Epigenetyka – po raz pierwszy w 1942 roku – użyty do opisu mechanizmu oddziaływania genów z ich środowiskiem, które objawiają się określonym fenotypem.

Epigenetyka – zajmuje się dziedzicznymi modyfikacjami informacji genetycznej, które nie są skutkiem zmian w sekwencji DNA.

Różnorodne epigenomy formują się w trakcie procesów różnicowania i rozwoju.

Epigenetyczne fenotypy: bliźnięta, nowotwory, ciałko Barra, sklonowany kot.

Organizacja genomów:

-zwiększająca się wielkość genomu w organizmach wielokomórkowych koreluje z ekspansją sekwencji niekodujących i powtarzalnych DNA

-ekspansja genomu pociąga za sobą zwiększenie wielkości i złożoności jednostek transkrypcyjnych

-towarzyszy temu zwiększająca się liczba mechanizmów epigenetycznych regulujących genom

Materiał genetyczny organizmów eukariotycznych pozostaje w wysoce uporządkowanej strukturze.

Struktura chromatyny jest bardzo istotnym elementem procesów regulacji ekspresji genów.

Mechanizmy związane z epigenetycznyą regulacją ekspresji genów:

-metylacja DNA

-remodelowanie chromatyny

-modyfikacja histonów

-aktywności ncRNA

-architektura jądra interfazowego.

Metylacja DNA:

-przyłączenie grupy metylowej do cytozyny (enzym: metylofransferaza DNA)

-zmiana cytozyny w 5-metylocytozynę wprowadza bardzo istotną modyfikację w oddziaływaniach DNA-białko i wpływa na zmianę struktury chromatyny

-metylacja pełni ważną funkcję w regulacji ekspresji genów – hamowanie transkrypcji

-prawie cały DNA jest zmetylowany, poza wyspami CpG występującymi w promotorach genów aktywnych transkrypcyjnie.

Metylacja DNA zachodzi przy udziale trzech enzymów – metylotransferaz (DNMT):

-DNMT1 – katalizuje 99% procesu metylacji zachodzącego podczas mitozy. Enzym ten jest odpowiedzialny za przekazanie stałego profilu metylacji. Rozpoznanie hemimetylowane di nukleotydy CpGna matczynej i potomnej nici DNA i przenosi grupy metylowe z AdoMet do cytozyny zlokalizowanej na nie zmetylowanej nici potomnej

-DNMT3a i DNMT3b – Enzymy te są odpowiedzialne za metylację de Novo. Są szczególnie ważne w rozwoju embrionalnym, kiedy to ustala się wzór metylacji. Ich rola w dojrzałych komórkach jest nie do końca wyjaśniona. Podejrzewa się że DNMT3B podtrzymuje metlyację pericentrycznej heterochromatyny.

Metylacja DNA de Novo i zachowanie wzoru metylacji w trakcie podziałów.

Metylacja DNA jest główną epigenetyczną modyfikacją u wyższych eukariotów:

-grupa metylowa dodawana jest do cytozyny w obrębie di nukleotydu CG (CpG)

-metylacja na odcinkach CpG zachodzi symetrycznie na obu niciach, tylko niewielka liczba sekwencji CpG jest etylowana asymetrycznie

- U ssaków 60-90% CpG jest zmetylowanych

-wyjątkiem są wyspy CpG – krótkie odcinki DNA niezwykle bogate w di nukleotydy CpG, położone w regionach promotorowych genów

-około połowa wszystkich ludzkich genów zawiera wyspy CpG: są to tzw. geny housekeeping i geny specyficzne tkankowe (ok. 40% wszystkich tkankowych genów).

Zmiany w poziomie metylacji w trakcie rozwoju embrionalnego.

Metody badania metylacji DNA:

A)Metylacja globalna genomu (ogólna):

-chromatografia, kolorymetria

-mikromacierze do badania profilu metylacji

-WGBS/RRBS

B)Metylacja wybranych genów (specyficznych):

-REP – restriction enzyme PCR – zastosowanie metylowrażliwych enzymów, które przecinają DNA niezmetylowane. Nast. PCR – obecność amplikonu świadczy o nietrawieniu DNA czyli jego metylacji.

Np. Hpall – rozpoznawany motyw CCGG – przecina niezmetylowane DNA

Mspl – rozpoznawany motyw CCGG – przecina niezależnie od metylacji DNA

Metody oparte o reakcje z wodorosiarczanem sodowym: MS-PCR – metylospecyficzne PCR; BSP – sekwencjonowanie po działaniu wodorosiarczanem i reakcji PCR.

