25. IMMUNOHEMATOLOGIA

Nauka zajmująca się badaniem odpowiedzi immunologicznej na antygeny znajdujące się na elementach morfotycznych i białkach krwi.

UKŁADY GRUPOWE KRWINEK CZERWONYCH

29 układów; 6 kolekcji; 2 serie

Nazwy grup pochodzą od nazwisk osób, u których po raz pierwszy wykryto swoiste przeciwciała (Lewis, Duffy); dawców krwi mających uczulający antygen (Lutheran) lub rzadziej, odkrywców (układ LW)

!!! Układy Rh i MNS są obecne wyłącznie na erytrocytach !!!

Znaczenie praktyczne dla transfuzjologii mają tylko te antygeny, które cechuje duża immunogenność lub częste występowanie, w stosunku do ich naturalnych przeciwciał.

Uczulenie (sensytyzacja) – swoiste połączenie się przeciwciał z antygenami erytrocytu.

Immunogenność antygenu zależy od :

• Chemicznej budowy antygenu (glikoproteiny i lipoproteiny silniej pobudzają przeciwciała biorcy, niż same polipeptydy)

• Gęstości determinant antygenowych na powierzchni krwinki czerwonej

Antygeny grupowe krwi mogą pełnić funkcje:

• Kanałów i transporterów

• Cząsteczek adhezyjnych i receptorów

• Regulatorów dopełniacza

• Enzymów

• Polisacharydów

• Glikoforyn

Podstawowe pojęcia w immunohematologii:

AGLUTYNOGEN antygen błony komórkowej erytrocytu wywołujący aglutynację

AGLUTYNINA przeciwciało przeciwko aglutynogenowi

AUTOPRZECIWCIAŁA przeciwciała reagujące z antygenami obecnymi na komórkach danej osoby

PRZECIWCIAŁA NATURALNE IgM, obecne u każdego człowieka bez uprzedniego kontaktu z antygenem; obecne we krwi przez całe życie, nawet u osób nie mających swoistego dla nich antygenu

P. ODPORNOŚCIOWE IgG, organizm produkuje je w wyniku odpowiedzi na antygeny, które znalazły się w krążeniu (np. po transfuzji)

P. REGULARNE występują u wszystkich osobników danej populacji (np. anty-AB0)

P. NIEREGULARNE u niektórych osobników, nie mających danego antygenu (np.anty-Lewis)

P. KOMPLETNE IgM, najczęściej naturalne, silnie aglutynujące krwinki czerwone; pentametry – łączą kilka krwinek na raz

P. NIEKOMPLETNE IgG, nie aglutynują krwinek bezpośrednio, lecz tylko je opłaszczają

P. ZIMNE reagują antygenem w temp. 4^oC i w temp. pokojowej

P. CIEPŁE optymalna temp. ich reakcji wynosi 37^oC

UKŁAD GRUPOWY AB0

Układ AB0

• Antygeny obecne są na wszystkich komórkach organizmu oprócz neuronów. Występują one także u małp naczelnych.

• Polisacharydy.

• Pojawiają się w szóstym tygodniu życia płodowego; pełna ekspresja → 6-18 miesięcy po urodzeniu. Dlatego grypę krwi dziecka ustala się ostatecznie po ukończeniu przez nie 2 lat.

• Genu układu AB0:

• Hh – 19 chr.

• AB0 – 9 chr.

• Sese – 19 chr.

• A i B są dominujące, 0 jest genem recesywnym

• Aktywność H jest niezbędna do utworzenia antygenów H, A i B. Produkt genu H przeprowadza pierwszy etap syntezy antygenów ukł. AB0

• Antygen H występuje w największym stężeniu na erytrocytach osób z grupą krwi 0.

• Występowanie jednocześnie dwóch alleli h determinuje bardzo rzadko występującą gr. krwi Bombaj – mimo obecnych genów A/B nie są wytwarzane antygeny.

• Gr.0 – synteza antygenów zatrzymuje się na etapie wytworzenia łańcucha H.

