Biologia: Wykład II – Biotechnologie

1953 – poznanie struktury podwójnej helisty DNA (Jd Watson, FHC Crick)

1961? Złamanie kodu genetycznego (Khorana, Nierenberg)

1973 – opracowanie techniki rekombinacji DNA

• 1960’ – Arber – enzymy restrykcyjne

• 1971 – Cohen – import plazmidów do E. Coli

Enzymy restrykcyjne – nożyczki molekularne
plasmid bakteryjny, nukleoid,

Klonowanie genu:
potrzebne składniki

1. Sekwencja DNA, którą mamy sklonować i bakteryjny plazmid DNA

2. Wycinanie obu fragmentów enzymami restrykcyjnymi

3. Sklejanie obu fragmentów ligazą

4. Otrzymujemy zrekombinowaną cząsteczkę DNA

5. Tą cząsteczkę wprowadzamy do komórki bakteryjnej (implantacja)

6. Zrekombinowany DNA jest kopiowany do hodowli bakterii podczas podziałów komórkowych

7. Z bakterii izoluje się liczne kopie zrekombinowanego plazmidu

1973 – kongres w New Hampshire poświęcony kwasom nukleinowym

1974 – ‘moratorium’ – list otwarty skierowany do naukowców na całym świecie, apel z prośbą o zawieszenie badań nad kwasami nukleinowymi

1975 – sekwencjonowanie DNA (poznanie kolejności nukleotydów w cząsteczce)

1. Metoda Maxarna-Gilberta – metoda chemicznej degradacji DNA

2. Metoda Sangera – metoda dideoksy (tą metodą sekwencjonowano geny u człowieka)

ETAP I – 1953 – 1972 – około 3 tysięcy badaczy

ETAP III – od 1973 – około 300 tysięcy badaczy

^to skutkowało pojawieniem się przemysłu – biotechnologia

Biotechnologia oznacza zastosowanie technologiczne, które używa systemów biologicznych, organizmów żywych lub ich składników, żeby wytwarzać lub modyfikować produkty lub procesy w określonym zastosowaniu.

Pierwszy produkt biotechnologiczny – insulina

1. Leczenie cukrzycy (wcześniej były insuliny świńskie, bydlęcą – nie są do końca tożsame z org ludzkim, pojawiały się reakcje uboczne)

2. Problem z intronami – u człowieka w pierwszym momencie gdy powstaje transkrypt to pierwszym produktem jest pre-mRNA – dojrzewanie polega na eliminowaniu eksonów, u bakterii nie ma eksonów i intronów

   1. Chemiczna synteza sekwencji kodującej jako rozwiązanie problemu dojrzewania mRNA

   2. Drugim pomysłem była odwrotna transkrypcja

Złamanie centralnego dogmatu przepływu informacji genetycznej:

DNA – transkrypcja -> RNA – translacja -> białka

Łatwiejszy pomysł:
ODWROTNA TRAKRYPCJA: dojrzały mRNA insuliny -> cDNA
INSERCJA cDNA DO PLAZMIDU
WPROWADZENIE PLAZMIDU DO BAKTERII

W bakterii TRANSKRYPCJA,mRNA, TRANSLACJA

Ludzki hormon wzrostu hGH

1. Leczenie karłowatości - 1959 (w związku z użyciem hGH trupiego pojawiała się choroba Creutzfelda-Jakoba)

2. 1985

Rodzaje biotechnologii:

1. Zielona – rolnictwo, wykorzystanie spożywcze i niespożywcze (np. pasze dla zwierząt, biopaliwa)

2. Czerwona – służba zdrowia

3. Biała – produkcja przemysłowa, ochrona środowiska (rośliny transgeniczne, które mogą np. kumulować metale ciezkie=

4. Fioletowa – zagadnienia społeczne i prawne

5. Niebieska – biotechnologia wód

ORGANIZMY GENETYCZNIE MODYFIKOWANE GMO

GMO - Organizm niosący obcy gen, w normalnych warunkach nie występujący w tym gatunku, pochodzący od organizmu odległego filogenetycznie

Metody uzyskiwania GMO:

1. Transfekcja z użyciem zrekombinowanych wektorów

2. Biblistyka

3. Mikroiniekcja do przedjądrza

4. Użycie pierwotnych komórek zarodkowych

5. Klonowanie somatyczne

Początki :

a) bakterie glebowe Agrobacerium tumefaciens – dostarczyciel genu
Ze swojego plazmidu Ti (ich specyficzna nazwa) wycinają fragment swego DNA, opakowują w białkową otoczkę i przesyłają do komórki roślinnej, w kom. Roślinnej DNA jest rozpakowane i włączane w genom rośliny) – technika ta jest wykorzystywana ciągle ale nie wszystkie rosłiny są podatne na zarażenia

b) strzelba genowa (gene gun) – nabojami są kulki z metali szlachetnych np. złoto lub wolfram i DNA osadza się na powierzchni, następnie są wstrzeliwane w tkanki, umożliwia zmianę plastydów, a bakterie nie

c) mikroiniekcja do przedjądrza (tuż po zapłodnieniu kom jajowej przez plemnik przez pewien czas przedjądrza są nie połączone) – przedjądrze męskie, przemądrze męskie – mikroiniekcja jest dokonywana za pomocą mikropipety.

