Pytania biotechnologia:

1. Przedstaw definicje związane z żywnością modyfikowaną genetycznie.

Zdecydowana większość odmian transgenicznych wprowadzonych do uprawy zawiera w genomie jeden trans gen. Tylko nieliczne odmiany mają dwa transgeny np. ziemniak tolerancyjny na herbicyd i odporny na stonkę ziemniaczaną lub kukurydza tolerancyjna na herbicyd i odporna na omacnice prosowiankę. Zapowiadane są odmiany poczwórnie transgeniczne.

Ogólnie odmiany transgeniczne można podzielić na dwie grupy w zależności od

1. Liczby wprowadzeń transgenu (liczby zabiegów transformacji – jedno, wielokrotne)

2. Liczby transgenów poprawiających wartość – z jednym (proste) lub z więcej transgenami (złożone)

1. ?

2. Przedstaw modyfikacje genetyczne surowców roślinnych wpływających na jakość żywności i ułatwiających przetwórstwo

Zmodyfikowana została większość roślin mających znaczenie dla człowieka.

Cele modyfikacji:

• Odporność na herbicydy – chemiczne środki ochrony roślin (soja, rzepak)

• Odporność na szkodniki – modyfikacja Bt (kukurydza, bawełna)

• Odporność na niekorzystne warunki środowiska (zasolenie gleby, mróz, susza, metale ciężkie)

• Poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych (pomidor Flavr Savr, „Golden Rice”, szczepionki w warzywach)

(moje cudne ciekawostki : 1994 – pierwszy „zmodyfikowany genetycznie” produkt spożywczy na rynku – pomidor FlavrSavr „z wyłączonym” genem odpowiedzialnym za gnicie)

1. Przedstaw metody transgenizacji ssaków.

Metoda mikroiniekcji

W metodzie tej DNA wprowadza się bezpośrednio do jądra zapłodnionej komórki jajowej, dokonując stosownych operacji pod mikroskopem. Chociaż technicznie trudna metoda ta jest obecnie najpowszechniej stosowana do uzyskiwania zwierząt transgenicznych

Przeniesienie genu przy użyciu komórek ES

Komórki linii zarodkowej.

Komórki z blastocysty (wczesny etap rozwoju zarodkowego) można pobrać i hodować w kulturze komórkowej. Nazywamy je komórkami linii zarodkowej (ES – ang embryonic stem) Mają one zdolność do różnicowania się we wszystkie inne typy komórek. Komórki ES można zmienić genetycznie w laboratorium, a następnie wszczepić do blastocysty i implantować do macicy

Zwierzęta transgeniczne pozwalają prowadzić obserwacje naukowe dotyczące zachowania się transgenu, można je również wykorzystać do produkcji zrekombinowanych białek. Ogólnie można powiedzieć, że uzyskanie zwierząt transgenicznych znalazło trzy zastosowania

- Badanie funkcji genu

- Systemy modelowe do obserwacji ludzkich chorób (choroba Alzheimera, artretyzm)

- Produkcja zrekombinowanych białek (białko krzepliwości krwi – czynnik IX, białko plazmy, α1- antytrypsyna

Metoda PCR (Polymerase Chain Reaction)

Niezwykle użyteczna w rekombinacji genetycznej in vitro jest opracowana w połowie lat osiemdziesiątych metoda PCR, tj reakcja łańcuchowa polimerazy umożliwiająca selektywną amplifikację in vitro poszczególnych fragmentów DNA (bez jego klonowania), imitująca zjawisko replikacji in vivo. Do przeprowadzenia tej reakcji są potrzebne minimalne ilości (50ng) wzorcowego jednoniciowego DNA, dwa startery (ang printers) jako sondy, tj. syntetyczne oligodeoksynukleotydowe sekwencje długości ok. 20 nukleotydów, komplementarne do znanych sekwencji końcowych wzorcowego matrycowego DNA (zwykle długości do 1kb, kilobase), ponadto deoksynukleinowe trifosforany (dNTPs) oraz polimeraza DNA. Całość ww. materiału jest zawieszona w buforze zawierającym Mg²⁺, jednowartościowe kationy i pewne substancje stabilizujące enzymy.

Reakcja łańcuchowa polimerazy np. Taq polega na przeprowadzeniu wielu cykli 20-30 rund w ciągu 2-3h przy czym jeden cykl trwa od kilkudziesięciu sekund do kilkunastu minut, w zależności od potrzeby. Proces przebiegu w mieszaninie o objętości nie przekraczającej 50-100μl, w jednej probówce Eppendorfa umieszczonej w bloku zautomatyzowanej i komercyjnie dostępnej aparatury.

Każdy cykl obejmuje trzy etapy:

- Termiczną denaturację (w temperaturze 92-96^oC) wzorcowego dsDNA (double-stranded dwuniciowego DNA) do ssDNA (single-stranded, jednoniciowego DNA)

- Przyłączanie starterów (tworzenie wiązań wodorowych) do wzorcowego ssDNA (w temperaturze 40-60^oC), czyli renaturację

- Wydłużanie (polimeryzacja) DNA przy końcach 3’-OH w temperaturze 72^oC w wyniku sukcesywnego przyłączania dNTPs za pomocą termostabilnej polimerazy DNA.

Startery, dozowane zwykle w nadmiarze w stosunku do powielanego DNA, kierują powtarzającymi się cyklami replikacji DNA, co prowadzi do wykładniczego zwiększania liczby kopii badanej sekwencji DNA, tak że badany DNA zostaje powielony 10⁵.

Polimorfizm fragmentów DNA powstający jest często wykorzystywany do identyfikacji nosicielstwa genu

Po transformacji zrekombinowanym DNA zarówno komórek Procaryota jak i Eucaryota tylko nieliczne wykazują ekspresję sklonowanych genów (jedna na 104-105) oraz ich obecność w stabilnej formie

Jednym z praktycznych sposobów podwyższenia wydajności transformacji jest przygotowanie DNA na odpowiednim poziomie aktywności biologicznej. Innym sposobem poprawy efektywności transformacji jest użycie wirusa S50 jako wektora oraz zastosowanie tzw. co-transformacji, tj transformacji właściwego wektora razem z sekwencją DNA (możliwie jak najdłuższą) sąsiadującą z genem którego ekspresja jest pożądana. Czasami jest wywoływana coekspresja dwóch białek z których jedno jest selektywnym markerem, a drugie właściwym produktem ekspresji pożądanego genu.

Obecnie najczęstszym gospodarzem klonowanych genów są drożdże Saccharomyces cerevisiae, łączące w sobie zalety układów prokariotycznych i eukariotycznych, tzn łatwe i szybkie w hodowli, wydzielające białka do podłoża po glikozylacji i utworzeniu mostków dwusiarczkowych oraz modyfikacji proteolitycznej, replikujące wektory wahadłowe.

Zastosowanie klonowania DNA

Klonowanie genów jest bardzo użyteczną techniką, która odegrała ogromną rolę w biologicznych badaniach dotyczących różnych dziedzin nauk przyrodniczych. Należy do nich

- Identyfikacja genów związanych z procesami chorobowymi. Klonowanie pozwoliło na zidentyfikowanie nieprawidłowych genów powodujących choroby dziedziczne, takie jak hemofilia i dystrofia mięśniowa, a także onkogenów i genów supresorowych, które mają istotny wpływ na rozwój guza. Scharakteryzowanie tych genów przyczyniło się w znacznym stopniu do poznania procesów chorobowych

- Mapowanie genomu. Identyfikacja i charakterystyka klonów zawierających sekwencje sąsiadujących ze sobą regionów w chromosomach jest wykorzystywana do konstruowania map, które pozwalają na ustalenie względnych pozycji genów

- Zrekombinowanie białka. Klonowanie genów wykorzystuje się do produkcji dużych ilości białek stosowanych w medycynie, takich jak insulina aplikowana chorym na cukrzycę lub czynnik VII stosowany w leczeniu hemofilii. Geny kodujące pożądane białka klonuje się w wektorach ekspresyjnych wprowadzonych do organizmu odpowiedniego gospodarza, jak na przykład drożdże, które wytwarzają duże ilości produktów ekspresji wklonowanych genów.

- Genetycznie zmodyfikowane organizmy. Klonowanie może być również wykorzystane do przeniesienia do organizmu obcych genów, co prowadzi do uzyskania roślin i zwierząt o zmodyfikowanych właściwościach.

Metody selekcji nowych organizmów (hybryd)

Nowe metody selekcji opierają się najczęściej na testach identyfikujących genotyp zrekombinowanych mikroorganizmów oraz w szczególnych przypadkach na fenotypowych cechach wektora, reprezentatywnych dla procesów przemysłowych, w których zrekombinowane organizmy są zaangażowane. Wspomniane metody selekcji przedstawiono niżej

- Metody immunologicznego znakowania, np. ang fluorochrome conjugated antibodies

- Metody genetycznego i immunomagnetycznego rozdziału badanych mikroorganizmów

- Amplifikacja specyficznych sekwencji DNA i RNA badanych mikroorganizmów metodą PCR i elektroforetyczna identyfikacja powielonych genów metodą PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis lub PGE – Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

- Identyfikacja ekspresyjnych białek metodami elektroforetycznymi, np. 2D(dimensional)-electrophoresis, IEF – isoelectric focusing.

- Identyfikacja białek eksresyjnych metodami chromatografii, np chromatografią jonowymienną, chromatografią sączenia molekularnego, HPLC

- Identyfikacja jonów swoistych dla białek określonych drobnoustrojów za pomocą spektrometrii masowej

1. Wprowadzanie plazmidu do kolonii

2. Część bakterii integruje ze swoim genomem

3. Po namnożeniu identyfikujemy przez posiewy

1. Omów modyfikacje genetyczne zwierząt

Gen wrażliwości na stres HAL

- Zyskał nazwę halotanowego od nazwy anestetyku halo tanu używanego początkowo do jego diagnozowania (Ollivier i WSP 1975, Minkema i WSP 1877, Smith i Bampton 1977)

- Analogicznie określenia genu HAL to MHS – Malignant Hyperthermis Syndrom (Ollivier i wsp 1975); RYR1 – zmutowany (mutacja CT) w pozycji 1843, na chromosomie 6) gen receptora ryanodiny, będącej jedną z podjednostek struktury kanału wapniowego retikulum sarkoplazmatycznego mięśni szkieletowych (Fuji i wsp 1991)

- HAL – gen autosomalny o charakterze plejotropowym, posiada dwa allele: N – dominujący (normalny) i n – recesywny (zmutowany) odpowiadający za wrażliwość na stres

- Genotypy NN-homozygoty odporne na stres, Nn – heterozygoty nie wykazujące reakcji na stres wywołany anestezją halotanową, nn – homozygoty wrażliwe na stres (penetracja 70-100%)

Gen mięsa kwaśnego RN

- Nazwa RN pochodzi od słów Randement Napole (wydajności „Napole”) – Naveau Pommeret Lechaux – 1985) wykorzystanej jako kryterium selekcji w doskonaleniu jakości mięsa w liniach Laconie (LW-33%, H-33%, Pi-33%) i Penshire (H-50%, D-35%, LW-15%) (Naveau 1986, Naveau i wsp 1985)

- Inna nazwa to HF (Hampshire Factor) zaproponowana przez badaczy niemieckich (Wassmuth i wsp 1991)

- Jest to mutacja A G w kodonie 200 chromosomu 15 postaci genu kodującego podjednostkę γ (PRKG3) kinazy białkowej, zależnej od AMP (AMPK), inaktywującej enzym odpowiadający za syntezę glikogenu (syntaza glikogenu) (Milan i wsp 2000)

- Posiada dwa allele: RN⁺ – dominujący (wywołujący mięso kwaśne) i rn⁺ - recesywny (normalny)

- Występują 3 genotypy: RN⁺RN⁺ (homozygoty dominujące podobne do heterozygot) i RN⁺rn⁺ oraz rn⁺rn⁺ (homozygoty recesywne o prawidłowych parametrach jakości mięsa).

