SPRAWOZDANIE NR 1

JOANNA KIELAR

18.12.2013

Temat: Izolacja kwasów nukleinowych z materiału ludzkiego

1. CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia było zapoznanie z różnymi metodami izolacji DNA z komórek ludzkich (DNA genomowy) oraz ocena jakości uzyskanego preparatu po rozdziale w żelu agarozowym. Celem izolacji było uzyskanie dużej ilości oczyszczonego preparatu DNA, pozbawionego białek oraz inhibitorów enzymów wykorzystywanych w reakcji PCR.

1. CHARAKTERYSTYKA ZASTOSOWANYCH METOD

   1. Metoda fenolowo – chloroformowa ( metoda w roztworze) – jest jedną z najczęściej stosowanych metod izolacji materiału genetycznego, w której wykorzystuje się większe powinowactwo cząsteczek DNA do fazy wodnej, a białka przechodzą do fazy organicznej Uzyskane tą metoda ekstrakty mogą zostać wykorzystane jako matryca dla reakcji PCR, a także poddane sekwencjonowaniu, klonowaniu oraz analizie restrykcyjnej. W związku z tym, że fenol jest odczynnikiem toksycznym najczęściej wybiera się metody, w których nie ma potrzeby użycia szkodliwych dla zdrowia substancji.

   2. Metoda kolumienkowa – zastosowanie nośnika stałego - bazuje na specjalnie zbudowanej membranie silikonowej, z którą łączy się DNA. Procedura izolacji obejmuje cztery etapy: lizę komórek (w obecności Proteinazy K), związanie DNA ze złożem krzemionkowym, przemywanie z inhibitorów r-cji PCR, białek i innych zanieczyszczeń oraz elucję DNA z membrany.

   3. Nano – Drop^TM- urządzenie umożliwiające pomiar stężenia DNA w bardzo niewielkiej objętości próbki (2 µl) metodą spektrofotometryczną.

   4. Elektroforeza w żelu agarozowym – rozdział uzyskanych roztworów DNA w polu elektrycznym, umożliwiający ocenę jakości wyizolowanego preparatu.

2. PRZEBIEG ĆWICZENIA

   1. Izolacja genomowego DNA metodą fenol – chloroform – materiałem wyjściowym była zamrożona krew ludzka z kolekcji własnej Pracowni Diagnostyki Molekularnej. Pierwszym etapem izolacji była liza komórek z zastosowaniem buforu zawierającego NH4Cl. Próbkę krwi wraz z buforem inkubowano w celu usunięcia błony komórkowej, , a następnie odwirowano aby uzyskać osad jąder komórkowych. Uzyskana frakcja jądrowa została przemyta PBS w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń oraz zawieszono w buforze TE (750µl), który stanowił fazę wodną podczas ekstrakcji. Ekstrahowano DNA z fazy wodnej dodając równa objętość mieszaniny fenol: chloroform (750µl) delikatnym wytrząsaniem probówki. Zebranie fazy wodnej było możliwe po wirowaniu. Proces powtórzono jeszcze raz dodając tą samą objętość mieszaniny fenol: chloroform. Ostatecznie zebrano 600 µl fazy wodnej, zawierającej DNA, do której dodano octan amonu oraz izopropanol w celu wytrącenia DNA (alkohol zagęszcza DNA). Po 20 minutowej precypitacji osad DNA, który nie był widoczny gołym okiem przepłukano etanolem, odwirowano i pozostawiono do osuszenia, po czym zawieszono w buforze TE.

   2. Izolacja ludzkiego DNA genomowego (metoda kolumienkowa) ze śluzówki nabłonka ludzkiego (SWAB, A&A Biotechnology) – materiałem wyjściowym w tej metodzie był wymaz pobrany za pomocą patyczka wymazowego z jamy ustnej na zajęciach, którego cześć została odcięta i przeniesiona do probówki. Dodano roztwór lizujący oraz Proteinazę K, w celu usunięcia zanieczyszczeń białkowych. Całość inkubowano w 37⁰C przez 20 min, worteksując co jakiś, umożliwiając DNA wraz z pozostałymi zanieczyszczeniami przejść z patyczka wymazowego do roztworu, który po zakończonej inkubacji został przeniesiony na kolumienkę do oczyszczania DNA. Na kolumienkę dwa razy został naniesiony roztwór płuczący A1 w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń (r-r zawarty w zestawie do oczyszczania), po czym na osuszoną kolumienkę dodano bufor elucyjny (Tris-HCl), umożliwiający zebranie oczyszczonego DNA do nowej probówki.

3. WYNIKI & WNIOSKI

Po przeprowadzeniu pomiaru stężenia oczyszczonej próbki DNA z krwi ludzkiej (metoda fenol- chloroform) uzyskaliśmy odczyt 92,8 ng/µl za pomocą urządzenia Nano-Drop^TM. Wskazanie aparatu również umożliwiło nam okreslenie czystości preparatu. Wartością tą było 1.5, co świadczy o tym, że oczyszczony preparat zawierał niewielkie zanieczyszczenia (wysoka czystość bowiem charakteryzowana jest przez wartości 1.8-2.0).

W przypadku próbki DNA wyizolowanej metoda kolumienkową wyliczona wartość stężenia przez aparat to 13 ng/µl, a wartość charakteryzująca stopień oczyszczenia próbki DNA to 1,79, co świadczy o wysokiej czystości preparatu.

Można więc stwierdzić na podstawie uzyskanych wyników, że:

• Metoda fenol-chloroform jest metodą efektywniejszą co do uzyskiwanej ilości oczyszczanego DNA niż metoda kolumienkowa ( w tym przypadku),

• Metoda kolumienkowa mimo, iż jest metodą mniej wydajną w tym przypadku pozwala na uzyskanie DNA o wysokiej czystości, nadającego się do użycia w szczególności w PCR.

• Izolacja DNA genomowego z krwi jest bardziej wydajna niż ze śluzówki nabłonka ludzkiego.

Obydwie uzyskane próbki wraz z buforem obciążającym zostały także poddane analizie elektroforetycznej w żelu agarozowym z bromkiem etydyny. Pomimo faktu, iż z zastosowaniem Nano- Drop’a udowodniono, że wyizolowano oczyszczone DNA, po naświetleniu żelu światłem UV nie zaobserwowano na żelu prążkow, potwierdzających obecność DNA. Może to być spowodowane bardzo małą ilością uzyskanego DNA, niedokładnym nanoszeniem próbek (DNA mógł wypłynąć ze studzienki) oraz zastosowaniem za niskiej procentowości żelu, czy też przyłożonego napięcia.