d) użycie pierwotnych komórek zarodkowych (pokolenie himeryczne – spr termin)

e) klonowanie somatyczne – z zapłodnionej kom jajowej usuwa się jądro kom i zastępuje się je jądrem komórkowym innej komórki (owca Dolly – w chwili urodzenia się miała biologicznie 6 lat, tyle co dawczyni, zyła 6 lat, a normalna owca żyje ok. 12 lat)

ŻYWNOŚĆ MODYFIKOWANA GENETYCZNIE

1. Odporność na szkodniki – w związku z użyciem toksyny Bt, szkodliwej dla zwierząt, ale nie człowieka - założono, że spróbuje się użyc coś innego, używając Bacillus thuringiensis która produkuje toksyny Bt i użyto je przeciwko szkodnikom i wyeliminowano

   1. Kukurydza Bt, ziemniak Bt, bawełka Bt, soja Bt itd. – kukurydza jest odporna na szkodnika Omacnica prosowianka

2. Poprawa cech jakościowych

   1. Pomidor Flavr Savr

      1. Pierwszy produkt biotechnologiczny wprowadzony na rynek – 1994

      2. Poligalakturonaza (PG) – dojrzewanie pomidorów – gen pG o odwrotnej orientacji – samoczynne opóźnienie dojrzewania pomidorów tzn. pomidor robi się czerwony, dojrzewa ale można go dowieźć twardego a nie miękkiego,a le spotkał się z negatywnym odbiorem bo był niesmaczny

   2. Zatrzymanie psucia się owoców: zahamowanie syntezy etylenu

   3. Otrzymanie kawy o zmniejszonej zawartości kofeiny – wyciszenie ekspresji syntazy teobrominowej

   4. Złoty ryż – rozwiązanie na problem niedoboru witaminy A w diecie (Azja) – wprowadzono gen żonkila – synteza beta-karotenu (prowitamina A) – złota barwa jako efekt uboczny

3. Odporność na herbicydy (środki ochrony roślin)

   1. Rośliny „Roundup Ready” – glifosat (subst aktywna – hamuje w roślinach syntezę aminokwasów aromatycznych)

      1. gen EPSPS – synteza enolopirogranianoszikimiano-3-fosforanu xD

      2. Gen GAT –N-acetylotrasferaza glifosatu

      3. Gen GOX – okxydoreduktaza glifosatu

4. Szczepionki dostarczane drogą pokarmową

   1. Mobilizacja układu odpornościowego bez kontaktu z patogenem (10-100 krotnie mniejsze koszty produkcji szczepionki)

5. Odporność na mróz, wysoką temperaturę, zasolenie, suszę, zanieczyszczenie środowiska, głownie metalami ciężkimi

ZWIERZĘTA MODYFIKOWANE GENETYCZNIE

1. Naukowe wykorzystanie zwierząt GM

   1. Modele chorób człowieka –

   2. Modele do testowania nowych metod leczenia

2. Zmiany jakościowe produktów zwierzęcych

   1. Wydajności jakość mleka – wprowadzenie genów białek β-κ-kazeiny

   2. Przyrost tuszy i polepszenie jakości mięsa

   3. Polepszenie trawienia i metabolizmu

   4. Szybsze rozmnażanie

   5. Zwiększenie odporności na choroby i pasożyty np. wirusa ptasiej grypy, priony

3. Zwierzęce bioreaktory

   1. Antytrombina – kontrola powstawania zakrzepów

   2. Antytrypsyna – rozedma płuc

   3. Erytropoetyna – anamia

4. Inne: Transgeniczne koty dla alergików – fluoryzujące rybki akwariowe

PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE (Mab)

Przeciwciała które wykazują jednakową swoistość względem danego epitopu. Otrzymuje się je przez fuzję limfocytów B o żadanej swoistości z komórkami szpiczaka

Immunizacja myszy -> po odpowiednim czasie mysz się uśmierca i pobiera się śledzionę i z niej kom plazmatyczne, potem łączy się je z komórkami szpiczaka (otrzymują nieśmiertelność) -> komórki hybrydowe -> rozpinetowanie do naczyń -> namnażanie

Komórki szpiczaka uszkadza się w taki sposób, żeby nie mogły produkować np. jakiegoś niezbędnego do życia enzymu

Komórki hybrydowe hoduje się w selektywnym płynie hodowlanym, który nie zawiera substancji będącej produktem uszkodzonego enzmu, płyn hodowlany nie może zawierać cytokin, które otrzymują przy życiu limfocyty B

Nazewnictwo przeciwciał (podobno ciekawostka)
Tu –przeciw guzom
Mo – mysie
Xi – chimeryczne
Zu – humanizowane
Mab – monoklonalne

Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych

1. Diagnostyka i terapia nowotworów

2. Immunosupresja w transplantologii

3. Immunosupresja w chorobach o podłożu zapalnym

4. Blokowanie krzepnięcia krwi

5. Neutralizacja toksyn

Immunotoksyny –przeciwciało sprzęga się z toksyną – lek jest dostarczany bezpośrednio tam gdzie potrzebne jest

Radioimmmunoterapia – przeciwciało sprzężone z izotopami radioaktywnymi

Problemy terapii z użyciem Mab

1. Rozpoznanie jako obce białko

2. Odpowiedź systemu immunologicznego – przeciwciała ludzkie (HAMA) przeciw mysim

   1. Przeciwciała chimeryczne – mysia jest tylko część zmienna przeciwciała (30-35%)

   2. Przeciwciała humanizowane – mysie regiony hiperzmienne przeciwciała (10%) (wyższa skuteczność)