Gen wpływający na wielkość miotu (ESR). Niektóre chińskie rasy świń charakteryzują się niezwykłą plennością. Badania prowadzone w USA miały na celu wykrycie genetycznego podłoża tej cechy. Wyniki tych badań wskazują, iż zlokalizowany w chromosomie 1 (1p2,5-2,4) locus genu receptora steroidowego hormonu płciowego estrogenu – ESR (ang estrogen receptor gene) może mieć istotny wpływ na wielkość miotul Stwierdzono, że jeden z alleli tego genu, występujący w chińskiej plennej rasie meishan, wykazuje związek z wielkością miotu i może być uważany za gen główny kontrolujący tę cechę. Lochy mające w swym genotypie dwie kopie tego genu dają mioty większe o 1 do 1,4 prosięcia żywo urodzonego w porównaniu z lochami nie mającymi tego genu. Badania molekularne (z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych) genu receptora estrogenu, prowdzone u świń innych ras (niemiecka landrace, yorkshire, duroc), pozwoliły na wykrycie dwóch mutacji punktowych (zamiana A T w kodonie 1665 i AG w kodonie 1754

1. wymień i opisz źródła węgla w pożywce

W biochemii naszej planety podstawą jest węgiel. Źródłem energii w życiu organizmów heterotroficznych są związki węglowe. Węgiel stanowi około 50% s.s. bakterii i grzybów. Ilość substancji zawierających węgiel które można wykorzystywać jest ogromna. Wszystkie substancje organiczne syntetyzowane biologicznie ulegają biodegradacji, chociaż ich rozkład jest niekiedy bardzo powolny. Niektóre drobnoustroje np. Pseudomonas sp mogą wykorzystywać ponad 90 substancji organicznych jako źródła węgla i energii. Inne jak np. bakterie metanowe mogą wykorzystywać tylko kilka substancji.;

Sacharydy. Najpowszechniej jako źródło węgla są stosowane monosacharydy, disacharydy i polisacharydy. Ich roczne zużycie jako składnika podłoży fermentacyjnych wynosi 30 mln ton.

Spośród monosacharydów: ksylozy, glukozy i fruktozy najczęściej jest stosowana glukoza, znana również jako cukier gronowy lub dekstroza. Jest to najbardziej rozpowszechniony sacharyd prosty. Wchodzi w skład sacharozy, laktozy, maltozy i takich polisacharydów, jak: skrobia, celuloza, glikogen i dekstran.

Glukoza dobrze rozpuszcza się w wodzie i jest łatwo przyswajalna przez większość drobnoustrojów. Jej stosowanie umożliwia otrzymanie bardzo czystego produktu z dużą wydajnością.

W procesach w których melasa stanowi źródło węgla, przygotowuje się ją przez częściowe usunięcie inhibitorów. Do produkcji drożdży i etanolu melasę często tylko neutralizuje się przy pomocy CaCO₃. Dla wielu procesów melasa jest gotowana w środowisku kwaśnym lub zasadowym. Po wytrąceniu się osadu oddziela się go od części uwodnionej. Do produkcji kwasu cytrynowego melasę gotuje się z cyjankiem żelazowo-potasowym i fermentuje razem z osadem. Możliwość hamowania fermentacji przez wolny cyjanek żelazowo-potasowy eliminuje się przez dodanie tiosiarczanu (VI) sodu (Na₂S₂O₃), pirosiarczanu (IV) potasu (K₂S₂O₅) lub wodorosiarczanu (IV) sodu (NaHSO₃). Melasa buraczana zawiera dużo potasu, a mało fosforu (tabela).

Melasę z trzciny cukrowej stosuje się w przemyśle spirytusowym jako melasę surową lub oczyszczoną. Inny rodzaj melasy trzcinowej to melasa dobrej jakości w formie oczyszczonego koncentratu, częściowo inwertowanego soku cukrowego z trzciny. Nie jest to jednak produkt odpadowy powstający w procesie krystalizacji cukru. Głównie wytwarza się go w Afryce Południowej, na Kubie i w Australii, lecz tylko na specjalne zamówienie.

Sacharoza zbudowana z reszt glukozy i fruktozy, jest najbardziej rozpowszechnionym disacharydem w przyrodzie.

W przemyśle fermentacyjnym jako źródła sacharozy używa się przede wszystkim melasy. Jest ona produktem odpadowym w produkcji cukru z buraków cukrowych lub trzciny cukrowej i jest nazywana melasą buraczaną lub trzcinową.

Konsystencja i skład melasy buraczanej zależą od technologii ekstrakcji cukru oraz od jakości zbioru (technologii, klimatu, warunków przechowywania itp.). Przemysł fermentacyjny często stosuje cukier nieoczyszczony lub melasę rafinacyjną. Cukier surowy lub melasa rafinacyjna nie różnią się prawie składem chemicznym, natomiast skład melasy zależy od technologii produkcji cukru.

Oprócz sacharozy melasa zawiera mono- i oligosacharydy, glukozę, fruktozę, sacharozofruktozyl, m-inozytol galaktozy lub oraz składniki niecukrowi, których może być aż 39% s.s. Składniki te mogą być organiczne lub nieorganiczne, bezazotowe lub zawierające azot. Kwas glutaminowy stanowi 40-55% przyswajalnego azotu. Czynniki wzrostowe występują w następujących ilościach:

- Biotyna 17,7-21,8 μg/kg

- Pantotenian wapnia 23-70 mg/kg

- m-inozytol 0,69-1,83 g/kg

- Tiamina 26-75 mg/kg

Lotne pirole i pirazyny azotowe oraz furany i fenole występują w małych stężeniach w zakresie kilku ppm.

Przydatności melasy w przemyśle biotechnologicznym nie można oceniać jedynie na podstawie jej składu chemicznego. Kryterium jej przydatności jest test biologiczny.

W produkcji drożdży piekarskich kwasu cytrynowego i etanolu stwierdzono, że krytycznymi parametrami są: zawartość azotu alfa-aminokwasowego i całkowita zawartość azotu, azot betainowy, lotne kwasy organiczne, związki wapnia oraz właściwości buforujące. Substancje niepożądane to: betaina, kwasy lotne oraz związki wapnia. Ponadto koloidy powstające z pektyn i skarmelizowane pigmenty w stężeniu 1,4-12,9% oraz karmel w stężeniu 0,4-1,3%. Inne substancje niepożądane to metale ciężkie: Pb 1-68ppm, Cu 1,6-20,0ppm, Fe 56-290 ppm, azotany (V) i azotany (III) w ilości odpowiednio 233,7-1208,2 i 7,3-17,0 mg/100g substancji niewęglowodanowych, pozostałości pestycydów w stężeniu ppb i ppm.

Jakość melasy jest różna w poszczególnych etapach kampanii cukrowej. Dla przemysłu spirytusowego najbardziej odpowiednią melasę otrzymuje się w październiku i listopadzie ze świeżo zebranych buraków. Zawiera ona wówczas dużo aminokwasów. Przechowywanie buraków powoduje w nich zmiany, które wpływają na pogorszenie jakości melasy. Zawartość składników aminowych zmniejsza się w grudniu i styczniu, a zwiększa się zawartość betainy, azotanów (III), azotanów (V) i lotnych kwasów.

W procesach w których melasa stanowi źródło węgla, przygotowuje się ją przez częściowe usunięcie inhibitorów. Do produkcji drożdży i etanolu melasę często tylko neutralizuje się przy pomocy CaCO₃. Dla wielu procesów melasa jest gotowana w środowisku kwaśnym lub zasadowym. Po wytrąceniu się osadu oddziela się go od części uwodnionej. Do produkcji kwasu cytrynowego melasę gotuje się z cyjankiem żelazowo-potasowym i fermentuje razem z osadem. Możliwość hamowania fermentacji przez wolny cyjanek żelazowo-potasowy eliminuje się przez dodanie tiosiarczanu (VI) sodu (Na₂S₂O₃), pirosiarczanu (IV) potasu (K₂S₂O₅) lub wodorosiarczanu (IV) sodu (NaHSO₃). Melasa buraczana zawiera dużo potasu, a mało fosforu (tabela).

Melasę z trzciny cukrowej stosuje się w przemyśle spirytusowym jako melasę surową lub oczyszczoną. Inny rodzaj melasy trzcinowej to melasa dobrej jakości w formie oczyszczonego koncentratu, częściowo inwertowanego soku cukrowego z trzciny. Nie jest to jednak produkt odpadowy powstający w procesie krystalizacji cukru. Głównie wytwarza się go w Afryce Południowej, na Kubie i w Australii, lecz tylko na specjalne zamówienie.

Laktoza C₁₂H₂₂O₁₁ znana też pod nazwą cukier mlekowy jest zbudowana z D-glukozy i D-galaktozy

Laktoza występuje w mleku wszystkich ssaków. Otrzymuje się ją z serwatki. Jako źródło węgla w podłożu laktozę stosuje się tylko w nielicznych przypadkach i najczęściej w dużych stężeniach. Pomimo słabego przyswajania przez drobnoustroje co wpływa na przedłużanie się fermentacji, laktozę często stosuje się w produkcji antybiotyków, zwłaszcza penicyliny. Używa się jej również w produkcji proteaz zasadowych z Bacillus subtilis.

Termiczna sterylizacja powoduje częściową przemianę laktozy, znajdującej się w podłożu bardziej złożonym, do nieprzyswajalnej laktulozy.

Serwatka jest „serum” otrzymanym z mleka podczas produkcji serów lub twarogów po usunięciu z niego tłuszczu i kazeiny. Rozróżnia się serwatkę słodką i kwaśną. Serwatka słodka powstaje w produkcji serów, a serwatka kwaśna w produkcji twarogów, serków i kazeiny kwasowej.

Maltoza C₁₂H₂₂O₁₁ – cukier słodowy – jest zbudowana z dwóch cząsteczek glukozy. Powstaje głównie po hydrolizie skrobi i glikogenu. Występuje w różnych produktach spożywczych. Maltoza jest obecna w słodzie, ekstrakcie słodowym i brzeczce piwnej.

Celobioza jest produktem enzymatycznej hydrolizy celulozy. Podobnie jak maltoza jest zbudowana z dwóch cząsteczek D-glukozy. Różnica między maltozą a celobiozą polega na tym, że w maltozie występuje wiązanie alfa-glikozydowe, a w celobiozie beta-glikozydowe. Obydwa sacharydy mają właściwości redukujące i ulegają mutarotacji. O zastosowaniu celobiozy w przemyśle fermentacyjnym będzie mowa w rozdziale dotyczącym przerobu celulozy.

