1. Bezpośrednie (mikroskopowe) metody pomiaru liczby drobnoustrojów (liczenie w preparacie przyżyciowym i w komorze Thoma)Metody bezpośrednie polegają na bezpośrednim liczeniu komórek mikroorganizmów pod mikroskopem. Różnice sprowadzają się tylko do sposobu przygotowania próby i różnych metod przeliczania drobnoustrojów na jednostkę objętości.

• W komorze Thoma – Komora Thoma ma głębokość 0,1 mm, na jej dnie znajduje się siatka składająca się z 16 dużych kwadratów, które z kolei podzielone są na 16 małych. Na powierzchni komory Thoma wyżłobione są trzy kanaliki tworzące literę H. Badaną zawiesinę drobnoustrojów nanosi się na górną i dolna siatkę w centralnej części komory. Wyjściowa gęstość zawiesiny powinna wynosić od 10⁶ do 10⁷ komórek na 1 cm³; w przypadku wyższego stężenia należy zawiesinę rozcieńczyć. Liczbę komórek d.u. w 1 cm³ hodowli można obliczyć ze wzoru: L = 4 × 10⁶ × a × n gdzie a- średnia liczba komórek w małym kwadracie komory; n- rozcieńczenie hodowli.

• Liczenie drobnoustrojów w preparacie przyżyciowym (bezpośrednim) – polega na wykonaniu preparatu bezpośredniego tj. nanosi się 1 krople zawiesiny drobnoustrojów na powierzchnie szkiełka przedmiotowego i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym, a następnie liczy pod mikroskopem średnią liczbę komórek. Należy obliczyć powierzchnię pola widzenia mikroskopu (πr²) → aby wyznaczyć wartość promienia (r) należy zmierzyć średnice pola widzenia mikrometrem. Liczbę komórek d.u. w 1 cm³ hodowli (L) obliczamy wg wzoru:

$$L = \frac{1000}{\pi r^{2}h} \times a$$

gdzie: r –promień pola widzenia mikroskopu [mm]

a – średnia liczba komórek w polu widzenia

h = 0,01 mm (grubość warstwy cieczy między szkiełkami w preparacie)

1. Pośrednie (hodowlane) metody pomiaru liczby drobnoustrojów (metoda płytkowa, metoda rozcieńczeń) Metody pośrednie to takie które umożliwiają obserwację komórek które są zdolne do wzrostu. Metody wykorzystują pożywki płynne i stałe.

• Metoda płytkowa: Zasada metody polega na wysiewie odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny drobnoustrojów na pożywkę stałą, inkubacji i liczeniu wyrosłych kolonii. Wyniki otrzymane przy stosowaniu metody płytkowej są zawsze niższe niż rzeczywiste, ponieważ liczy się na płytkach tylko kolonie tych drobnoustrojów które są zdolne do wzrostu w stosowanej pożywce i w danych warunkach.

• Metoda rozcieńczeń – (metoda seryjnych rozcieńczeń Listera) – zasada metody polega na wieloetapowym rozcieńczaniu badanej zawiesiny, tak aby w 1 cm³ znajdowała się 1 komórka. Z kolejnych rozcieńczeń wykonuje się posiewy do pożywek płynnych (po 1 cm³) w co najmniej dwóch powtórzeniach. Po inkubacji określa się ilość prób dodatnich tj. w których rosną drobnoustroje. Korzystając z tablic McCrady`ego ujmujących statystyczne ilości prób ze wzrostem drobnoustroju, rozcieńczeniem i ilością powtórzeń wylicza się w oparciu o rachunek prawdopodobieństwa NPL czyli najbardziej prawdopodobną liczbę drobnoustrojów w 1 cm³ badanej próby. Dokładność metody zależy od przygotowania właściwych rozcieńczeń i od ilości równoległych prób. Warunkiem jest przygotowanie takiego szeregu rozcieńczeń, aby w ostatnim nie były już obecne mikroorganizmy. Metoda ta jest czasochłonna i pracochłonna.

