TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Metoda ligacji bez użycia ligazy.

Ligase Independent Cloning (LIC)

• szybki, prosty sposób

• wykorzystuje aktywność polimerazy DNA T4 w celu tworzenia 10-15 zasad w pojedynczej nici w wektorze ekspresji

• produkty PCR tworzone są przez budowanie odpowiednich rozszerzeń do starterów i ogrzanie z polimerazą DNA T4

• całość prowadzi się w nieobecności ligazy przez proste mieszanie z fragmentami DNA

• proces może tworzyć tylko pożądane produkty

ETAPY POKRÓTCE:

1. Przygotowanie wektora DNA

- usuwanie genu eGFP i dodanie polimerazy DNA T4 w obecności dTTP

1. Linearyzacja LIC wektora przez trawienie BsaI

- dodać enzym restrykcyjny

- odwirować przez 60 sek. przy 13000 rpm

- inkubować przez 60 minut w temperaturze 50^{ͦ C}

- przygotować żel do elektroforezy

- dodać 10 ul 6X barwnika Loading i odwirować przez 60 sek. przy 13000 rpm

- nanieść próbki na żel i pozostawić na godzinę przy napięciu 100V

- po przeprowadzonej elektroforezie wyciąć pasmo liniowe wektora Lic

- oczyścić przy pomocy QIAquick Gel Extraction.

- strawione DNA wymyć 50 μl buforu do elucji w 1,5 ml próbówce

1. Potraktowanie linearyzowanego wektora LIC polimerazą DNA T4

- dodać polimerazy

- odwirować przez 1 min przy 13000 rpm

- mieszaninę reakcyjną inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej

- inkubować przez 20 minut w temperaturze 75 ° C w celu inaktywacji polimerazy.

- odwirować przez 1 min przy 13000 rpm

1. Reakcja PCR

- przygotować żel

- dodać 10 ul 6X barwnika Loading i odwirować przez 60 sek. przy 13000 rpm

- nanieść próbki na żel i pozostawić na godzinę przy napięciu 100V

- proces PCR

- po przeprowadzonej PCR wyciąć pasmo produktu

- oczyścić przy pomocy QIAquick Gel Extraction

- eluować DNA w 30 ml buforu do elucji w 1,5 ml probówce

1. Potraktowanie DNA produktem PCR

- dodać polimerazy

- odwirować przez 1 min przy 13000 rpm

- mieszaninę reakcyjną inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej

- inkubować przez 20 minut w temperaturze 75 ° C w celu inaktywacji polimerazy

- odwirować przez 1 min wirowanie przy 13000 rpm

1. Dołączenie insertu i wektora LIC

- 0,02 pmol DNA

- 25 - 50 ng LIC przygotowanej z wektora DNA

- ligacja kontrolna przeprowadzana z wodą

- inkubować wyżarzanie mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej

- dodać 1 µl (25 mM) EDTA

- wymieszać delikatnie mieszając roztwór

- inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej

1. Transformacja produktu do E. coli DH5α

- rozmrozić odpowiednią ilość komórek

- przenieść 1 µl mieszaniny wyżarzania do 1,5 ml probówki i inkubować w lodzie

przez co najmniej 5 minut.

- dodać 50 µl porcje właściwych komórek.

- inkubować probówki przez 30 minut na lodzie.

- pogrzać 45 sekund w 42 ° C.

- probówki bezpośrednio umieścić na lodzie i inkubować przez co najmniej 2 minuty.

- dodać 200 µl pożywki SOC do każdej probówki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 ° C

- wirować przez 1 min przy 5000 rpm

- usuń 150 µl supernatantu i zawiesić komórki w pozostałych medium

- zawiesine komórek wysiać na płytce z agarem LB zawierającym 50 mg / ml kanamycyny

- płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 37 ° C.

LINK: www.helmholtz-muenchen.de/.../LIC-cloning.pdf

http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/PEPF/Protocols/LIC-cloning.pdf

PUBLIKACJA: Ligase Independent Cloning (LIC) [PDF]

Przesłana w załączniku.