Transkryptomika – nauka zajmująca się badaniem aktywności genów w danej tkance.

Transkryptom – ogół transkryptonów (cząsteczek mRNA) powstających w danym typie komórki.

Do transkryptomika:

-pozwala określić jakie transkrypty ulegają ekspresji w danej tkance

-pozwala określić poziom tran skryptów badanych genów w zależności od: wieku, stanu zdrowia, tkanki,

Podział technik badania transkryptomu:

a)techniki służące analizie ekspresji niewielkiej liczby genów równocześnie: RT-PCR; PCR w czasie rzeczywistym (Real-time PCR); Hybrydyzacja typu northern

b)techniki wysokoprzepustowe – służące analizie ekspresji wieku genów równocześnie: sekwencjonowanie RNA; mikromacierze ekspresyjne; sekwencjonowanie cDNA.

Izolacja RNA:

-najczęściej stosowana jest metoda izolacji całkowitego RNA wg. protokołu opracowanego przez Chomoczyńskiego i Sacchi 1987r.

-piotr chomczyński – polski biochemik, przed wyjazdem do USA pracował m.in. na SGGW i w Instytucie Zootechniki PAN w Jastrzębsu

-publikacje opisują metodę izolacji RNA opracowaną przez w/w autorów jest jedną z najczęściej cytowanych prac w dziedzinie biologii i biochemii

-metoda ta bazuje na wykorzystaniu ekstrakcji RNA powstających w danym typie komórek.

RNA jest podatne na degradację:

-Praca RNA wymaga zahamowaniu działania rybonukleaz poprzez stosowanie plastików i odczynników wolnych od rybonukleaz, np. wody z dodatkiem dietyloprowęglanu (DEPC)

Ocena jakości preparatu RNA:

-rozdział elektroforetyczny

-ocena spektrofotometryczna – analiza widma absorpcji światła w zakresie 200-350 nm

oraz współczynnika A₂₆₀/A₂₈₀.

Odwrotna transkrypcja:

-po przeprowadzeniu kontroli jakościowej i ilościowej preparatu RNA przystępuje się do odwrotnej transkrypcji

-odwrotna transkrypcja – wykorzystuje właściwości polimerazy DNA zależnej od RNA prowadząc do syntezy cDNA na matrycy RNA

-powstający cDNA ,a długość w zakresie 200-5000 nt.

-odwrotne transkryptazy są enzymami pozyskiwanymi z retrowirusów

-umożliwiają przepisanie informacji genetycznej zawartej w RNA retrowirusów na DNA, który następnie podlega integracji z genomem gospodarza i jest replikowany razem z nim.

-najpowszechniej używane to AMV, M-MLV, oraz HIV-1

-niektóre odwrotne transkryptazy posiadają aktywność RNAzy H – powodując degradację RNA podczas syntezy cDNA.

*cDNA

-cDNA jest to cząsteczka DNA (jedno lub dwuniciowa) powstała na matrycy mRNA

-cDNA nie zawiera intronów, usuniętych w procesie potranskrypcyjnej obróbki mRNA.

Składniki reakcji RT:

-mRNA- matryca

-Enzym odwrotna transkryptaza

-dNTP

-bufor dla odwrotnej transkryptazy

-jednoniciowe oligonukleotydy – niezbędne dla odwrotnej transkryptazy do rozpoczęcia syntezy cDNA- startery specyficzne dla badanego genu lub tzw. heksamerazy o losowej sekwencji i/lub oligo dT15 lub dT20 które są komplementarne do sekwencji ogona poliA

-inhibitor RNAz

-woda wolna od RNAz

Kontrola wydajności odwrotnej transkrypcji:

-pomiar spektrofotometryczny w celu określenia koncentracji uzyskanego cDNA

-reakcja PCR z wykorzystaniem starterów specyficznych zarówno dla cDNA jak i genomowego DNA (gDNA), ocena długości powstałych produktów PCR pozawala wykryć obecność cDNA i zanieczyszczenie genomowym DNA

-ewentualne zanieczyszczenie preparatu RNA genomowym DAN można usunąć enzymem DNAzą i (przed RT).

Biblioteka cDNA i bazy EST:

-biblioteki cDNA uzyskuje się poprzez wklonowanie cDNA uzyskanego z danego typu komórek do wektorów

-sekwencjonowanie każdego klonu pozwala zidentyfikować geny podlegające ekspresji – obraz danego transkryptomu

-uzyskanie sekwencji przeważnie o dł. 300-500 nt. są deponowane w bazach danych o sekwencjach nukleotydowych jako tzw. EST.

Półilościowy RT-PCR:

-matrycą jest cDNA

-przeprowadza się reakcję PCR z zastosowaniem pary starterów specyficznych dla badanego genu

-startery do reakcji RT-PCR powinny być zakotwiczone w różnych eksonach lub na granicy ekson/eskon.

-reakcja PCR zatrzymuje się w fazie wykładniczego przyrostu produktu PCR, np. po 25 cyklu PCR.