1. Modyfikacje metod hodowlanych pomiaru liczby drobnoustrojów ( petrifilmy, zestaw łopatkowy, filtracja membranowa)

• Petrifilmy są jałowymi plastykowymi płytkami zawierającymi gotowe pożywki przykryte folia polietylenową. Specjalny indykator dodany do pożywek zabarwia kolonie drobnoustrojów, przez co są one lepiej widoczne. Na płytkach są zaznaczone kwadraty o powierzchni 1 cm³ ułatwiające liczenie wyrosłych kolonii. Posiewu dokonuje się za pomocą pipety, nanosząc 1 cm³ badanej próbki lub jej rozcieńczenia na środek płytki, następnie przykrywa się folią i dociska specjalnym krążkiem w celu równomiernego rozprowadzeni próbki po całej powierzchni pożywki. Po inkubacji płytek w określonych warunkach liczy się wyrosłe kolonie

• Zestaw łopatkowy – jest to zestaw składający się z plastykowej łopatki pokrytej po obu stronach jednym, dwoma lub trzema pożywkami agarowymi, selektywnymi dla różnych grup mikroorganizmów. Łopatka jest umieszczona w przezroczystej fiolce zamkniętej zakręcanym korkiem. Pobieranie prób odbywa się poprzez zaszczepienie kontaktowe, czyli dociśnięcie powierzchni agarowej płytki do powierzchni np. do stołu, produktu. Po pobraniu prób, płytki należy umieścić w fiolce i inkubować w warunkach odpowiednich dla określonej grupy drobnoustrojów. Po inkubacji odczytuje się wynik przez porównanie wzrostu bakterii z wzorcami płytek o znanych liczbach kolonii. Za ich pomocą można określić ilość drobnoustrojów powyżej 10³ w 1 cm³ badanej próby.

• Metoda filtracji membranowej- jest stosowana do określenia ilości drobnoustrojów w środowiskach, przeważnie wodnych, w których ilość ich jest niewielka, poniżej 20-30 komórek w 1 cm³. Zasada tej metody polega na przesączeniu określonej objętości badanego płynu przez filtr membranowy. Filtracja odbywa się dzięki wytworzeniu podciśnienia w kolbie ssawkowej za pomocą pompki wodnej lub mechanicznej. Ilość cieczy przeznaczonej do filtracji dobiera się wg przewidywanej liczby mikroorganizmów w badanej próbie. Zatrzymane na filtrze drobnoustroje rozwijają się poprzez umieszczenie filtru na powierzchni płytki Petriego z pożywką agarową. Płytki inkubuje się w temperaturze optymalnej dla wzrostu danych drobnoustrojów w czasie 24-48h. Po inkubacji ilość kolonii, które wyrosły na powierzchni filtru, odpowiada liczbie drobnoustrojów znajdujących się w badanej objętości płynu. Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 cm³ badanej próby oblicza się wg wzoru:

$$L = \frac{A}{V}$$

gdzie: L – liczba drobnoustrojów w 1 cm³

A – liczba kolonii wyrosłych na filtrze

V – objętość sączonej próby (cm³)

1. Pomiar ilości biomasy drobnoustrojów (metoda wagowa i spektrofotometryczna)

• Metody wagowe są najczęściej stosowane dla określenia masy drobnoustrojów poprzez oznaczenie ciężaru świeżej lub suchej masy komórek. (opis- instrukcja str 11). Metody te są obarczone dużym błędem wynikającym z trudności oddzielenia komórek mikroorganizmów od odwirowanego płynu.

• Metody turbidymetryczne - polegaj na pomiarze ilości światła zaabsorbowanego przez zawiesinę drobnoustrojów. Do tego celu służą kolorymetry lub spektrofotometry w których mierzymy absorbancję odpowiednio rozcieńczonych prób przy określonej długości fali. Następnie korzystając z krzywej wzorcowej można odczytać wynik zawartości suchej masy w badanej próbie

1. Wady i zalety pośrednich i bezpośrednich metod pomiaru drobnoustrojów

Metody pośrednie	Metody bezpośrednie
Obserwujemy tylko żywe komórki – mówi nam to o aktywności Jednostki i skupiska liczymy jako jedno – wprowadzamy błąd Wzrost komórek, tylko tych którym pasuje skład podłoża Można regulować temperaturę i pH razem z pożywką	Prostsza metoda, krótsza analiza Obserwujemy komórki żywe i martwe Niedokładna Używana do określenia Komorek o dużych rozmiarach Namnożenie drobnoustrojów 10^5 Określenie morfologii

1. Wpływ wysokich temperatur na przeżywalność drobnoustrojów ( ciepłoopornośc drobnoustrojów)Temperatura powyżej j której nie zachodzi wzrost drobnoustrojów, zazwyczaj działa na nie zabójczo. Termiczna inaktywacja drobnoustrojów następuje po przekroczeniu maksymalnej temperatury wzrostu. Efekt ten jest uwarunkowany wieloma parametrami. Oprócz specyficznej ciepłooporności określonych gatunków drobnoustrojów i ich różnych stadiów morfologicznych, główne znaczenie mają wysokość temperatury i czas jej działania. Śmierć cieplną powoduje uszkodzenie błony cytoplazmatycznej , w skutek czego następuje wypływ aminokwasów, DNA, RNA, enzymów, co prowadzi do śmierci komórki.

