Nr grupy:	Imiona i nazwiska studentów:	Nazwisko prowadzącego: Dr Barbara Mickowska
Data wykonania ćwiczenia: 19.10.2012	Tytuł ćwiczenia: Spektrofotometryczne metody analizy substancji.	Data oddania sprawozdania: 22.11.2012

1. Wstęp teoretyczny:

Absorpcja (pochłanianie) promieniowania elektromagnetycznego polega na zmniejszaniu natężenia promieniowania przechodzącego przez daną substancję. Absorpcja ma najczęściej charakter selektywny, czyli zależy od długości fali światła przechodzącego przez daną substancję – stąd widma absorpcji są charakterystyczne dla danych substancji.

Długość fali światła widzialnego zawiera się w przedziale 400-800 nm. Fale krótsze, leżące w obszarze nadfioletu dzieli się na nadfiolet daleki (10-200 nm) oraz nadfiolet bliski (200-400 nm). Pasma absorpcyjne obserwuje się w nadfiolecie bliskim oraz świetle widzialnym (substancje absorbujące promieniowanie z zakresu widzialnego widzimy jako barwne). Ugrupowania atomów z wielokrotnymi wiązaniami, stwarzającymi możliwość absorbowania światła nazywane są chromoforami. Do typowych chromoforów należą np.: grupa ketonowa, etylenowa, nitrowa, azowa, nitrozowa oraz grupy aromatyczne.

Ilościowy opis absorpcji energii przez substancje ujęty został w postaci matematycznej w prawach Lamberta oraz Beera.

Prawo Lamberta – absorpcja promieniowania monochromatycznego przez jednorodny układ absorbujący jest proporcjonalna do grubości warstwy absorbującej, przy czym względne zmniejszenie natężenia światła przechodzącego (I) przez układ jest niezależne od natężenia światła padającego (I₀).

Prawo Beera stwierdza, że absorbancja jest proporcjonalna do stężenia substancji absorbującej

Prawa te opisuje równanie:

gdzie: ε - molowy współczynnik absorpcji [wielkość charakterystyczna dla danej substancji przy danej długości fali, wyrażana w dm³/mol cm], c – stężenie molowe [mol/dm³], l – droga optyczna [cm].

Przy zachowaniu stałej grubości warstwy absorbującej zależność absorbancji od stężenia ma charakter liniowy, jednak w przy wyższych stężeniach występuje odchylenie od prostoliniowości (dodatnie lub ujemne), spowodowane przemianami chemicznymi zachodzącymi w badanym roztworze.

W układzie zawierającym kilka składników absorbujących, absorbancja układu równa jest sumie absorbancji poszczególnych składników przy danej długości fali:

Podstawowymi elementami aparatury spektrofotometrycznej UV/Vis są: lampa emitująca promieniowanie (wodorowa, deuterowa, wolframowa, ksenonowa, rtęciowa); monochromator (siatka dyfrakcyjna, pryzmat); detektor (fotopowielacz, fotokomórka).

1. Cel ćwiczenia:

Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia jednego składnika.

Ćwiczenie polega na porównaniu natężenia wiązki promieniowania przechodzącego przez badaną próbkę oraz próbkę odniesienia. Zależność między wynikiem pomiaru a zawartością oznaczanego składnika ustala się za pomocą próbek wzorcowych. Znając stężenie próbek wzorcowych i ich absorbancje należy utworzyć krzywą kalibracyjną, która pozwoli na obliczenie stężenie badanej próbki.

1. Przebieg ćwiczenia:

• odczynniki: wzorcowy roztwór białka (albumina surowicy wołowej), roztwór 1M NaOH, roztwór węglan-winian-CuSO_4, odczynnik Folina-Ciocalteu.

• aparatura: spektrofotometr

• wzorce o stężeniach od 0,2mg/ml do 1mg/ml

Przygotowano serię wzorcowych roztworów białka oraz badaną próbkę (3 powtórzenia). Następnie do 0,1ml wszystkich próbek dodano 0,1 ml roztworu 1M NaOH, 1 ml roztworu węglan-winian-CuSO₄ i wymieszano. Po 15 minutach dodano 0.1 ml odczynnika Folina-Ciocalteu i wstrząśnięto. Po 30 minutach zmierzono absorbancję wszystkich próbek względem próby odczynnikowej przy λ=500 nm.

W doświadczeniu zachodzą reakcje biuretowa oraz Folina-Ciocalteu, w wyniku czego powstają produkty mające niebieską barwę. Wiązania peptydowe w białkach reagują z jonami miedzi, natomiast kwas fosfowolframowy i fosfomolibdenowy zawarte w odczynniki Folin-Ciacalteu redukują się do tlenków przez oksydację aminokwasów o charakterze aromatycznym.

1. Dane pomiarowe:

Tabela 1. Stężenia i absorbancje próbek wzorcowych.

Stężenie [mg/ml]	Absorbancja
0	0
0,2	0,1572
0,4	0,2910
0,6	0,3721
0,8	0,4759
1	0,5816

Absorbancja badanej próbki:

y₁=0,3691

y₂=0,3761

y₃=0,3713

y_śr = 0,3722

1. Opracowanie wyników:

Wykres numer 1. Krzywa kalibracyjna

y=0,6061x

x=$\frac{y_{sr}}{0,6061}$

Stężenie badanej próbki:

C=$\frac{0,3722}{0,6061}$ = 0,614 [mg/ml]

Błąd względny = $\frac{0,614 - 0,6}{0,6}$ *100% = 2,33%

1. Wnioski.

Uzyskane w doświadczeniu stężenie badanej próbki wynosi 0,614 mg/ml. Stężenie badanej próbki wynosiło 0,600 mg/ml. Błąd względny pomiaru wynosi 2,33%. Uzyskany w doświadczeniu wynik jest nieco wyższy, co może wynikać z nieprecyzyjnego sporządzenia próbek wzorcowych i właściwych lub niedokładnym wymieszaniem badanych roztworów.