Sprawozdanie 1.

Kierunek/specjalność/: BIB Nr grupy: 1	Imię i nazwisko:	Nazwisko prowadzącego: Dr Barbara Mickowska
Data wykonania ćwiczenia: 04.03.2015r.	Tytuł ćwiczenia: Spektrofotometryczna analiza ilościowa	Data oddania sprawozdania: 11.03.2015r.

1. Wstęp teoretyczny.

Spektrofotometria to dział analizy instrumentalnej, pozwalający na oznaczenie stężenia określonego składnika w roztworze, dzięki wykorzystaniu zdolności tego składnika do absorpcji (pochłaniania) promieniowania elektromagnetycznego. Absorpcja ma charakter selektywny, czyli każda substancja inaczej absorbuje światło. Stąd można wysnuć wniosek, iż poziom absorpcji jest charakterystyczny dla każdej substancji. Związek, który ma zdolność do pochłaniania światła (w zakresie 180-800 nm) nazywamy chromoforem. Posiada on ugrupowanie atomów z wielokrotnymi wiązaniami π (grupę karbonylowa, tiolowa, alkenowa, azowa, nitrowa, nitrozowa, fenylowe); bądź są to związki aromatyczne, heterocykliczne z pierścieniami skondensowanymi, lub też jony metali przejściowych o niezapełnionych powłokach elektronowych. Chromofory mają swoje maximum i minimum absorpcji.

Pochłanianie światła przez substancje jest zależne od następujących praw:

.

• Prawo Beera – mówiące, iż natężenie światła monochromatycznego, przechodzącego przez jednorodny układ absorbujący, jest proporcjonalny do stężenia substancji absorbującej:

• Prawo Lamberta – mówiące, iż natężenie światła monochromatycznego, przechodzącego przez jednorodny układ absorbujący, jest zależne od grubości warstwy absorbującej.

• Prawo addytywności absorpcji mówiące, iż w układzie wieloskładnikowych, absorpcja jest równa sumie absorbancji poszczególnych składników przy określonej fali.

Aby oznaczyć stężenie określonego składnika, należy przeprowadzić pomiar przy długości fali odpowiadającej maximum absorpcji tego składnika. Pomiary stężenia składnika polegają na sporządzeniu próbek wzorcowych, odpowiadających składowi chemicznemu badanej próbki, dokonaniu pomiaru absorbancji poprzez przepuszczenie wiązki światła przez próbki wzorcowe i badane próbki, sporządzeniu wykresu zależności absorbancji od stężenia próbek wzorcowych. Wykres ten pozwala porównać poziom absorbancji próbek wzorcowych z badaną próbką, dzięki czemu można oszacować stężenie substancji w badanej próbce.

1. Cel ćwiczenia
   

Wyznaczanie stężenia białka metodą Lowry’ego

1. Przebieg ćwiczenia.

Ćwiczenie zostało przeprowadzone zgodnie z instrukcja.

1. Dane pomiarowe.

Absorbancja roztworu białka o nieznanym stężeniu:

x₁-0,2008;

x₂-0,1958;

x₃-0,1599

Steżenie białka [mg/ml]	Absorbancja
0	0
0,25	0,1198
0,50	0,2031
0,75	0,3271
1	0,4266

Tabela 1. Absorbancja próbek wzorcowych.

Wykres 1. Krzywa wzorcowa.

1. Opracowanie wyników.

Obliczenie składu roztworów wzorcowych:

Do sporządzenia próbek wzorcowych użyto roztworu białka o stężeniu 10 mg/ml

500µl – 100% x – 0% x = 0
500µl – 100% x – 25% x = 125µl 125µl / 10 =12,5µl 500µl – 100% x – 50% x = 250µl 250µl / 10 = 25µl 500µl – 100% x – 75% x = 375µl 375µl / 10 =37,5µl 500µl – 100% x – 100% x = 500µl 500µl / 10 = 50µl
Stężenie białka [mg/ml]	Ilość białka [µl]	Ilość wody [µl]
0	0	500
0,25	12,5	487,5
0,50	25	475
0,75	37,5	462,5
1	50	450

Tabela 2. Skład roztworów wzorcowych.

Obliczenie stężenia roztworu białka:

(0,2008+0,1958)/2 = 0,1983

y = 0,4242x + 0,0032

0,1983 = 0,4242x + 0,0032

0,1951 = 0,4242x / 0,4242

x= 0,4599

Błąd względny:

δ₀ = $\frac{x - x_{0}}{x_{0}}$

x₀ – wartość prawdziwa

x – wartość zmierzona

Obliczenia:

x₀= 0,45

x=0,4599

δ₀ =(0,4599 – 0,45) / 0,45 = 0,022

1. Podsumowanie/wnioski.

Próbka x₃ nie została wzięta pod uwagę w obliczeniach ze względu na dużą różnicę absorbancji względem dwóch pozostałych próbek. Stężenie badanego roztworu wyznaczonego podczas badań wynosiło 0,4599 mg/ml, natomiast rzeczywiste stężenie tego roztworu wynosiło 0,4500 mg/ml. Wynik możemy uznać za bardzo dobry, ponieważ błąd względny wynosi jedynie 0,022.