Polisacharydy. Najczęściej stosowanym w przemyśle fermentacyjnym polisacharydem jest skrobia

Skrobia jest stosowana w postaci czystej jako bezpostaciowy proszek lub jako składnik ziemniaków, zboża, owsa, jęczmienia, sorga, kukurydzy, tapioki (tabela). Są to główne surowce stosowane w produkcji etanolu, acetonu i butanolu. Skrobia jest najważniejszym zapasowym węglowodanem roślin i jest syntetyzowana w postaci małych granulek o typowej strukturze. Granulki skrobi są nierozpuszczalne w wodzie i bardzo wolno rozkładane przez drobnoustroje. W gorącej wodzie kuleczki skrobi pęcznieją, zaczynają żelować i tracą swoją postać (jędrność). Różne typy skrobi ulegają żelatynowaniu w różnych temperaturach.

Inulina jest substancją zapasową rośliny Jeruzalem Atrichoke, cykorii i innych roślin złożonych (Asteraceae). Jest to liniowy polimer beta-(2-2)-D-fruktozy i alfa-(1-2)-D-glukozy o masie cząsteczkowej około 5000.

Stosunek fruktozy do glukozy rzadko jest niższy niż 80:20. Inulina jest rozpuszczalna w wodzie, nie daje zabarwienia z jodem, ma właściwości redukujące.

Jeruzalem Atrichoke zawiera około 16% inuliny. We Francji ta roślina jest używana w produkcji etanolu. Inulina jest najpierw hydrolizowana do lewuliny i fruktozy przez inulinazę otrzymaną z Aspergillus niger, a następnie fermentowana przez Saccharomyces cerevisiae.

W fermentacji alkoholowej cykorii przez drożdże z rodzaju Kluyveromyces hydroliza inuliny jest wspomagana dodatkiem preparatów enzymatycznych degradujących celulozę, np. Celluclast lub Pectinex, w celu zwiększenia wydajności alkoholu.

Celuloza. Celuloza występuje w ścianach komórek roślin jako substancja krystaliczna, razem z hemicelulozą i ligniną w proporcji 4:3:3. Jest ona długołańcuchowym polimerem, o masie cząsteczkowej 300000-500000 Da, zbudowanym z reszt D-glukozy połączonych wiązaniem beta-glikozydowym w ukłądzie 1-4. Na taki układ wiązań wskazuje powstawanie celobiozy w wyniku enzymatycznej hydrolizy.

Hemicelulozy są mieszaninami polimerów pentozanów (ksylany, arabany), heksozanów (mangany i galaktany) i różnych kwasów glukoronowych. Lignina jest makrocząsteczką powstałą z kwasów fenolowych. Krystaliczna celuloza występująca w ściankach komórek roślinnych jest odporna na hydrolizę również ze względu na osłaniający wpływ otaczających ją lignin. Hemicelulozy są łatwo hydrolizowane do mono- i oligosacharydów przez kwasy, zasady i enzymy.

Celuloza znajduje się w odpadach przemysłowych i rolnych po przerobie roślin. Są to tego rodzaju odpady rolne, jak słoma, łodygi i kolby kukurydzy, wytłoki trzciny cukrowej i inne pozostałości roślin, a także odpady przemysłowe z przerobu papieru i drewna.

Mikrobiologiczna przemiana celulozy na białko paszowe, etanol i inne produkty jest przedmiotem licznych badań. Odpady przemysłowe są obecnie przerabiane na skalę handlową, natomiast pozostałości roślin w rolnictwie są wykorzystywane tylko sporadycznie. Czynnikiem decydującym w przerobie celulozy jest zniszczenie połączenia między ligniną i celulozą. Stosuje się techniki wstępnego traktowania materiału zawierającego celulozę aby usunąć ligninę otaczającą celulozę, jak np. intensywne mechaniczne rozdrabnianie, a następnie stosowanie pary, naświetlanie promieniami gamma o dużym natężeniu, działanie ozonem, SO₂, obróbkę alkaliczną lub kwaśną w wysokich temperaturach.

Polisacharydy otrzymywane z wodorostów morskich. Wodorosty, z których są ekstrahowane polisacharydy, pozyskuje się ze środowiska naturalnego (morza i oceany), lub też ze specjalnych upraw. Najczęściej wykorzystuje się algi morskie czerwone (Rhodophyta), brązowe (Phaeophyta), zielone (Chlorophyta) lub niebieskozielone (Cyanophyta). Z wymienionych alg otrzymuje się: alginiany, karageniany i agary. Alginiany i karaginiany są stosowane do immobilizacji enzymów, drobnoustrojów i tkanek. Agar jest używany do zestalania podłóż mikrobiologicznych oraz jest surowcem do otrzymywania agarozy, która ma różnorodne zastosowanie w biotechnologii. Przypuszcza się, że wraz z rozwojem badań zostaną odkryte nowe zastosowania już pozyskiwanych polisacharydów oraz że będzie można otrzymać z wodorostów morskich nowe polisacharydy.

Źródła węgla niesacharydowe

Metanol jest produkowany z gazu naturalnego i nafty, a jego czystość przekracza 99,8%. Jest stosowany w biosyntezie białka paszowego. W tym celu hoduje się Methylophilus methylotrophus w pożywce z napowietrzaniem (mieszanina amoniaku i metanolu). Nazwa handlowa produktu zawierającego białko paszowe to Pruteen. Technologia produktu o nazwie handlowej Provesteen umożliwia otrzymanie drożdży, których białko można stosować w żywności. Inne drobnoustroje produkujące SCP to: Candida boidini i Hansenula polymorpha, które mogą także syntetyzować SCP, gdy w pożywce jako źródło węgla jest stosowany metanol.

Metanol jest również używany w biosyntezie witaminy B₁₂ przez Pseudomonas, L-seryny przez Arthrobacter globiformis; L-leucyny i waliny oraz maślanów poliwodorowych przez Alcaligenes eutrophus. Ponadto stosuje się go jako źródło węgla w kombinacji z ksylozą, w hodowli Hansenula polymorpha.

Etanol jest bezbarwną cieczą o charakterystycznym zapachu i palącym smaku. W wyniku fermentacji z surowców roślinnych otrzymuje się etanol używany do celów konsumpcyjnych oraz do przerobu na tzw ocet spirytusowy lub winny (utlenianie w obecności bakterii). Etanol syntetyczny otrzymuje się z etylenu lub najnowszą metodą z metanolu. Syntetyczny etanol przed zastosowaniem jak źródło węgla należy oczyścić z aldehydu krotonowego, który jest substancją toksyczną dla wielu drobnoustrojów, a szczególnie dla drożdży Candida utilis. Opracowano już wiele technologii produkcji z etanolu dodatków do żywności, aminokwasów, penicyliny, białka paszowego.

Z polialkoholi najczęściej stosuje się glicerol. Glicerol jest oleistą, lepką, bezbarwną i bezwonną cieczą o słodkim smaku. Zaletą glicerolu jest jego nietoksyczność i łatwe mieszanie się z wodą. Wyróżnia się glicerol naturalny, otrzymywany w wyniku hydrolizy tłuszczów lub fermentacji alkoholowej, oraz glicerol syntetyczny, otrzymywany na bazie propylenu pochodzącego z przerobu ropy naftowej. Zastosowanie glicerolu jako źródła węgla w rozwoju drobnoustrojów przedstawiono w tabeli.

W biotechnologii glicerol jest stosowany również do utrwalania czystych kultur drobnoustrojów oraz preparatów enzymatycznych.

Kwasy karboksylowe. Jako niedrogie źródło węgla stosuje się kwas octowy. Jest wiele doniesień na temat syntezy mikrobiologicznej aminokwasów na pożywce z kwasem octowym. Mieszanina kwasu octowego z każdym z nastepujących składników była pożywką w produkcji L-lizyny: octan amonu, glukoza, sacharoza, hydrolizat drzewny, ekstrakt drzewny i wyciąg z kukurydzy (w stosunku 1:0,25)

Kwas L-glutaminowy jest syntetyzowany w pożywce zawierającej tylko kwas octowy lub mieszaninę kwasu octowego z glukozą, melasą z trzciny cukrowej lub octanem amonu. L-izoleucyna i treonina również są produkowane w pożywce z kwasu octowego. Drobnoustrojami stosowanymi we wszystkich tych przypadkach są szczepy Brevibacterium, Corynebacterium i Micrococcus. Białko paszowe otrzymuje się z Candida utilis na bazie mieszaniny kwas octowy i alkohol syntetyczny, o stosunku węgli pochodzących z kwasu do węgli z etanolu wynoszącym 22:1.

W syntezie kwasu L-glutaminowego do glukozy dodaje się kwasy: oleinowy, waccenowy i linolenowy o stężeniu 50-100 mg/dm³. Kwas olejowy jest stooswany jako źródło węgla w produkcji prodigiozyny przez Serratia marcescens.

Tłuszcze. Tłuszcze roślinne i zwierzęce często stosuje się jako dodatkowe źródło węgla w połączeniu z sacharydami. Są one także bezpośrednią substancją odżywczą w pożywce, dodawaną w formie triacylogliceroli lub jako oleje; można je również stosować jako substancje rozbijające pianę.

Przydatność oleju w procesach mikrobiologicznych określa jego liczba kwasowa oraz zawartość nadtlenków i triacylogliceroli. Podczas przechowywania oleju jego kwasowość rośnie. Wartość kwasowości większa niż 10 hamuje syntezę tetracykliny. Zawartość nadtlenków również zwiększa się podczas przechowywania i może mieć niepożądany wpływ na syntezę penicyliny, chlorotetracykliny i L-lizyny. Triacyloglicerole są stosowane w produkcji steroidów; dodaje się je w formie olejów lub mąki nieodtłuszczonej. Na przykład zastosowano nieodtłuszczoną mąkę sojową „Soyopan” lub „Nurupan”, które zawierają 20-22% oleju, w tym 2,2-2,5% lecytyny. Standaryzowane rafinowane lecytyny sojowe są także stosowane w procesach fermentacyjnych, dodawane w postaci preparatów M-C-Thin, AF-I i P-I, Emilbesto o zawartości 60-65% fosfolipidów lub Emulpur N o zawartości co najmniej 95% fosfolipidów.

Węglowodory. Najprostszym węglowodorem jest metan – gaz naturalny, zawierający 90-92% czystego metanu oraz 1% etanu, 1-2% butanu, ślady CO₂, argonu i azotu

Metan jest zanieczyszczony siarką, którą należy usunąć przed zastosowaniem w procesach mikrobiologicznych. Przemysłowo w pożywce z metanem hoduje się szczepy z rodzaju Methylomonas, otrzymując białko paszowe SCP (ang single celi protein).

n-butan mogą utylizować różne mikroorganizmy, dla których jest on źródłem węgla. Pseudomonas butannovara jest zdolny do syntezy biomasy komórkowej wówczas, gdy n-butan jest źródłem węgla w pożywce. Procesy utleniania n-butanu są bardzo ekonomiczne i stosuje się je m.in. w produkcji kwasu cytrynowego. W wyniku utleniania powstaje mieszanina zawierająca ketony, aldehydy, kwasy i estry, które wykorzystują drożdże z rodzaju Candida i Saccharomyces jako źródło węgla i energii do produkcji SCP.

n-Pentan jest stosowany jako źródło węgla w syntezie biomasy przez Corynebacterium hydrocarboclastus

n-Parafiny są często używane jako źródło węgla w syntezie biomasy drobnoustrojów, kwasów organicznych, aminokwasów. Stosowane obecnie handlowe podłoża zawierają głównie parafiny C₁₀-C₂₀, podczas gdy surowy olej jest bardzo rzadko stosowany w fermentacji. Na skalę przemysłową w różnych krajach produkowano w latach 70. XX wieku biomasę drobnoustrojów w pożywkach z dodatkiem parafin.