Ciepłoopornośc jest to wrażliwość drobnoustrojów na działanie wysokich temperatur. Szczególnie oporne są przetrwalniki bakterii. Zgodnie z teorią kurczliwości warstwy korowej, mechanizm ciepłooporności polega na obkurczaniu i rozprężaniu się warstwy korowej która reguluje zawartość wody w protoplaście. Do czynników wpływających na cieplooopornośc d.u. należą:

• Wiek i stadium rozwoju;

• Skład chemiczny podłoża hodowlanego;

• Temperatury inkubacji

• Parametry fizyczne i chemiczne środowiska w którym komórki podlegają ogrzewaniu

Pasteryzacja: niszczy formy wegetatywne, pozostają przetrwalniki

Sterylizacja: Gina formy wegetatywne i przetrwalne

Tyndalizacja: giną formy wegetatywne i przetrwalne

1. Krzywa przeżycia drobnoustrojów; wyznaczanie czasu dziesięciokrotnej redukcji.

W czasie działania wysokich temperatur na drobnoustroje, śmierć komórek jednorodnej populacji opisywana jest najczęściej jako reakcja I rzędu. Oznacza to, że w stałej temperaturze obniżenie liczby drobnoustrojów zdolnych do przeżycia jest wykładniczą funkcją czasu. Nanosząc na układ współrzędnych w skali półlogarytmicznej doświadczalnie wyznaczoną zależność między czasem ogrzewania „t” a liczba przeżywających komórek „N”, otrzymuje się wykres przeżycia danej populacji. Z tej krzywej można odczytać liczbę przeżywających komórek w określonym czasie działania wysokiej temperatury.

Czas dziesięciokrotnej redukcji – jest to czas potrzebny do zabicia 90% populacji drobnoustrojów w danej temperaturze.

1. Krzywa czasu śmierci cieplnej (TDT); wyznaczenie współczynnika ciepłooporności

W określonej temperaturze wyższej od maksymalnej temperatury wzrostu, śmierć wszystkich osobników populacji danego gatunku występuje po tym samym czasie . Nanosząc na układ współrzędnych w skali półlogarytmicznej doświadczalnie wyznaczoną zależność między temperaturą a czasem dziesięciokrotnej redukcji D, otrzymuje się krzywa czasu śmierci cieplnej TDT. Z wykresu dla każdej z wybranych temperatur można odczytać odpowiednie wartości czasu decymalnej redukcji D.

Współczynnik ciepłooporności (z) – określa wzrost temperatury potrzebnej do 10-krotnego skrócenia czasu śmierci cieplnej.

1. Pojęcie antybiotyku; drobnoustroje wytwarzające antybiotyki

Antybiotyki – to drobnocząsteczkowe substancje naturalne zwykle pochodzenia drobnoustrojowego. Ich syntetyczne pochodne bądź analogi, które powodują zatrzymanie wzrostu lub rozmnażania komórek przez wybiorcze działanie w niskim stężeniu na struktury bądź procesy biologiczne.

Głównymi producentami są promieniowce z rodzaju Streptomyces. Specyficzna aktywność przeciwbakteryjna: erytromycyna, kanamycyna, streptomycyna. Aktywność przeciwgrzybowa: nystatyna, bleomycyna, aktynomycyna ( przeciwnowotworowe)

Producent: bakterie Bacillus (gram+ laseczki przetrwalnikujące): subtylizyna, polimycyna, gramicydyna

Producent: grzyby strzępkowe Penicillum – penicylina

1. Mechanizm działania antybiotyków na drobnoustroje

• Zakłócenie syntezy kwasów nukleinowych

• Zakłócenie syntezy białek

• Zakłócenie funkcji błon biologicznych (zmiana przepuszczalności błony, zmiana transportu jonów)

• Zakłócenie syntezy ściany komórkowej

• Zakłócenie procesów oddechowych lub energetycznych

1. Mechanizmy warunkujące oporność drobnoustrojów na antybiotyki

• Zmiana przepuszczalności błon biologicznych i zahamowanie transportu antybiotyków do wnętrza komórki

• Synteza związków rozkładających antybiotyki do postaci nieaktywnej

• Zmiana kierunku przebiegu szlaku metabolicznego

• Usuwanie antybiotyków z komórki z udziałem aktywnych białek

Rodzaje oporności:

- wrodzona ( warunkowana genami)

- nabyta ( najczęściej występująca, związana z mutacjami w obrębie genów)

- krzyżowa (oporność w stosunku do grupy związków o takiej samej strukturze chemicznej)

1. Metody określania wpływu antybiotyków na drobnoustroje. Wyznaczenie MIC

• Metoda krążkowo – dyfuzyjna – antybiotyk znajduje się na krążku i będzie dyfundował na podłoże.

