cząsteczki macierzystej powstają 2 cząsteczki potomne.
Replikacja jest półzachowawcza - połowa cząsteczki macierzystej pozostaje w cząstecze potomnej.
[Ryc. 9] - odkrycie DNA.