Drożdże produkuje się na n-alkanach o długości łańcucha C₁₀-C₁₄ i C₁₅-C₁₈ lub C₁₃-C₂₁. Największe wydajności otrzymuje się z frakcji C₁₅-C₁₇. Aby lepiej wykorzystać węgiel w biokonwersji węglowodorów stosuje się dodatki takie, jak CO₂ gazowy (saturacja) lub ekstrakt śruty ryżowej, wywar gorzelniany, hydrolizat drożdży browarnianych, dodawane bezpośrednio do pożywki.

Do produkcji kwasu cytrynowego, izocytrynowego, 2-ketoglutarowego, bursztynowego, fumarowego, L-glutaminowego a także w produkcji L-treoniny, L-waliny stosuje się inne dodatki do n-parafin niż w produkcji białka paszowego, np. w produkcji L-lizyny stosuje się mieszaninę n-parafin z etanolem w stosunku 5:1.

Substraty gazowe. Takie substraty gazowe, jak CO₂, CO₂ i H₂ zajmują specjalną pozycję w technologii mikrobiologicznej. Stosuje się je w produkcji białka paszowego, np. przez bakterie Hydrogenomonas. Kilka kultur beztlenowych Clostridium wykorzystuje CO₂, CO₂ i H₂ w produkcji różnych kwasów organicznych.

7.scharakteryzuj materiały pomocnicze stosowane w biotechnologii

Detergenty – są dodawane jako substancje, które emulgują nierozpuszczalne w wodzie składniki odżywcze w pożywce oraz takie substraty jak n-alkany, oleje, surowce zawierające steroidy. Zastosowanie detergentów wpływa na polepszenie wydajności biomasy z n-alkanów, aminokwasów i kwasów organicznych. Przemiana beta-sitosterolu przez Nocardia jest znacznie wydajniejsza przy zastosowaniu dodatku Tween 40 i Tween 60, które są ponadto źródłem kwasów tłuszczowych. Detergenty znajdujące się w pożywce zwiększają przepuszczalność membran komórki i aktywują różne enzymy komórkowe. Stąd ich stymulujący wpływ obserwowano w podłożu zawierającym sacharydy jako źródło węgla, np. w procesie otrzymywania proteazy z Aspergillus, lipazy z Alcaligenes, antybiotyków z Melanconis flavovirens oraz szczepionek z Leptospira.

Odpieniacze

Powstawanie piany w procesach biotechnologicznych jest zjawiskiem niekorzystnym. W hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorach z napowietrzaniem jest niezbędna kontrola pienienia i gaszenie piany. Powstawanie piany jest związane z warunkami hydrodynamicznymi w płynnym podłożu, wprowadzaniem gazu (powietrza) oraz obecnością komórek drobnoustrojów. Obecność mikroorganizmów w roztworze, a także różnych substancji rozpuszczalnych (substancje odżywcze i metabolity) i ich rozproszenie mają ogromny wpływ na tworzenie się i charakter piany. Ważną rolę odgrywa ciśnienie w fermentorze, jak również ciśnienie kapilarne w pęcherzykach piany określające pośrednio stabilność piany.

Wiele substancji ma zdolność obniżania napięcia powierzchniowego na granicy faz roztwór-powietrze. Pożądane właściwości dobrego odpieniacza to przede wszystkim

- Szybkie rozbicie istniejącej piany

- Długotrwałe zabezpieczenie przed ponownym powstaniem piany

- Aktywność w małym stężeniu

- Nietoksyczność w stosunku do namnażanych drobnoustrojów

- Nietoksyczność dla ludzi i zwierząt

- Łatwość stosowania

- Niepalność, nielotność, niewybuchowość

- Niska cena

Stosowane w biotechnologii odpieniacze mogą być naturalne i syntetyczne. Najczęściej używane odpieniacze naturalne to: olej słonecznikowy, kwas olejowy, olej z wielorybów (tran). Najlepsze odpieniacze syntetyczne to: silikony, polipropyleny i produkty uboczne otrzymywane w syntezie kwasów tłuszczowych (soap stocks). Syntetyczne odpieniacze są drogie, lecz efektywne już w bardzo małych ilościach. Zazwyczaj dodaje się je w ilości 0,1% w stosunku do objętości pożywki. Oleje roślinne i zwierzęce (tran, soap stocks) są stosowane w ilości 0,5% w produkcji penicyliny i wszystkie zachowują się z jednej strony jak odpieniacze, a z drugiej jak substancje odżywcze.

Antyseptyki (środki bakteriobójcze ) i antybiotyki

Dodatek do pożywki chemicznych środków bakteriobójczych jest rzadko stosowany. Powierzchniową fermentację kwasu cytrynowego na melasie buraczanej poprzedza jej odkażenie formaliną (30-40% roztwór wodny aldehydu mrówkowego), sodowymi lub potasowymi solami 5-nitro-2-furyloakrylanu lub furacykliną. Furazolidyna jest stosowana w produkcji insektycydu przez Bacillus thuringiensis. Ta substancja jest nietoksyczna dla drobnoustrojów, lecz hamuje wzrost bakteriofagów. W handlu znajdują się również środki zawierające antybiotyki polecane przez dystrybutorów do stosowania w przemyśle spirytusowym w celu wyeliminowania ewentualnego niebezpieczeństwa zakażenia zacierów fermentacyjnych. Zakażenia zacierów powodują zakłócenia w produkcji i spadek wydajności alkoholu. Zastosowanie antybiotyków w biotechnologii żywności powinno być poparte wszechstronną wiedzą na temat zagrożeń, jakie niesie ze sobą stosowanie tych preparatów.

Substancje buforujące

Kontrola odczynu (pH) pożywki ma ogromne znaczenie w produkcji określonych substancji syntetyzowanych przez drobnoustroje, ponieważ często od kwasowości zależy, co drobnoustroje syntetyzują. Na przykład Klebsiella aerogenes produkuje:

- W pH 5,0 glikol butylenowy C₄H₈(OH)­₂

- W pH 6,0 glikol butylenowy i etanol C­₂H₅OH

- W pH 7,0 glikol butylenowy, etanol i mleczan CH₃CH(OH)COOR

- W pH 8,0 glikol butylenowy, etanol, mleczan, octan CH₃COOR i mrówczan HCOOR’

Wiele substancji stosowanych jako źródło substancji odżywczych, a więc węgla (serwatka, melasa, brzeczka) i azotu (namok kukurydziany, ekstrakty i hydrolizaty drożdżowe) zawiera substancje o właściwościach buforujących, takie jak: białka, peptydy, aminokwasy, cytryniany. Ilość tych substancji podczas hodowli ulega zmianie, co powoduje konieczność utrzymania pH na określonym poziomie przez dodanie odpowiedniego regulatora pH. Wiele środowisk hodowlanych jest buforowanych przez dodatek węglanu wapnia. Jeżeli pH obniża się – węglan jest rozkładany, jeżeli rośnie – może następować zmiana pH wywołana produkcją kwasu przez drobnoustroje, jak ma to miejsce w produkcji kwasu mlekowego.

pH podłoża można również korygować przez dodanie roztworów wodorotlenków sodu lub amonu i roztworu kwasu siarkowego (VI)

Inne dodatki

Niektóre substancje dodane do podłoża pomagają regulować syntezę produktu, nie wpływając na wzrost mikroorganizmów. Do takich substancji należą tzw prekursory, które są bezpośrednio wbudowywane do żądanego produktu, podnoszą wydajność produkcji. W produkcji penicyliny prekursorem może być kwas fenylooctowy, a w produkcji L-seryny – glicyna

Inhibitory zwiększają przepuszczalność ścian komórki i ułatwiają uwalnianie metabolitów, podnosząc w ten sposób wydajność syntezy. Niektóre inhibitory powodują akumulację metabolitu pośredniego, który bez dodatku inhibitora jest metabolizowany. Przykładowym inhibitorem jest penicylina stosowana w produkcji kwasu glutaminowego. Hodowla drobnoustrojów na określonych substratach indukuje syntezę enzymu potrzebnego do rozkładu tego substratu w komórce hodowanego mikroorganizmu. Substrat ten jest induktorem syntezy enzymu.

Substancje chelatujące. Na skutek mieszania składników pożywki trudno rozpuszczalnych następuje wytrącanie substancji śladowych – mikroelementów. Często jednocześnie wytrącają się makroelementy, jak np. Mg²⁺ i PO₄^-. Problem wytrącania się podczas długotrwałego mieszania dotyczy najczęściej soli metali niealkalicznych

Składniki w stanie wytrąconym nie są dostępne dla drobnoustrojów. Właściwe stężenie substancji śladowych można zapewnić przez chelatowanie, które utrzymuje stan, podaż fizjologicznego stężenia niezbędnego dla hodowanych drobnoustrojów. Substancje chelatujące zawierają grupy kompleksujące – ligandy, które związane odwracalnie z jonami tworzą kompleksy rozpuszczalne.

8. Omów podział technik hodowli drobnoustrojów ze względu na stan fizyczny pożywki

?

8. Hodowla ciągła – warunki, zastosowanie

namnażanie drobnoustrojów prowadzone jest w środowisku

w którym ciągle usuwana jest część pożywki i dodawana nowa. Jeśli tylko zapewni się usuwanie zużytego podłoża i zastępowanie go świeżym, to możliwe jest utrzymywanie fazy wzrostu logarytmicznego praktycznie w nieskończoność. Prowadzi się ją w tzw. chemostatach, umożliwiających kontrolowanie wzrostu komórek za pomocą dozowania odpowiednich ilości pożywki i regulowania szybkości przepływu. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie stanu równowagi, w którym zagęszczenie komórek jest stałe. Ma to duże znaczenie w badaniach procesów fizjologicznych drobnoustrojów, kiedy niezbędne są warunki stabilne. Hodowle ciągłe są wykorzystywane m.in. w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym, do produkcji określonych substancji (np. kwasu octowego, antybiotyków) i biomasy (np. drożdży).

8. Wymień procesy stosowane do wydzielania i oczyszczania produktów biosyntezy w zależności od ich zasadniczej funkcji.

Lp	Zasada procesu	Metody
1	Wydzielanie i koncentracja w układzie ciecz-ciało stałe	Metody mechaniczne - Filtracja - Ultrawirowanie - Krystalizacja - Sedymentacja
		Metody membranowe - Membrany ciekłe - Mikrofiltracja - Ultrafiltracja - Odwrócona osmoza - Perwaporacja - Elektrodializa
		Metody oparte na wykorzystaniu prądu elektrycznego - Elektrofiltracja - Wydzielanie elektromagnetyczne - Techniki elektroforetyczne - Wydzielanie elektrostatyczne
2	Wydzielanie i koncentracja w układach równowagowych wielofazowych	Metody ekstrakcji: - Ekstrakcja w układach ciecz-ciecz - Ekstrakcja w układzie ciała stałe-ciecz (ługowanie) - Ekstrakcja płynami nadkrytycznymi - Układy dwufazowe
		Metody termiczne - Destylacja - Suszenie - Odparowanie - Liofilizacja
		Inne: - Absorpcja - Adsorpcja - Techniki chromatograficzne - Precypitacja - Wymiana jonowa - Frakcjonowanie piany

Wydzielanie biomasy oraz bioproduktów z płynów pohodowlanych

Niezależnie od tego, czy interesujący nas produkt jest wewnątrz- czy zewnątrzkomórkowy, pierwszym etapem jego pozyskiwania jest wydzielenie z płynu pohodowlanego biomasy. Zasadą może być również podzielenie płynu pohodowlanego na biomasę, składniki nierozpuszczalne i supernatant.