• Gr. A/B – synteza antygenów postępuje na początku analogiczne. W końcowych etapach „rozdziela” się A – ostatni cukier → N-acetylo-D-galaktozamina

B – ostatni cukier → D-galaktozamina

• Geny Sese są odpowiedzialne za występowanie wolnych form antygenów AB0 we wszystkich płynach ustrojowych, zarówno fizjologicznych jak i patologicznych (wyjątek – płyn m-r)

• SeSe, Sese – wydzielacze , możemy oznaczyć ich grupę krwi badając, np. ślinę

• Grupa A jest wysoce polimorficzna. Wyróżniamy A₁, A₂ (80% ludzi); A₃, A_int, A_X, A_m (20% ludzi)

• Różnicowania między A₁ i A₂ dokonujemy przeprowadzając badanie tzw. Dolichotestem (aglutynacja antygenów A₁)

Przeciwciała układu AB0

• Jedyny układ w obrębie, którego znajdują się we krwi regularne, naturalne przeciwciała przeciwko antygenom nieobecnym na własnych krwinkach.

• Aglutyniny ukł. AB0 aktywują dopełniacz wywołując wewnątrznaczyniową hemolizę, co w przypadku transfuzji krwi niezgodnej grupowo może mieć poważne konsekwencje.

• Naturalne przeciwciała wykorzystuje się do określania grupy krwi w ukł. AB0

• R. aglutynacji krwinek osoby badanej z surowicami wzorcowymi: anty-A i anty-B

• R. między surowicą badanego a wzorcowymi krwinkami grup A, B i 0

GRUPA KRWI	RODZAJ ANTYGENU W PŁYNIE USTROJOWYM
A	A, H
B	B, H
AB	A, B, H
0	H

• Przeciwciała anty-H występują u wszystkich osób, które nie mają łańcucha H na powierzchni erytrocytu (nosiciele antygenu A₁ i/lub B oraz posiadacze grupy Bombaj [0_h ])

Osoby z grupą krwi:

• „0” częściej zapadają na chorobę wrzodową żołądka i dwunastnicy. Częściej ulegają zakażeniom przez Yersinia pestis, maja również większą skłonność do krwawień.

• „A” częściej chorują na niektóre nowotwory, np. żołądka, ślinianek. Są bardziej podatni na zakażenie wirusem ospy prawdziwej oraz mają większa skłonność do zakrzepicy.

	CHARAKTER PRZECIWCIAŁ
	NATURALNE
KLASA	IgM
SPOSÓB POWSTAWANIA	Bez kontaktu z antygenem
CZAS POWSTAWANIA	Zaraz po urodzeniu, największe st. 5-10 r.ż, później maleje. U osób starszych może być zbyt małe by wywołać aglutynację.
TRANSPORT PRZEZ ŁOŻYSKO	NIE
WYWOŁANIE AGLUTYNACJI	TAK
AKTYWACJA DOPEŁNIACZA	TAK
OPTYMALNA TEMP.REAKCJI	4^oC

Układ grupowe Rh

• Najbardziej złożony układ grupowy krwinek czerwonych człowieka

• 49 antygenów w jego obrębie

• 5 głównych antygenów: D, C, E, c, e

• Determinanty antygenowe są zlokalizowane w dwóch białkach: RhD → antygen D; RhCE → antygeny C, c, E, e

• Białka Rh tworzą w błonie krwinki kompleks z glikoproteiną RhAG

• Rh stanowi jednostkę enzymu transportującego substancje (NH₃, CO₂, O₂) przez bł. erytrocytu

• Nierozpuszczalne

• Występują tylko na bł. erytrocytów

• Pojawiają się ok. 6 tyg. życia płodowego i od samego początku wykazują dużą immunogenność, pod tym względem antygen D ustępuje miejsca tylko antygenom A i B. dlatego osobniki mające na pow. erytrocytów antygen D nazywa się Rh+, bez względu na obecność pozostałych antygenów

• Ok. 20% ludzi jest Rh- (nie reagują z surowicą anty-D), maja one genotyp d

• Przeciwciała anty-Rh należą do klasy IgG i powstają dopiero w wyniku uczulenia w czasie ciąży lub po transfuzji krwi niezgodnej w tym układzie PRZECIWCIAŁA ODPORNOŚCIWE

• Przeciwciała te często wykrywa się u osób z niedokrwistością autoimmunohemolityczną

Układ Kell

• Poza krwinkami antygeny tego układu występują również na komórkach Sertolego, w mózgu, w śledzionie, w m.szkieletowych.