-kolejnym etapem jest rozdział elektroforetyczny i pomiar intensywności świecenia prążków w świetle UV pod wpływem bromku etydyny – im więcej kopi produktu PCR tym jaśniejszy prążek.

*Geny referencyjne:

-aby wynik był wiarygodny potrzebna jest normalizacja – uwzględnienie poziomu ekspresji tzw. genu referencyjnego

-normalizacja pozwala zniwelować różnice między próbkami powstałe w wyniku np. różnej ilości pobranego materiału do izolacji RNA, różnej wydajności izolacji RNA i syntezy cDNA, błędów pipetowania, degradacji RNA.

-jako geny referencyjne stosuje się geny podlegające stałej ekspresji we wszystkich typach komórek, niezależnie od stanu fizjologicznego tzw. house-keeping genes

-obecnie zalecane jest używanie co najmniej 2 różnych genów referencyjnych do jednej analizy.

-przykłady genów referencyjnych: 18s rRNA; GAPDH; TBP; TOP2B; ACTB; TBB; HPRT1; PPIA.

PCR w czasie rzeczywistym :

-matrycą jest cDNA

-monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie rzeczywistym podczas reakcji PCR dzięki zastosowaniu fluorescencyjnych znaczników

-pozwala dokładniej niż RT-PCR określić wyjściową liczbę cząsteczek matrycy (poziom mRNA)

-poziom fluorescencji wzrasta proporcjonalnie do przyrostu ilości produktu PCR w kolejnych cyklach PCR

-przebiega w termocyklach pozwalających na pomiar fluorescencji podczas trwania reakcji PCR

-Po każdym cyklu PCR zbierane są dane na podstawie których konstruowany jest wykres zależności wielkości sygnału fluorescencji do liczby cykli

-Cp- cykl PCR – przez który wartość fluorescencji przekroczy wartość linii progowej.

-im większa początkowa liczba matryc tym niższa jest wartość Cp.

-analizy w kapilarach bądź na płytkach

System detekcji sygnału:

A)detekcja nie swoista – z zastosowaniem fluorescencyjnych barwników interkalujących niespecyficznie w strukturę dwuniciowego DNA, co powoduje 1000-krtony wzrost fluorescencji.

Zalety: niski koszt, łatwa optymalizacja

Wady: możliwość błędnego wyniku w przypadku niespecyficznych produktów reakcji PC.R

B)detekcja swoista – z zastosowaniem sond fluorescencyjnych wiążących się jedynie do specyficznych produktów PCR pomiędzy miejscami wiązania startery F i R.

Zalety: wysoka specyficzność

Wady: wysokie koszty, konieczność stosowania oddzielnej sondy dla każdego z amplifikowanych fragmentów DNA.

Systemy detekcji sygnału:

-detekcja swoista – system TaqMan

-przyłączenie sondy 20-40 nt. i starterów wydłużanie starterów, brak fluorescencji

-degradacja sondy przez polimerazę Taq posiadająca aktywność 5’3’

Technika hybrydyzacji typu northern:

-technika ta jest wykorzystywana określenia miejsca lub czasu ekspresji wybranego genu i pozwala na określenie przybliżonego poziomu ekspresji poprzez porównywanie intensywności sygnału między próbami uwzględniając siłę sygnału genu referencyjnego

-pozwala na wykrycie alternatywne transkrypty.

Etapy northen:

1.Rozdział elektroforetyczny mieszaniny transkryptów, stanowiących zbiór wszystkich mRNA podlegających ekspresji w danej komórce w żelu agarozowym w warunkach denaturujących (usunięcie struktur drugorzędowych).

2.Przneiesienie RNA na nylonową membranę (transfer kapilarny) i związanie RNA z membraną (naświetlenie UV lub ogrzewanie).

3.Hybrydyzacja RNA związanego na membranie ze znakowaną radioaktywnie sonda molekularną zawierającą jedynie sekwencję kodującą badanego genu w układzie antysenoswym

4.Usinięcie niezwiązanej sondy poprzez wielokrotne odpłukiwanie.

5.Uwidoczneinei sygnału poprzez autoradiografię.

Technika western:

-technika hybrydyzacji typu western pozwala przeprowadzić analizę ekspresji na poziomie białka

-umożliwia detekcję i ocenę poziomu ekspresji wybranego białka obecnego w mieszaninie białek występujących w danym typie komórki

Etapy:

1.Rozdiał elektroforetyczny białek na podstawie ciężaru cząsteczkowego w żelu poliakryloamodowym w obecności SDS w warunkach denaturujących

2.Transfer na membranę celulozową lub nylonową (elektrotransfer, transfer dyfuzyjny lub próżniowy)

3.Inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi: monoklonami lub polikolonami

4.detekcja specyficznego białka – inkubacja z przeciwciałami drugorzędowymi, specyficzne dla danego przeciwciała pierwszorzędowego, posiadającego wyznacznik radioaktywny lub skoniugowany.. enzym katalizujący reakcję barwną np. alkaliczną AP lub peroksydzę chrzanową HRP

Zastosowanie mikormacierzy:

-zmian w poziomie eksperci genów