Metody wydzielania biomasy możemy podzielić następująco:

- Wirowanie – wirówki dekantacyjne, samooczyszczające się, wirówki dyszowe wykorzystywane wówczas, gdy różnice gęstości rozdzielanych substancji są małe

- Filtracja oraz mikrofiltracja przy rozdziale substancji o niewielkich różnicach w wielkości cząstek

- Sedymentacja lub flokulacja, stosowane zwykle wówczas, gdy różnice w gęstości komórek i medium, z którego się je wydziela, są duże

- Flotacja

- Koagulacja

Wirowanie

W wielu procesach biotechnologicznych preferuje się wykorzystywanie różnego typu wirówek, głównie ze względu na możliwość prowadzenia procesów ciągłych oraz ich automatyzację, mniejsze rozmiary wykorzystywanych urządzeń w porównaniu np. z filtrami, a także łatwość mycia, w tym zastosowanie systemu CIP (ang cleaning in place). Do celów biotechnologicznych są stosowane wirówki umożliwiające osiągnięcie wzrostu siły grawitacji rzędu 14000g (g – przyspieszenie ziemskie). Dzięki ultrawirówkom można osiągnąc rozdział składników przy sile grawitacji 400 000g.

Wirówki są stosowane nie tylko do wydzielania części stałych z fazy ciekłej, lecz także do rozdzielania w układach ciecz-ciecz oraz ciecz-ciecz-ciało stałe

Filtracja – jest procesem znacznie mniej energochłonnym, ale też mniej efektywnym niż wirowanie. Często w celu opóźnienia blokowania filtru osadem bądź przedłużenia jego przydatności do użycia stosuje się filtrację wstępną. Prefiltrację prowadzi się w celu usunięcia dużych cząstek stałych określonej wielkości, a niekiedy także sterylizacja, klarowanie i inne.

Filtracja generalnie może się odbywać na zasadzie filtracji typu osadowego (ang dead-end) oraz membranowej filtracji dynamicznej (ang cross-flow)

Mikrofiltracja – jest metodą separacji zawiesin przy użyciu membran porowatych. Pory w membranach do mikrofiltracji są względnie duże (0,2-10μm) co powoduje, że już przy niewielkim ciśnieniu (0,1-0,3 Mpa) przepływ jest duży i wynosi od kilku do kilkunastu m³/(m²*h). Ze względu na porowatość membran stosowanych w procesie mikrofiltracji metoda ta w biotechnologii znalazła zastosowanie do wydzielania biomasy oraz wyjaławiania np. pożywek i piwa. Stosując metody mikrofiltracji w zależności odpotrzeb można prowadzić procesy ciągłe w celu uzyskania biomasy lub metabolitów zewnątrzkomórkowych.

Inne metody wydzielania biomasy

Do nowatorskich metod wydzielania biomasy mikroorganizmów, nad którymi są prowadzone intensywne prace badawcze, należą metody powinowactwa i dielektroforezy. Podstawą metod biospecyficznych czy też bazujących na procesach powinowactwa jest oddziaływanie materiału biologicznego (głównie białek) ze specyficznymi ligandami. Proces biospecyficznego wydzielania biomasy składa się z trzech etapów: adsorpcji, przemywania i elucji oraz desorpcji biomasy.

Metody dielektroforetycznej separacji komórek polegają na wykorzystaniu niejednorodnego, wysokiej częstotliwości zmiennego pola elektrycznego. W tych warunkach komórki uzyskują moment dipolowy zależny od częstotliwości pola elektrycznego. Polaryzacja komórek zależy od ich budowy, stanu fizjologicznego, rodzaju, składu i budowy membrany zewnętrznej oraz struktur wewnątrzkomórkowych i powoduje oddziaływanie między komórkami znajdującymi się pod wpływem działania zmiennego pola elektrycznego. Wynikiem różnej polaryzacji komórek są oddziaływania między nimi, uzależnione także od rodzaju środowiska, w którym się znajdują.

Ruch komórek w polu elektrycznym z różną szybkością oraz w różnym kierunku, jest podstawą ich wydzielania oraz segregacji. Dzięki zastosowaniu tej metody możliwy był rozdział żywych i martwych drożdży Saccharomyces cerevisiae, bakterii Micrococcus luteus oraz komórek roślinnych. Proces prowadzono w specjalnie skonstruowanej komorze, a rozdział komórek był wynikiem oddziaływania pola elektrycznego oraz wymuszonego kierowanego przepływu komórek.

Perwaporacja – metoda porwaporacji polega na realizacji przepływu nadawy z jednej strony nieporowatej, liofilowej cienkiej membrany i odparowaniu penetrantu z drugiej strony membrany, gdzie najczęściej przepływa gaz, bądź na stosowaniu podciśnienia.

Proces perwaporacji jest więc związany z przemianą fazową oraz transportem masy przez membranę. Siłą napędową procesu jest różnica potencjałów składników chemicznych po obu stronach membrany, wynikająca z różnicy ich ciśnień. Selektywność rozdziału z zastosowaniem perwaporacji polega natomiast na różnicy rozpuszczalności składników nadawy w membranie oraz różnicy w szybkości dyfuzji przez membranę.

W procesie perwaporacji stosuje się najczęściej membrany hydrofilowe, wykonane np. z polimerów alkoholu winylowego lub octanu celulozy, oraz hydrofobowe, wykonane np. z polichlorku winylu, polietylenu, polidimetylosiloksanu lub polipropylenu.

Metoda perwaporacji doskonale zdaje egzamin podczas izolacji składników lotnych (np. kwasów organicznych) z płynu hodowlanego bądź składników smakowo-zapachowych, odwadniania rozpuszczalników organicznych. Szczególnie interesujące są zastosowania perwaporacji w usuwaniu alkoholu bądź jego odwadnianiu, co ma zastosowanie zarówno podczas prowadzenia fermentacji alkoholowej (tzw fermentacja ekstraktywna), jak i podczas produkcji piwa, wina oraz wspomnianego już wcześniej alkoholu bezwodnego.

Ekstrakcja klasyczna

Ekstrakcja polega na usuwaniu, wydzielaniu składników z materiału występującego w postaci stałej lub ciekłej, rozpuszczalnych w rozpuszczalniku nie mieszającym się z surowcem. Ekstrakcja może więc odbywać się w układzie ciało stałe-ciecz oraz ciecz-ciecz, tj. faza wodna-faza wodna oraz faza organiczna-faza wodna.

Rozpuszczalniki stosowane w procesie ekstrakcji powinny być nietoksyczne i charakteryzować się dodatkowo selektywnością, łatwością odzyskiwania, odpowiednią gęstością, małą rozpuszczalnością w wodzie, wysokim współczynnikiem podziału, powinny być także chemicznie obojętne, stabilne, przyjazne środowisku, niewybuchowe, niepalne i przede wszystkim tanie.

W realizacji procesów biotechnologicznych główną rolę odgrywa ekstrakcja w układach dwufazowych: faza wodna-faza rozpuszczalnika organicznego oraz faza wodna-faza wodna. Antybiotyki są wydzielane z płynu pohodowlanego dzięki ekstrakcji z zastosowaniem octanu butylu bądź anylu. Penicylina w zależności od warunków może występować w postaci kwasu bądź soli. Zmieniając kwasowość środowiska można sprawiać, że w środowisku kwaśnym występuje forma kwasowa penicyliny, która jest lepiej rozpuszczalna w fazie organicznej, a w środowisku zasadowym sól, która jest rozpuszczalna w wodzie. Uwzględniając te właściwości opracowano metodę ekstrakcji i reekstrakcji penicyliny kontrolowaną odczynem fazy wodnej i organicznej. Tego rodzaju postępowanie prowadzi do 50-100-krotnego zatężenia antybiotyku.

Ekstrakcja płynami w stanie nakrytycznym

Podstawą realizacji procesu jest możliwość uzyskania w sposób bezpieczny i przyjazny środowisku płynów określanych jako nadkrytyczne. Płyny nadkrytyczne charakteryzują się dużymi odwracalnymi zmianami gęstości, co powoduje zmiany zdolności rozpuszczania różnych substancji.

Adsorpcja – polega na interakcji (oddziaływaniu) sił van der Waalsa, momentu dipolowego) między składnikami mieszaniny a powierzchnią stałą adsorbentu. Metoda adsorpcji często jest przyrównywana do metod chromatograficznych, jednak znacznie od nich prostsza, mniej kosztowna, lecz jednocześnie znacznie mniej efektywna.

Doskonalenie metody adsorpcji doprowadziło do opracowania metody otrzymywania żywic pozbawionych grup funkcyjnych, które wiążą antybiotyki (np. cykloheximid) na zasadzie adsorpcji. Metoda adsorpcji na węglu aktywnym jest stosowana do wydzielania rozpuszczalników: acetonu, etanolu, a także do usuwania niekorzystnie wpływających na jakość uzyskanych produktów substancji barwnych.

Krystalizacja – jest to proces wydzielania fazy stałej wskutek łączenia się jonów lub cząsteczek w siatkę krystaliczną. Warunkiem zaistnienia krystalizacji jest przesycenie roztworu, które uzyskuje się przez odparowanie rozpuszczalnika, chłodzenie roztworu, dodanie do roztworu substancji wiążących wodę lub zmniejszających rozpuszczalność rozpuszczonego składnika. Przez krystalizację z płynu pohodowlanego można wydzielać aminokwasy i kwasy organiczne. Bezpośrednią krystalizację metabolitów z płynu hodowlanego można prowadzić tylko wówczas, gdy składniki pożywki są słabo zabarwione i nie zawierają dużych ilości substancji balastowych.

Wymrażanie

Kriokoncentracja (wymrażanie) jest powszechnie stosowana do zatężania i odsalania roztworów i polega na przeprowadzeniu przemiany fazowej wody w lód, a następnie jego wydzieleniu. Istotny wpływ na przebieg procesu kriokoncentracji ma głębokość i szybkość wymrożenia wody oraz zależność szybkości wymiany ciepła od czasu zamrożenia, co ma decydujący wpływ na wielkość powstających kryształów lodu. Ten parametr z kolei oddziałuje na jakość uzyskanego materiału biologicznego oraz straty substancji rozpuszczonych, które adsorbują się na kryształach lodu.

Kriokoncentracja jest metodą tańszą niż odparowanie próżniowe i ma szczególne zastosowanie przy otrzymywaniu preparatów enzymatycznych dużej czystości.

Odparowanie próżniowe

Ze względu na wspomnianą już kilkakrotnie małą zawartość bioproduktów w płynach po hodowli mikroorganizmów, nie jest ekonomicznie uzasadnione ich dalsze przetwarzanie bez wstępnej koncentracji. Można to osiągnąć w łatwy i szybki sposób w urządzeniach wyparnych. Ze względu na to, że substancje biologiczne są często termolabilne, proces zagęszczania powinien przebiegać w niskiej temperaturze i w krótkim czasie. Wymagania te powodują, że do zagęszczania substancji termolabilnych biologicznych najlepiej się nadają urządzenia wyparne wirówkowe, w których działanie siły odśrodkowej powoduje szybkie rozprowadzenie cienkiego filmu zagęszczanej mieszaniny. Najlepsze do tego są wyparki wirówkowe typu Centri-Therm oraz Konvap z tym, że te ostatnie nadają się również do odparowywania wody z roztworów bardzo lepkich, gdyż są wyposażone w elementy zeskrobujące koncentrat z powierzchni grzejnych wyparki.