• Antygeny tego układu aktywują endotelinę 3 – substancję silnie kurczącą naczynia

• Stosunkowo duża immunogenność, ustępująca antygenowi D

• Przeciwciała anty-K powstają w czasie ciąży lub po przetoczeniu niezgodnej krwi, są to p-ciała odpornościowe

• Niedobór antygenów Kell powoduje zespół McLeoda (akantocytoza, skrócenie przeżycia erytrocytów, spadek masy mięśniowej, drgawki, kardiomiopatia)

Układ Duffy

• Antygeny Fy^a i Fy^b

• Dużo mniej immunogenne niż antygeny K

• Przeciwciała ant-Fy → odpornościwe, klasy IgG

• Antygen Fy stanowi receptor dla zarodźca malarii Plasmodium vivax, dlatego też fenotyp Fy(a-, b-) występuje częściej u rasy czarnej

• Antygen Fy jest receptorem dla chemokin IL-8 i CCL (MCP) DARC (Duffy antygen receptor for chemokines)

Układ Kidd

• Najprostszy układ grupowy na powierzchni krwinek czerwonych

• Funkcją białek tego układu jest transport mocznika

• Antygeny nie są zbyt immunogenne, ale odpowiedzialne za ok. 1/3 wszystkich przypadków późnych reakcji hemolitycznych występujących po transfuzji

Układ Lewis

• Determinanty antygenowe powstają poza krwinkami czerwonymi, ulegają absorpcji na pow. erytrocytu dopiero po porodzie (nie mogą być przyczyna konfliktu serologicznego)

• Przeciwciała anty-Le należą do klasy IgM, wywołują hemolizę w warunkach in vitro.

• In vivo, przy przetoczeniu niezgodnej krwi, obecne w osoczu rozpuszczalne antygeny wiążą przeciwciała i zapobiegają ich łączeniu się z erytrocytami.

• Przed przetoczeniem krwi dobrze jest podać osocze zawierające rozpuszczalne antygeny Lewis.

NABYTE ODMIANY ANTYGENÓW GRUPOWYCH KRWI

• W chorobach rozrostowych krwi oraz w czasie ciąży krwinki osób z grupą A i B mogą się zachowywać jak erytrocyty osób z grupą krwi 0. Jest to skutkiem zmniejszenia aktywności pewnej transferazy i odsłonięcia antygenu H, np. w przewlekłej białaczce szpikowej. Zmiany te mogą ulec odwróceniu w okresie remisji nowotworu.

• W przypadku guzów litych może dojść do pozornej zmiany grup krwi, ponieważ mimo niezmienionego składu antygenowego krwinki guza wydziela duże ilości rozpuszczalnych antygenów zakłócających typowanie

• Niektóre bakterie (E.coli, Clostridim tertium, Proteus vulgaris)wytwarzają deacylazę zmieniającą cukier antygenu A na B i tym samym zmieniając grupę krwi z A na B.

• Zmianę antygenów grupowych krwi obserwuje się po przeszczepieniu szpiku, gdy dawca różnił się od biorcy w układzie AB0

• Biorcy wątroby z gr.0 od dawcy z gr.A, B lub AB po zabiegu mają na swoich krwinkach, przejściowo, antygeny A i/lub B. Taka zmiana możliwa jest na 2 sposoby:

1. Wątroba uwalnia duże ilości substancji grupowych neutralizujących krążące aglutyniny i opłaszczające erytrocyty biorcy

2. Wydziela do krążenia odpowiednie transferazy

• Starzejące się krwinki tracą ze swojej pow. reszty kw. sjalowego, a w ich bł. komórkowej pojawiają się nowe antygeny rozpoznawane przez krążące przeciwciała „naturalne”, oraz indukujące powstawanie przeciwciał „odpornościowych” IgG.