-Wodorosiarczan sodowy powoduje deaminację cytozyny (konwersja do uracylu) – zmetylowana cytozyna nie podlega konwersji

-DNA po działaniu wodorosiarczanem sodowym służy jako matryca w reakcji PCR; reszty tyminy i uracylu zostają amplifikowane jako tymina, a tylko 5mC jako cytozyna.

Mikromacierze do badania wybranych regionów genomu:

1.Konwersja DNA wodorosiarczanem sodu

2.Reakcja PCR – niezmetylowane C jest przekonwertowane do U, a etylowana C pozostaje niezmieniona

3.Produkty PCR hybrydyzują do mimkromacierzy zawierającej sondy oligonukleotydowe specyficzne do etylowanych CG jak i niezmetylowanych TG wariantów każdego CpG wielu loci

4.Względny poziom w każdym locus jest szacowany na podstawie stosunku pomiędzy sygnałami z CG i TG dla każdego di nukleotydu CpG. Poziom metylacji jest odnoszony względem referencyjnego DNA o znanym poziomie metylacji. Kolor czerwony – zwiększona Metylacja; zielony – zmniejszona Metylacja.

Badanie globalnej metylacji z wykorzystaniem przeciwciał do 5mC:

-fragmentacja DNA poprzez sonikację

-inkubacja z przeciwciałem rozpoznającym metylowaną cytozynę

-znakowanie referencyjnego Cy5 – czerwony i badanego Cy3 – zielony DNA różnymi fluorochromami i hybrydyzacja do mikromacierze

-analiza metylacja pojedynczego genu reakcją PCR.

Metylacja DNA a aktywność transkrypcyjna:

A)Mechanizm bezpośredni: gdy obecność grupy metylowej hamuje wiązanie się czynników transkrypcyjnych w docelowych miejscach regulatorowych etylowanego promotora genu

b)Mechanizm pośredni: gdy białka zawierające domenę MBD skutkują zmiana struktury chromatyny czyniąc ją niedostępną dla czynników transkrypcyjnych

Rola metylacji DNA:

-metylacja DNA hamuje ekspresję genów, uczestniczy w inaktywacji chromosomu X u samic i bierze udział w piętnowaniu genomu;

Rodzina białek wiążących się ze zmetylowanym DNA – zawierają tę samą domenę MBD.

Mutacje w ludzkim genie MECP2 wywołują ciężkie choroby neurologiczne.

Np. Zespół Retta – zaburzenia neurologiczne, sprzężona z płcią, mutacje de Novo; mutacje w tym genie prowadzą do nadmiernej ekspresji niektórych genów; zaburza system nerwowy; największa ekspresja tego genu w mózgu.

Choroby wieloczynnikowe – poszukiwanie podłoża epigenetycznego: cukrzyca, schizofrenia, choroby autoimmunologiczne; nowotwory.

Metylacja DNA a nowotworzeni:

-hipometylacja - nadekspresja onkogenów

-hipermetylacja – inaktywacja genów supresorowych

-deaminacja – tranzycja C>T – mutacja

-wzrost częstości mutacji wywołanych UV

-wzrost częstości wiązania chemicznych karcenogenów

Modyfikacje epigenetyczne są w większości procesem odwracalnym co daje możliwość poszukiwania nowych form terapii nowotworów i innych chorób:

-wiele związków zmieniających profil metylacji czy hamujących działanie deacetylacji histonowej jest testowany klinicznie

-5-azacytydyna – inhibitor metlyacji został zaakceptowany w USA jako lek w zespole mielodysplastycznym

-jato to jednak zw. toksyczny (inkorporuje w DNA).

Czy czynniki środowiskowe mogą wywołać zmiany epigenetyczne o trwałym efekcie:

-dieta dorosłej samicy myszy może wpływać na zmianę poziomu metylacji u potomstwa

-potomstwo szczura, które uzyskiwało różną matczyną opiekę maiło inny profil metylacji w promotorze genu kodującego receptor GR.

Np. samice które dostały substancje z donory grup etylowych miały młode kolory brązowego a te bez miały młode z sierścią koloru żółtego.

Nutrigenomika – dziedzina nauki zajmująca się uwarunkowanymi genetycznie różnicami w reakcji organizmu na składniki pokarmowe.

Modyfikacje histonów:

-przyłączanie różnych cząsteczek lub grup funkcyjnych do aminokwasów

-procesy: acetylacja, metylacja, fosforylacja, ubikwitynacja, koniugacja z cząsteczkami SUMO

-główny, efektem modyfikacji są zmiany struktury i konformacji chromatyny

-wpływ modyfikacji na stopień kondensacji chromatyny i ekspresję genów zależy także od miejsca wystąpienia modyfikacji.