Destylacja – jest procesem polegającym na wykorzystaniu różnic w temperaturach wrzenia składników mieszaniny. Destylacja w procesach biotechnologicznych znajduje zastosowanie jako metoda usuwania rozpuszczalników pozostających w produkcie po procesie ekstrakcji. Dzięki zastosowaniu destylacji jest możliwe otrzymywanie koncentratów witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, wydzielanie tłuszczów, acylogliceroli z mikroorganizmów oraz z mieszanin reakcyjnych po procesie modyfikacji enzymatycznej lipidów, a także odzyskiwanie substancji smakowo-zapachowych.

W celu odzyskania bioproduktów najczęściej stosuje się dystylację prowadzoną przy obniżonym ciśnieniu i w niskiej temperaturze, szczególnie przydatna jest tu destylacja molekularna (cząsteczkowa).

Do grupy metod określanych jako bioseparacyjne, oprócz wspomnianych wcześniej, należą metody, w których zastosowano systemy wielofazowe, strącanie w punkcie izoelektrycznym, wysalanie, strącanie rozpuszczalnikami organicznymi, techniki membranowe, a także bazujące na wytwarzaniu piany.

8. Przedstaw ogólną charakterystykę metod membranowych.

Metody membranowe

Postęp w rozwoju membranowych metod separacji był możliwy dzięki opracowaniu warunków otrzymywania różnego typu membran.

Membrany stosowane do separacji membranowych mogą występować w formie różnych modułów. Dobór odpowiedniego modułu, a wcześniej rodzaju membrany i metody rozdziału, decyduje o skuteczności procesu frakcjonowania składników roztworu.

Metody chromatograficzne

Chromatografia jest powszechnie stosowaną metodą rozdziału i w zależności od ilości materiału poddawanego rozdziałowi określa się ją jako analityczną (10^-9 – 10^-2g), preparatywną (10^-2 – 10²g) i przemysłową (kg). Zasada rozdziałów chromatograficznych polega na różnicowaniu rozdzielanego materiału na podstawie różnych parametrów i właściwości.

Chromatografia jonowymienna

Wykorzystuje się w niej oddziaływanie różnoimiennych ładunków elektrycznych, a w zależności od wymienianych jonów prowadzi się wymianę jonów z wypełnieniami anionowymiennymi (np. DEAE-celuloza, Sephadex, Sepharose, Mono Q) i kationowymiennymi (np. Dowex, Amberlite, karboksymetyloceluloza).

Metoda ta, ze względu na konieczność zmiany warunków procesu (stężenia soli, pH), wymaga zastosowania systemu gradientowego, tzn. takiego, który można uzyskać przy użyciu co najmniej dwóch pomp. Chromatografia jonowymienna jest bardzo często stosowana do rozdzielania różnych form tej samej cząsteczki, charakteryzujących się innymi wartościami punktu izoelektrycznego, jak to ma miejsce np. dla izoform* enzymów

Chromatoogniskowanie

Jest bardzo rzadko stosowaną metodą ze względu na wysokie koszty procesu. Polega ona na wytworzeniu, przy użyciu odpowiednich odczynników, gradientu pH wzdłuż kolumny. Związki amfoteryczne migrują wzdłuż kolumny do miejsca w żelu, w którego obrębie kwasowość środowiska jest równa punktowi izoelektrycznemu cząsteczki.

Metody elektroforetyczne

Zjawisko elektroforezy polega na oddziaływaniu pola elektrycznego na naładowane cząsteczki. Ruchliwość elektroforetyczna rozdzielanych składników jest uzależniona od wielkości cząsteczki, jej punktu izoelektrycznego, siły jonowej, pH, temperatury i struktury otoczenia, w jakim się znajduje (stężenie agarozy bądź poliakryloamidu, azotanu celulozy, bibuły). Obecnie są już produkowane systemy do elektroforezy preparatywnej.

Metody utrwalania bioproduktów

Bioprodukty które chcemy uważać za utrwalone (o przedłużone trwałości), powinny być przechowywane w środowisku o małej aktywności wody. Wymagane jest więc odwodnienie bioproduktów, które – ze względów ekonomicznych – należy prowadzić dwuetapowo. W pierwszym etapie usuwa się wodę, bez zmiany jej stanu fizycznego, metodami opisanymi we wcześniejszych rozdziałach, jak np. wirowanie, filtracja, strącanie. W drugim etapie następuje przemiana fazowa wody zawartej w materiałach biologicznych w wyniku zastosowania zagęszczania, suszenia lub wymrażania. Stan, w którym znajdują się utrwalone, odwodnione komórki mikroorganizmów nazywa się anabiozą, co w skrócie oznacza stan okresowego, odwracalnego zatrzymania funkcji życiowych.

Suszenie rozpyłowe (rozpryskowe)

Suszenie rozpyłowe polega na rozprowadzeniu cieczy w postaci mgiełki drobnych, zdyspergowanych kropli i odparowaniu wody w strumieniu czynnika suszącego. Przy wysokim stopniu dyspersji materiału rozpylonego proces suszenia przebiega prawie natychmiastowo. Dzięki temu stosowanie – jako czynnika suszącego – powietrza o temperaturze 200-250^oC nie powoduje pogorszenia jakości produktu. Zaletą suszenia rozpyłowego jest dobra jakość uzyskiwanych produktów, duża intensywnoć wymiany ciepła, możliwość automatycznego skierowania oraz możliwość prowadzenia procesów ciągłych przy użyciu gazów obojętnych. Wadą tej metody są duże wymiary suszarek rozpyłowych

Suszenie fluidyzacyjne

Złoże fluidalne jest jedną z odmian stanu zawieszenia cząstek stałych w gazach, które w tym wariancie są również czynnikiem suszącym. Dzięki suszeniu w suszarkach fluidalnych jest możliwe regulowanie końcowej wilgotności materiału suszonego, co jest szczególnie ważne dla materiałów kserolabilnych. Suszenie fluidalne charakteryzuje się ponadto dużą intensywnością wymiany ciepła, możliwością prowadzenia jednocześnie suszenia oraz klasyfikacji materiału suszonego pod względem jego wielkości i granulowania, prostotą budowy urządzeń i małymi ich rozmiarami.

Suszenie sublimacyjne

W biotechnologii najbardziej rozpowszechnioną metodą dehydratacji jest sublimacja (liofilizacja), która jest korzystna dla bioproduktów, jeżeli przebiega w niskiej temperaturze i w krótkim czasie dzięki zastosowaniu podciśnienia. Zalety suszenia sublimacyjnego to: możliwość zachowania struktury materiału suszonego, zachowanie substancji lotnych oraz możliwość otrzymania sterylnego produktu bezpośrednio w opakowaniach jednostkowych.

Warunki procesu suszenia sublimacyjnego powinny być ustalone eksperymentalnie dla każdego materiału suszonego, w zależności od jego właściwości fizycznych. Optymalizacja dotyczy zastosowanego podciśnienia oraz temperatury suszenia. Należy przy tym pamiętać, że podczas sublimacji temperatura warstwy zewnętrznej materiału suszonego jest wyższa od temperatury jego wnętrza.

Właściwy proces suszenia, tj. sublimację, poprzedza zamrożenie materiału suszonego. Może się to odbywać na zasadzie wstępnego zamrażania, stosowanego dla substancji o dużej wilgotności początkowej i łatwo pieniących się, lub samozamrażania, które prowadzi się przy bardzo szybkim ochłodzeniu materiału przy obniżonym ciśnieniu.

Dogodne warunki krystalizacji lodu oraz przeciwdziałanie dużemu stężeniu soli osiąga się, stosując glicerol i węglowodany. Prawdopodobny mechanizm oddziaływania glicerolu jest następujący:

- W temperaturze od 0 do -20^oC gliceryna zmniejsza szybkość rozprzestrzeniania krystalizacji, co przyczynia się do tworzenia mniejszych kryształków i podtrzymuje stan przechłodzenia; rozpuszcza ponadto sole, które nie krystalizują wraz z wodą, co prowadzi do zachowania równowagi osmotycznej;

- W temperaturze od -20 do -80^oC reguluje proces krystalizacji i czyni go odwracalnym, eliminując powstawanie roztworów eutektycznych.

Na efektywność procesu suszenia sublimacyjnego istotny wpływ mają procesy wymiany masy.

Stabilizacja aktywności katalitycznej enzymów

Wszystkie przedstawione wcześniej metody utrwalania mogą, oprócz mikroorganizmów, dotyczyć także enzymów – ze szczególnym uwzględnieniem liofilizacji.

Metody utrwalania enzymów muszą również uwzględniać dodatek substancji stabilizujących aktywność enzymów, tzw stabilizatorów nieswoistych, wielocukry, albuminy osocza i inne.

Należy zauważyć, że enzymy są znacznie bardziej stabilne w postaci stałej niż w roztworach i dlatego generalnie przechowuje się je w postaci stałej (jako proszek, kryształy) w temperaturze bliskiej 0^oC. W środowisku wodnym na białko enzymatyczne, zwłaszcza na grupy karboksylowe i aminowe (zmiany konfiguracyjne enzymu), wpływa niekorzystnie polarna cząsteczka wody.

Modyfikacja i standaryzacja cech użytkowych biopreparatów

W celu poprawy efektywności stosowania biokatalizatorów, w przemyśle spożywczym lub farmaceutycznym dąży się do ich wielokrotnego stosowania w tym samym procesie technologicznym. Przykładem postępu w tej dziedzinie jest zastosowanie metody immobilizacji komórek i enzymów.

Immobilizacją nazywa się proces unieruchamiania komórek lub enzymów, zmierzający do ograniczenia ich katalitycznej aktywności do wnętrza systemu biokatalizatora i uniemożliwienia ich przechodzenia do ruchomej fazy unoszącej produkt i substrat. Zastosowanie unieruchomionych biokatalizatorów zwiększa wydajność procesów biologicznych. Wynika to ze zwiększenia gęstości populacji komórek lub skoncentrowania aktywnych białek enzymatycznych, a także z tego, że dzięki zastosowaniu bardzo prostych metod separacji, np. filtracji, można te biokatalizatory oddzielić od produktu i ponownie zastosować w tym samym celu.

Niektóre mikroorganizmy są zdolne do symbiozy z innymi mikroorganizmami tworzącymi matrycę do przyłączania komórek. Zdolności te wykorzystuje się praktycznie w biologicznym oczyszczaniu ścieków czy w tworzeniu błony biologicznej. Znane są przykłady stososowania aglomeratów komórek drożdży w ciągłej produkcji etanolu. Predyspozycje komórek do wzajemnego łączenia się lub przyłączania do powierzchni nośnika można indukować przez zmianę właściwości powierzchni komórki lub nośnika.