Krwinki opłaszczone takimi przeciwciałami ulegają immunofagocytozie w śledzionie i wątrobie MECHANIZM ELIMINACJI Z KRĄŻENIA STARYCH KRWINEK

IMMUNIZACJA ANTYGENAMI GRUPOWYMI KRWI

Powikłania potransuzyjne

• OSTRE – objawiające się w ciągu kilku godzin od przetoczenia

• Najczęściej występujące – odczyny gorączkowe bez hemolizy, spowodowane obecnością przeciwciał anty-HLA niszczących leukocyty dawcy i indukujących wydzielanie cytokin (TNF, IL-6)

• Przyczyną ww. reakcji jest zanieczyszczenie przetaczanego materiału krwinkami białymi

• Hemoliza – rozpad erytrocytów, wywoływany przy udziale 2 mechanizmów: wewnątrznaczyniowego i pozanaczyniowego

• H.wewnątrznaczyniowa – proces patologiczny, będący skutkiem aktywacji dopełniacza

• H.pozanaczyniowa – proces fizjologiczny (niszczenie starzejących się krwinek) lub patologiczny; zachodzi w śledzionie i wątrobie; makrofagi niszczą krwinki wydzielając enzymy trawiące błonę erytrocytów a także w procesie fagocytozy

• Hemolizę indukują obecne w osoczu przeciwciała IgG i IgM, które opłaszczają obce erytrocyty

• Aktywacja dopełniacza i kom. żernych

• Opisane reakcje mogą prowadzić do stanu zagrażającego życiu!!!, np. po przetoczeniu krwi niezgodnej w ukł. AB0

• Objawy już po kilku minutach od rozpoczęcia przetaczania (gorączka, hipotonia, duszność, ból pleców, niewydolność nerek) – bezpośrednie zagrożenie życia

• Niekardiogenny obrzęk płuc – przeciwciała anty-HLA kl.I i II wiążą się z błoną neutrofilów aktywują dopełniacz. Prowadzi to do tworzenia się mikroagregatów granulocytów, które blokują naczynia włosowate w płucach. Uwalniane z komórek mediatory oraz czynniki pochodzące z aktywacji dopełniacza powodują wzrost przepuszczalności naczyń, co prowadzi do obrzęku płuc i niewydolności oddechowej

• PÓŹNE – zachodzą w ciągu kilku dni lub tygodni

• Wywoływane przez przeciwciała przeciwko antygenom Kidd, Rh, Kell, Duffy

• Plamica - występuje gł. u starszych kobiet, wieloródek. Spowodowana obecnością przeciwciał przeciw antygenom zlokalizowanym na płytkach. Małopłytkowość i krwawienia.

• GVH – u biorców z niedoborami odporności, u noworodków i biorców od dawców spokrewnionych. Wywołują ją immunokompetentne limf.T dawcy.

W przeciwieństwie do GVH po przeszczepie szpiku, obarczona dużą śmiertelnością

Zapobieganie – napromienianie krwi przed przetoczeniem.

MECHANIZM POWIKŁANIA	RODZAJ POWIKŁANIA
	OSTRE
PODŁOŻE IMMUNOLOGICZNE	Odczyny gorączkowe Hemoliza R. alergiczne Potransfuzyjne uszkodzenie płuc
NIEZWIĄZANE Z ODP. IMMUNOLOG.	Zakażenie bakteriami Hemoliza Zatrucie cytrynianem Niewydolność serca

Konflikt serologiczny matczyno – płodowy (choroba hemolityczna noworodków)

• spowodowana immunizacją matki antygenami znajdującymi się w krwinkach płodu

• warunek – niezgodność serologiczna między matką i ojcem, oraz odziedziczenie przez dziecko antygenów ojcowskich

• matka może być uczulona nie tylko antygenami obecnymi na erytrocytach, ale również tymi z płytek.