• Metoda zawiesinowa – wykonuje się 10- krotne rozcieńczenia antybiotyku i wprowadza się do pożywki.

MIC – minimalne stężenie hamujące - stężenie antybiotyku powodujące zahamowanie wzrostu drobnoustrojów.

MCB – minimalne stężenie bójcze – minimalne stężenie antybiotyku które powoduje śmierć drobnoustrojów.

1. Definicja i cel dezynfekcji:

Dezynfekcja polega na inkubacji lub niszczeniu wszystkich form wegetatywnych drobnoustrojów zarówno chorobotwórczych jak i niechorobotwórczych za pomocą środków fizycznych lub chemicznych. Celem dezynfekcji jest obniżenie ilości drobnoustroju zgodnie z normami.

Na skuteczność działania dezynfektora mają wpływ:

• Rodzaj drobnoustroju

• Wyjściowa liczebność populacji

• Stadium rozwoju komórek

• Stężenie i czas działania środka dezynfekującego

• Czynniki środowiskowe: pH, temperatura, wilgotność, obecność zanieczyszczeń organicznych lub nieorganicznych

Preparaty dezynfekcyjne powinny cechować się:

• Dobrą skutecznością bójczą

• Brakiem wzbudzania mechanizmów oporności u drobnoustrojów

• Doskonałą zdolnością zwilżania powierzchni

• Szybkim działaniem i małym stężeniem użytkowym

• Stabilnością w postaci roztworów roboczych

• Brakiem toksyczności w stosunku do ludzi i zwierząt

• Brakiem właściwości niszczących dezynfekowane powierzchnie

• Wysokim stopniem biodegradacji

• Korzystnymi aspektami ekonomicznymi

1. Ważniejsze grupy związków dezynfekcyjnych i mechanizm działania dezynfekantów

• Fenole i ich pochodne

• Chlorowce i ich pochodne

• Aldehydy

• Alkohole

• Związki powierzchniowo czynne

• Jodofory

• Sole metali ciężkich

Mechanizm działania dezynfekantów:

• Zakłócenie syntezy i denaturacja kwasów nukleinowych

• Zmiany struktury i denaturacja białek

• Koagulacja materiału wewnątrzkomórkowego

• Dezintegracja błon komórkowych

1. Metody oceny działania dezynfekantów na drobnoustroje ( minimalne stężenie hamujące wzrost drobnoustrojów, stężenie użytkowe)

W celu wyznaczenia działania hamującego preparatu, czyli wartości MIC stosowana jest metoda zawiesinowa. Procedura polega na przygotowaniu szeregu rozcieńczeń badanego preparatu w jałowej wodzie destylowanej. Następnie do próbówek zawierających 9ml pożywki wprowadza się 1ml kolejnych rozcieńczeń preparatu i odpowiednio rozcieńczona hodowlę szczepu testowego. Próby inkubuje się i następnie sprawdza się żywotność komórek. Najniższe stężenie preparatu, hamujące wzrost organizmu testowego w podłoży stałym, określa minimalne stężenie hamujące.

Stężenie użytkowe preparatów dezynfekcyjnych wyznacza się metodą nośnikową. W tym celu na nośniki nanoszone są organizmy testowe. Po wysuszeniu nośników opłaszczonych zawiesina drobnoustrojów umieszcza się je w probówkach zawierających różne stężenia preparatu dezynfekcyjnego. Po określonym czasie ekspozycji nośniki przenosi się do roztworu inaktywującego działanie preparatu dezynfekcyjnego, a następnie do płynnej pożywki i inkubuje w ciągu 48h w temperaturze optymalnej dla badanego szczepu. Najmniejsze stężenie preparatu dezynfekcyjnego, przy którym nie obserwuje się wzrostu drobnoustroju w stosowanych warunkach hodowli, informuje jakie jest stężenie użytkowe badanego preparatu.