8. Opisz liofilizację kultur drobnoustrojów (warunki, zastosowanie)

W biotechnologii najbardziej rozpowszechnioną metodą dehydratacji jest sublimacja (liofilizacja), która jest korzystna dla bioproduktów, jeżeli przebiega w niskiej temperaturze i w krótkim czasie dzięki zastosowaniu podciśnienia. Zalety suszenia sublimacyjnego to: możliwość zachowania struktury materiału suszonego, zachowanie substancji lotnych oraz możliwość otrzymania sterylnego produktu bezpośrednio w opakowaniach jednostkowych.

Warunki procesu suszenia sublimacyjnego powinny być ustalone eksperymentalnie dla każdego materiału suszonego, w zależności od jego właściwości fizycznych. Optymalizacja dotyczy zastosowanego podciśnienia oraz temperatury suszenia. Należy przy tym pamiętać, że podczas sublimacji temperatura warstwy zewnętrznej materiału suszonego jest wyższa od temperatury jego wnętrza.

Właściwy proces suszenia, tj. sublimację, poprzedza zamrożenie materiału suszonego. Może się to odbywać na zasadzie wstępnego zamrażania, stosowanego dla substancji o dużej wilgotności początkowej i łatwo pieniących się, lub samozamrażania, które prowadzi się przy bardzo szybkim ochłodzeniu materiału przy obniżonym ciśnieniu.

Dogodne warunki krystalizacji lodu oraz przeciwdziałanie dużemu stężeniu soli osiąga się, stosując glicerol i węglowodany. Prawdopodobny mechanizm oddziaływania glicerolu jest następujący:

- W temperaturze od 0 do -20^oC gliceryna zmniejsza szybkość rozprzestrzeniania krystalizacji, co przyczynia się do tworzenia mniejszych kryształków i podtrzymuje stan przechłodzenia; rozpuszcza ponadto sole, które nie krystalizują wraz z wodą, co prowadzi do zachowania równowagi osmotycznej;

- W temperaturze od -20 do -80^oC reguluje proces krystalizacji i czyni go odwracalnym, eliminując powstawanie roztworów eutektycznych.

Na efektywność procesu suszenia sublimacyjnego istotny wpływ mają procesy wymiany masy.

8. Suszenie rozpyłowe – wady i zalety, zastosowanie.

Suszenie rozpyłowe (rozpryskowe)

Suszenie rozpyłowe polega na rozprowadzeniu cieczy w postaci mgiełki drobnych, zdyspergowanych kropli i odparowaniu wody w strumieniu czynnika suszącego. Przy wysokim stopniu dyspersji materiału rozpylonego proces suszenia przebiega prawie natychmiastowo. Dzięki temu stosowanie – jako czynnika suszącego – powietrza o temperaturze 200-250^oC nie powoduje pogorszenia jakości produktu. Zaletą suszenia rozpyłowego jest dobra jakość uzyskiwanych produktów, duża intensywność wymiany ciepła, możliwość automatycznego skierowania oraz możliwość prowadzenia procesów ciągłych przy użyciu gazów obojętnych. Wadą tej metody są duże wymiary suszarek rozpyłowych.

8. Omów otrzymywanie ksantanu.

W technologii ksantanu syntetyzowanego przez Xanthomonas campestris NRRL B-1459 są wyodrębnione dwa zasadnicze procesy jednostkowe (rysunek).

- Biosynteza ksantanu, uwzględniająca przygotowanie inokulum (skosy, hodowla wstrząsana) i fermentację w bioreaktorze (skład pożywki, typ bioreaktora, metoda hodowli, warunki biosyntezy: temperatura, pH, zawartość tlenu rozpuszczonego, mieszanie, kontrola warunków operacyjnych).

Proces jest prowadzony metodą okresową w pożywce z glukozą lub sacharozą (20-40g*dm^-3), azotem (organicznym lub nieorganicznym) i mikroelementami, w 25-34^oC w czasie 40-144h. Bakterie są namnażane w środowisku o pH 7,0 i przy stosunku C:N większym niż w fazie biosyntezy ksantanu, w której w następstwie wydzielania polimeru z komórki kwasowość środowiska obniża się do pH około 5,0. Pożywka jest mieszana z szybkością 200-400 obrotów/min i napowietrzana (0,3-1,5 dm³*dm^-3*min^-1). W drugiej fazie znacznie zwiększa się lepkość cieczy pofermentacyjnej, utrudniając transport tlenu, co wymusza zwiększenie szybkości mieszania do 1000 obr/min celem utrzymania stężenia tlenu powyżej 10% wartości nasycenia.

- Wydzielenie biopolimeru. Wydzielenie ksantanu z cieczy pofermentacyjnej, zawierającej 10-30g*dm^-3 ksantanu, 1-10g*dm^-3 komórek, 3-10g*dm^-3 niewykorzystanych składników odżywczych i innych metabolitów, jest trudnym i kosztownym procesem poprzedzonym pasteryzacją lub sterylizacją w celu inaktywacji komórek i zwiększenia wydajności biopolimeru. Zbyt wysokie temperatury pasteryzacji są często przyczyną termicznej degradacji ksantanu. Ogrzewanie cieczy pofermentacyjnej w odpowiednich warunkach (80-130^oC, pH 6,3-6,9, 10-20min) zmniejsza jej lepkość, a zwiększa rozpuszczalność ksantanu. Ze względu na dużą lepkość cieczy jest ona rozcieńczana wodą, rozpuszczalnikami organicznymi (np. alkoholami, ketonami) lub roztworami alkoholu o małym stężeniu bądź ogrzewana i filtrowana przez filtr o wielkości porów 0,45μm lub wirowana. Ksantan jest wydzielany ze środowiska w wyniku zmniejszenia rozpuszczalności polimeru metodą odparowania lub przy użyciu rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą, np. alkoholi i ketonów o małej masie cząsteczkowej (metanolu, etanolu, izopropanolu, n-butanolu, acetonu), albo wielowartościowych soli, względnie kombinowanego działania tych czynników.

Najczęściej do wstępnego wydzielania i oczyszczania ksantanu jest stosowane wytrącanie niższymi alkoholami (np. izopropanolem lub etanolem w stosunku, odpowiednio, 3 i 2:6 objętości na 1 objętość cieczy pofermentacyjnej) lub acetonem (w stosunku 3 objętości na 1 objętość cieczy).

W reakcji wytrącania ksantanu solami wapnia w środowisku zasadowym, w zakresie pH 8,5-12, solami aluminium lub czwartorzędowymi solami amonowymi powstają nierozpuszczalne sole polimeru, które muszą być przekształcone w rozpuszczalne sole sodu lub potasu. Wytrącanie ksantanu mieszaniną izopropanolu i soli, zwłaszcza dwuwartościowych, skutkuje mniejszym zużyciem alkoholu, np. dodatek NaCl w ilości 1g*dm^-3 zmniejsza jego objętość o 50%.

Po odfiltrowaniu polimeru lub oddestylowaniu rozpuszczalników ksantan jest przemywany mieszaniną izopropanolu i wody, suszony do zawartości 10% wody w procesie okresowym lub ciągłym w warunkach zmniejszonego ciśnienia lub w środowisku gazu obojętnego, mielony i pakowany w opakowania nieprzepuszczające wody.

8. Utrwalanie biologiczne mięs i produktów mięsnych.

Nie mam tego w wykładach

8. Przedstaw etapy produkcji piwa

W biotechnologii żywności woda musi spełniać szczególne wymagania. Na przykład do zalewania ziarna jęczmienia przy wyrobie słodu odpowiednia jest woda o znacznej twardości węglanowej. Obecność kwaśnych węglanów powstrzymuje proces ekstrakcji substancji barwnych ziarna, natomiast jony wapnia sprzyjają kiełkowaniu ziarna. Niekorzystną jest także obecność azotanów III i azotanów V, amoniaku czy też siarkowodoru. Azotany III i V wpływają również niekorzystnie na smak piwa. Woda używana w przemyśle piwowarskim powinna odpowiadać wymaganiom stawianym wodzie do picia. Bardzo ważne jest, aby woda nie zmieniała swoich właściwości fizycznych, chemicznych, mikrobiologicznych i biologicznych przez cały rok.

Woda do celów technologicznych, nazywana ogólnoużytkową, służy w browarach przede wszystkim do chłodzenia i mycia, a także do zasilania kotłów parowych. Ta woda zarówno zimna, jak i gorąca powinna pozostawiać jak najmniej osadu w zbiornikach, sieci rozprowadzającej oraz odbiornikach wody, dlatego też nie może zawierać substancji organicznych i nieorganicznych, większych ilości połączeń żelaza i magnezu, które utleniając się dają wodorotlenki. Taka woda powinna również wykazywać małą twardość przemijającą, co ogranicza tworzenie się kamienia kotłowego, oraz nie powinna powodować korozji wapiennych, a przede wszystkim korozji metali.

(nie mam etapów)

8. Scharakteryzuj klasyfikację biosensorów.

Źródła azotu

Azot stanowi 8-14% s.s. mikroorganizmów. Źródła azotu przyswajalne przez drobnoustroje (dostępne) spełniają zazwyczaj znacznie więcej funkcji niż źródła węgla. Dla wielu drobnoustrojów, szczególnie grzybów niższych, źródłem azotu są sole amonowe, z których to soli siarczan amonu jest najtańszy i najpowszechniej stosowany. Stosowanie wodorotlenku amonu lub amoniaku gazowego w celu regulacji pH jest często praktykowane, ponieważ jednocześnie dostarcza się azot do pożywki. Stosuje się także azotan sodu, często w połączeniu z amoniakiem lub azotanem amonu. Wiele drobnoustrojów utleniających weglowodory korzysta z azotu z powietrza. Dobrym źródłem azotu jest mocznik, jednakże pożywkę z dodatkiem mocznika należy bardzo uważnie sterylizować, gdyż mocznik nie jest tak stabilny w wysokich temperaturach jak sole nieorganiczne.

Chociaż dla wielu mikroorganizmów jest dostępny azot nieorganiczny, jednak te same mikroorganizmy rosną szybciej, gdy w pożywce znajduje się azot związany organicznie. Stąd wiele produktów handlowych stosowanych jako źródło azotu zawiera azot w postaci organicznej.

Mąki. Mąki: sojowa, bawełniana, rzepakowa, kukurydziana oraz mączka rybna są na skalę przemysłową najczęściej stosowanym źródłem azotu w pożywkach. Mączka rybna jest produktem suszonym, ale stosuje się też rybę rozdrobnioną lub odpady rybne. Inne mąki są pozostałościami po ekstrakcji oleju i zawierają białka, węglowodany i małe ilości niewyekstrahowanego tłuszczu.

Mąki są dobrymi źródłami aminokwasów, soli mineralnych i witamin. W stosowaniu mąki na skalę przemysłową przeszkadzają trudności w przygotowaniu pożywki oraz izolacji z niej produktu. Gdy w wodzie rozpuści się mąkę sojową lub kukurydzianą, tworzą się konglomeraty o różnym kształcie i rozmiarze (400-600nm). Pożywkę zawierającą mąkę należy sterylizować w temperaturze 122-127^oC co najmniej przez 16-21 minut.

Mąka sojowa jest stosowana najczęściej. W handlu jest dostępna w trzech rodzajach, w zależności od zawartości tłuszczu:

- Maka pełnotłusta o zawartości 18% tłuszczu;

- Mąka niskotłuszczowa o zawartości 4,5-9% tłuszczu;

- Mąka odtłuszczona o zawartości do 2% tłuszczu.