KONFLIKT W UKŁADZIE Rh

• antygen D występuje na erytrocytach dziecka, brak go na erytrocytach matki

• immunizacja w wyniku przeniknięcia krwinek płodu do krwioobiegu matki ( poronienie, ciąża pozamaciczna, ręczne wydobycie łożyska, cięcie cesarskie lub w trakcie prawidłowo przebiegającej ciąży)

• immunizacja może mieć miejsce również w wyniku przetoczenia niezgodnej krwi, stosowania wspólnych igieł i strzykawek przez narkomanów.

• Odpowiedź na antygen jest powolna:

POWSTANIE PRZECIWCIAŁ IgM (nie przechodzą przez łożysko)

6-40 tyg.

KONWERSJA IgM DO IgG1 i IgG3 (przechodzą przez łożysko)

USZKODZENIE ERYTROCYTÓW PŁODU - HEMOLIZA

• Prowadzi do: niedokrwistości, niedotlenienia, pozaszpikowego krwiotworzenia i uszkodzenia wielonarządowe zagrożenie życia dziecka !!!

• Rzadko dochodzi do istotnych komplikacji w czasie pierwszej ciąży, dużo większe zagrożenie stanowią kolejne, ponieważ każda kolejna ciąża stymuluje wytwarzanie przeciwciał i nasila objawy choroby u każdego kolejnego dziecka Rh+

KONFLIKT W UKŁ. AB0

• 20-25% ciąż (10% objawy)

• Dotyczy głównie układu: matka – 0, dziecko – A₁

• Łagodniejszy przebieg niż konflikt Rh (pełne ukształtowanie antygenów na krwinkach płodu – krótko przed porodem; rozproszone w płynach biol. antygeny neutralizują przeciwciała matki)

• Równoczesny konflikt AB0 i Rh łagodzi lub zapobiega chorobie hemolitycznej noworodka. „Naturalne” przeciwciała matki niszczą wnikające krwinki płodu, ograniczając kontakt antygenu D z ukł. immunologicznym.

KONFLIKT W POZOSTAŁYCH UKŁADACH

• Choroba hemolityczna występuje bardzo rzadko

• P-ciała anty-Kell powodują niedokrwistość wskutek supresji krwiotworzenia, nie poprzez hemolizę

• Dziewczynkom i kobietom w wieku rozrodczym przetacza się krew zgodną w ukł. Kell

Profilaktyka choroby hemolitycznej noworodków

• Pozajelitowe podanie matce immunoglobuliny anty-D, w ciągu 72h po porodzie lub poronieniu

• Nieskuteczna i nie powinna być stosowana u kobiet, u których już wystąpiła immunizacja

• Mechanizmy działania IgG anty-D:

• Maskowanie antygenów D na erytrocytach

• Hamowanie odpowiedzi limfocytów B (działa na hamujący receptor na ich powierzchni)

• Pobudzenie komórek żernych i usunięcie obcych krwinek w śledzionie lub wątrobie

• Działania te podejmuje się również po omyłkowym podaniu Rh- biorcy, Rh+ krew; w leczeniu małopłytkowości wywołanej obecnością autoprzeciwciał.

• Globulinę anty-D pozyskuje się z osocza wieloródek po przebytym konflikcie lub od Rh- mężczyzn celowo uczulanych antygenem D.

PATOGENEZA KONFLIKTU

HEMOLIZA ERYTROCYTÓW PŁODU

NIEDOKRWISTOŚĆ HIPERBILIRUBINEMIA

HEMOPOEZA USZKODZENIE ŻÓŁTACZA ŻÓŁTACZKA JADER POZASZPIKOWA ŚRÓDBŁONKA PODSTAWY MÓZGU

NIEWYDOLNOŚĆ UTRATA USZKODZENIE WĄTROBY BIAŁKA MÓZGU

HIPOALBUMINEMIA

OBRZĘK PŁODU

PODSTAWOWE TECHNIKI IMMUNOHEMATOLOGICZNE

Stosowane w celu ustalenia przyczyny lub uniknięcia ww. powikłań:

• Typowanie (oznaczanie gr. krwi) – ukł. AB0 i Rh, czasem Kell

• Próba krzyżowa (reakcja między krwinkami dawcy a surowicą biorcy)

Test aglutynacji

• Identyfikuje antygeny grupowe i skierowane przeciwko nim przeciwciała

• Krwinki mające na swojej pow. szukany antygen ulegają związaniu przez obecne we wzorcowej surowicy swoiste przeciwciało – tworzy się aglutynat

• Istotna jest lokalizacja antygenów na krwince oraz ich liczba jak również proporcja między przeciwciałami i antygenami (optymalna 1ant./80 przeciwciał)

• pH (7,5)

• temperatura (IgG - 37^oC, IgM – 4^oC)

• erytrocyty mają normalnie ładunek ujemny, jednak w środowisku zawierającym elektrolity, przyciągają kationy i powstaje otoczka o ładunku dodatnim. Wielkość tego ładunku określamy jako „potencjał zeta”. Odpowiada on grubości warstwy kationów otaczającej krwinkę. Oczywistym jest fakt, że krwinki naładowane jednoimiennie odpychają się. Z uwagi na to, w fizjologicznym roztworze NaCl p-ciała IgG (monomer) nie są w stanie połączyć antygenów na sąsiednich krwinkach – NIEKONPLETNE AGLUTYNINY , natomiast IgM (pentamer) są na tyle duże, że mogą połączyć kilka krwinek powodując ich aglutynację – KOMPLETNE AGLUTYNINY

• istnieje wiele metod służących obniżaniu potencjału zeta (np.roztwór koloidowy, protamina, enzymy proteolityczne, środowisko o słabej sile jonowej)

• próbę zgodności wykonuje się jednocześnie dwiema metodami:

1. metoda LEN – potwierdza lub wyklucza obecność, w surowicy biorcy przeciwciał, które mogłyby zniszczyć krwinki dawcy

2. test antyglobulinowy pośredni w modyfikacji LISS

Test antyglbulinowy (test Coombsa)

• wykrywa niekompletne przeciwciała oraz składniki dopełniacza związane z erytrocytami

• stusujemy surowicę antyglobulinową uzyskaną od zwierząt immunizowanych ludzką globuliną

• taka surowica zwierzęca zawiera przeciwciała przeciwko ludzkiej IgG i składowej C3b dopełniacza

• przeciwciała surowicy reagują z globulinami zaadsorbowanymi na erytrocytach i powodują ich aglutynację

Bezpośredni test antyglobulinowy

• wykrywa p-ciała lub fr. C3b dopełniacza opłaszczające erytrocyty, już w org. badanej osoby (in vivo)

• po wyizolowaniu erytrocytów z krwi dodaje się surowicy antyglobulinowej (p-ciała anty IgG oraz anty-C3b) aglutynacja

• wykonujemy go:

• Przy podejrzeniu choroby hemolitycznej noworodków

• U biorców krwi, gdy wystąpią powikłania

• Podejrzewając niedokrwistość autoimmunohemolityczną

Pośredni test antyglobulinowy

• Identyfikuje antygeny i p-ciała grupowe w transfuzjologii

• Wykrywa wolne, niekompletne p-ciała IgG w surowicy

• Wcześniej zostały one zaabsorbowane na wzorcowych krwinkach – o znanych antygenach grupowych

• Po dodaniu przeciwciał anty-IgG aglutynajca

• Służy do oznaczania antygenów na badanych erytrocytach za pomocą surowic diagnostycznych, które zawierają niekompletne przeciwciała

• Wykonywany podczas:

• Dobierania krwi do przetoczeń (ujemny wynik próby krzyżowej – warunek konieczny dla transfuzji) – modyfikacja LISS

• Poszukiwania p-ciał IgG u biorców i dawców krwi

• Wykrywania p-ciał u kobiet z podejrzeniem konfliktu

• Określania tzw. słabego antygenu D