Białka mąki sojowej zawierają wszystkie niezbędne dla rozwoju drobnoustrojów aminokwasy, przy czym najwięcej jest kwasu glutaminowego, a najmniej metioniny i cysteiny. W mące sojowej występuje 7-10 inhibitorów proteinazy, które można inaktywować już w temp 100^oC. Inhibitory są niepożądane tylko w tych pożywkach, które są traktowane enzymami w toku przygotowywania. Mąka sojowa zawiera również białka odporne na wysoką temperaturę, które hamują wzrost Clostridium perfringens

Mąka sojowa wydaje się najlepszym źródłem azotu w syntezie streptomycyny przez Streptomyces griseus, ale też stosuje się ją w produkcji innych antybiotyków, jak: neomycyna, kapreomycyna i antymycyna. Ponadto mąka sojowa jest stosowana w przemianie steroidów oraz w produkcji podpuszczki mikrobiologicznej.

Mąka z ziaren bawełny. Nazwa handlowa Pharmamedia i Proflo. Obydwa produkty są otrzymywane z zarodków ziaren bawełny po usunięciu puchu bawełnianego; łuskę i olej usuwa się z ziaren w niskiej (Pharmamedia) lub wysokiej (Proflo) temperaturze. Skład mąki przedstawiono w tabeli.

Ważnym składnikiem mąki bawełnianej jest gossypol. Stymuluje on syntezę beta-amfoterycyn oraz działa jako przeciwutleniacz, eliminując inhibitujące działanie utlenionych tłuszczów, które dodaje się jako substancje odmieniające w produkcji antybiotyków i aminokwasów. Powoduje on również zwiększenie wydajności. Obydwie mąki często stosuje się na skalę przemysłową w przygotowaniu pożywek, w produkcji antybiotyków i witamin.

Mąka kukurydziana. Mąka kukurydziana jest stosowana jako źródło azotu w biosyntezie chlorotetracykliny i biomy cyny. Może ona również zastępować namok z kukurydzy w syntezie amylazy przez Bacillus subtilis. W produkcji amylazy glukozowej przez Endomycopsis, proteaz przez Aspergillus oraz tetracykliny makę kukurydzianą stosuje się jako źródło węgla i azotu.

Mąka rzepakowa. Mąkę rzepakową stosuje się jako źródło azotu w procesach fermentacji po jej obróbce lub nieobrobioną. Z powodzeniem stosuje się ją jako składnik pożywki w przemianach steroidów, a jej hydrolizatów używa się w hodowli Candida ittilis

Mąka glutenowa z kukurydzy. Jest to produkt uboczny otrzymywany w procesie mielenia kukurydzy na mokro. Mąkę glutenową używa się w połączeniu z mąką owsianą w biosyntezie antybiotyków. Pojnadto stosuje się jako substytut – namok z kukurydzy w przemianach steroidów

Mączka rybna. Mączkę rybną raczej rzadko stosuje się w procesach fermentacyjnych. Używano jej z powodzeniem zamiast namoku z kukurydzy w produkcji proteazy z Aspergillus terricola. Proteazę stosuje się w przemyśle rybnym do zwiększenia wydajności hydrolizatów rybnych. Handlowa mączka rybna zawiera 55-64% surowego białka, 12% tłuszczu i 4-5% NaCl

Preparaty białek ziemniaka. Białka ziemniaka otrzymuje się podczas procesu ekstrakcji skrobi; są one sprzedawane pod nazwą Alburex. W biotechnologii stosuje się je zamiast mąki sojowej w produkcji enzymów i antybiotyków. Alburex zawiera 75-85% białka w ss Jest dobrze rozpuszczalny w wodzie i ma bardzo dobre właściwości emulgujące.

Namok z kukurydzy. Namok z kukurydzy jest produktem ubocznym otrzymywanym w procesie ekstrakcji skrobi kukurydzianej. Jest stosowany jako źródło azotu w niektórych pożywkach przemysłowych. Zawiera niezbędne aminokwasy, witaminy i sole mineralne. Wadą wyciągów z kukurydzy są duże różnice w zawartości składników. Ta wada często zmusza do wyboru innego surowego materiału jako źródła azotu. Jakość namoku zależy od jakości i siły wzrostu kukurydzy oraz od technologii jego produkcji.

Autolizat drożdżowy i drożdże suszone. Autolizat drożdżowy jest mieszaniną aminokwasów i peptydów, rozpuszczalnych w wodzie witamin, puryn i pirymidyn, sacharydów i soli mineralnych. Autolizaty drożdży otrzymuje się z różnych szczepów drożdży piwowarskich i piekarskich z rodzaju Saccharomyces cerevisiae. Ich skład zależy od szczepu drożdży. Te preparaty są sprzedawane jako roztwory, pasty lub produkty suszone o różnej rozpuszczalności. Autolizaty drożdży otrzymuje się również z drożdży odpadowych z przemysłu piwowarskiego oraz drożdży paszowych hodowanych na hydrolizatach drzewnych lub n-parafinach. Drożdże paszowe są hydrolizowane przez kwasy lub z użyciem kompleksu enzymów litycznych Actinomyces cinerosus, a także za pomocą protosubtyliny i lizosubtyliny. Hydrolizaty drożdży paszowych są stosowane jako źródło azotu lub witamin w różnych przemysłowych pożywkach, często zamiast namoku z kukurydzy.

Drożdże suszone stosuje się w produkcji przemysłowej jako substrat – składnik pożywki zawierający około 6-7% azotu ogółem. Są one bogate w aminokwasy i witaminy.

Hydrolizaty białka. Białka zwierzęce i roślinne są hydrolizowane za pomocą kwasów lub enzymów w celu otrzymania hydrolizatów oferowanych później jako proszek lub roztwór. Najczęściej używa się kazeiny i białek soi. Hydrolizaty enzymatyczne i kwasowe różnią się składem chemicznym. Kazeina hydrolizowana trypsyną zawiera12,9% azotu ogółem i 6,6% azotu aminowego, podczas gdy kazeina hydrolizowana kwasem zawiera 8,3% azotu ogółem i 6,4% azotu aminowego. Dostępne w handlu hydrolizaty kazeiny są stosowane głównie w produkcji farmaceutyków, jak np. w przemianach steroidów, w produkcji L-asparaginazy, toksyn dyfterii, antybiotyków i aminokwasów. W procesach biotechnologicznych najczęściej stosuje się hydrolizaty białek soi.

Z różnych typów mąki są produkowane różne hydrolizaty. Można je stosować jako substraty w połączeniu z odpadami grzybni w produkcji enteromycyny. Kwasowy hydrolizat z mączki z orzeszków ziemnych jest stosowany w produkcji L-lizyny.

Żelatyna. Żelatyna jest ekstrahowana z kości i skór po uprzednim usunięciu tłuszczu i związków mineralnych, głównie fosforowych. Jako źródło azotu w pożywce żelatynę stosuje się w produkcji kolagenozy przez Flavobacterium sp oraz w biosyntezie żelatynazy przez Bacillus mesentericus

Żelatyna nie rozpuszcza się w zimnej wodzie, tylko pęcznieje. W gorącej wodzie rozpuszcza się łatwo, tworząc po oziębieniu żel. Większość handlowych żelatyn ogrzewana powyżej temperatury 100^oC traci zdolność tworzenia żelu. Istnieją jednak gatunki żelatyn, jak np. Difeo, które wytrzymują dobrze jałowienie w temperaturze 117^oC.

Żelatyna nie jest pełnowartościowym białkiem, nie zawiera tryptofanu, zawiera mało tyrozyny i fenyloalaniny, natomiast dużo glicyny i alaniny.

Pozostałe makroelementy. Wszystkie związki organiczne komórki zawierają wodór. Jest on również obecny w wodzie komórki. Bakterie wodorowe i niektóre metanowe mogą wykorzystywać wodór gazowy jako źródło energii.

Tlen, podobnie jak wodór, jest obecny we wszystkich składnikach organicznych komórki i w wodzie komórkowej. Źródła węgla zazwyczaj zapewniają ilość tlenu potrzebną do rozwoju tzw beztlenowców i względnych beztlenowców. Tlen cząsteczkowy O₂ jest niezbędny dla bakterii tlenowych, jednak dla niektórych bakterii tlen jest toksyczny, np. dla Clostridium, Bifidobacterium, bakterii metanowych

Źródłem fosforu dla mikroorganizmów jest zazwyczaj nieorganiczny PO^3-, dodawany do pożywki w postaci fosforanów potasu, sodu, magnezu i amonu. Organicznym źródłem fosforu jest fosforan glicerolu. Zapotrzebowanie na fosfor zwiększa się wraz z postępem fermentacji. Fosfor reguluje:

- Tworzenie się wielu metabolitów drugorzędowych;

- Metabolizm węglowodanów i lipidów;

- Produkcję i wydzielanie wielu kwasów organicznych o znaczeniu przemysłowym, np. kwasu cytrynowego, oraz jest ważnym składnikiem struktury DNA, RNA i ścian komórek bakterii Gram-dodatnich (jako kwasy tejchonowe)

Siarka. Większość bakterii i grzybów może wykorzystywać nieorganiczny SO₄^2-. Dobrym i tanim źródłem siarki jest siarczan (V) amonu. Wyjątkiem są tylko bakterie metanowe, które nie mogą utylizować SO₄^2-, a w pewnych przypadkach może on być nawet inhibitorem. W pożywkach S^2- jest zazwyczaj najlepszym źródłem siarki, chociaż przy zbyt dużych stężeniach wytrąca wiele jonów metali, co prowadzi do deficytu pierwiastków śladowych. Siarka jest także nieorganicznym donorem elektronu w hodowlach wielu bakterii fotosyntetyzujących. Często zamiast siarczanu (V) amonu stosuje się siarczan (V) sodu, ponieważ jest on silnym czynnikiem redukującym, który obniża potencjał oksydoredukcyjny, niezbędny do wzrostu ścisłych beztlenowców. Proces włączania SO­₄^2- do materiału komórkowego jest energochłonny. Większość siarki komórkowej jest obecna w białku, a dokładniej w aminokwasach zawierających siarkę: L-cystynie, L-cysteinie i L-metioninie, które stymulują wzrost drobnoustrojów, gdy są stosowane zamiast SO₄^2-. Duży koszt aminokwasów siarkowych uniemożliwia ich stosowanie w pożywkach w skali przemysłowej.

Potas jest głównym nieorganicznym kationem w komórce. Większość jonów potasu jest związana w rybosomach bakterii prokariotowych. Ponadto jon potasu jest kofaktorem w niektórych enzymach, jest niezbędny w metabolizmie węglowodanów oraz w wielu procesach przenoszenia. Jony K⁺ i inne kationy nieorganiczne jak Na⁺, są bardzo ważnymi regulatorami wzrostu. Jest to spowodowane dążeniem komórki do wchłonięcia jonów K⁺ i Mg²⁺, a wydalenia jonów Na⁺ i Ca²⁺. Chociaż w niektórych drobnoustrojach jony Na⁺ i NH₄ mogą częściowo zamieniać jony K⁺. Źródłem potasu są zazwyczaj sole: K₂SO₄, K₂HPO₄ i KH₂PO₄.

Obecność magnezu jest niezbędna w rybosomach bakterii i grzybów. Magnez jest kofaktorem enzymów i występuje w ścianach komórek oraz w membranach. Źródłem magnezu w pożywkach jest MgSO₄*7H₂O